FISH技術(shù)在血液腫瘤中的應(yīng)用.ppt

上海市第一人民醫(yī)院 Shanghai First Peoples Hospital,上海市第一人民醫(yī)院 Shanghai First Peoples Hospital,上海市第一人民醫(yī)院 血液科 Shanghai First Peoples Hospital,熒光原位雜交（FISH） 在血液腫瘤中的應(yīng)用,FISH的定義,熒光原位雜交（FISH）是20世紀(jì)八十年代在細(xì)胞遺傳學(xué)、分子遺傳學(xué)和免疫學(xué)相結(jié)合的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的新技術(shù)。它利用已知核酸序列作為探針，以熒光素直接標(biāo)記或先以生物素或地高辛等半抗原標(biāo)記后與靶DNA進(jìn)行雜交，再通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)過(guò)程連接上熒光素標(biāo)記物，最后在熒光顯微鏡下觀察雜交信號(hào)，從而對(duì)標(biāo)本中待測(cè)核酸進(jìn)行定性、定位和定量分析。,FISH技術(shù)原理,FISH技術(shù)原理,FISH技術(shù)原理,FISH技術(shù)原理,FISH技術(shù)原理,FISH技術(shù)原理,FISH技術(shù)原理,FISH的種類,間期FISH（Interphase FISH） 染色體涂染分析（Chromosome painting） 多色FISH（Multicolor-FISH） 反向涂染（Reverse painting） 比較基因組雜交（Comparative genomic hybridization）,FISH探針的種類和用途,著絲粒探針 用于檢測(cè)染色體數(shù)目異常如三體、單體等。 亞端粒探針 靠近端粒的200-300Kb為染色體特異性DNA，用于檢測(cè) 涉及端粒的隱匿性易位。 染色體臂或整條染色體涂染探針（WCP） 用于檢測(cè)染色體易位和標(biāo)記染色體。 序列特異性探針 包括臂、帶和基因探針等多種，用于檢測(cè)基因缺失和重排。,血液腫瘤FISH檢測(cè)常見探針類型,雙色雙融合探針（DC，DF）,額外信號(hào)探針（ES）,分離探針（BRK）,FISH在血液腫瘤中的應(yīng)用,檢測(cè)樣本可以是血液、骨髓、石蠟切片 診斷和鑒別診斷 治療和預(yù)后分層 監(jiān)測(cè)療效（微小殘留病灶檢測(cè)） 識(shí)別移植后骨髓細(xì)胞來(lái)源,一、診斷和鑒別診斷,核型分析缺點(diǎn)： 有絲分裂象少或缺如 染色體質(zhì)量低劣，顯帶不佳 染色體異常復(fù)雜 分子生物學(xué)檢測(cè)不足： 常見的轉(zhuǎn)錄序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度一般在100 700bp之間 mRNA剪切方式比較特殊，假陰性結(jié)果，易造成漏診或誤診,一、診斷和鑒別診斷,FISH技術(shù)能彌補(bǔ)以上2種技術(shù)的不足之處 間期細(xì)胞上分析（無(wú)需中期分裂象），極大地提高了敏感性、準(zhǔn)確性和可靠性。 對(duì)核型提示的染色體異常做進(jìn)一步鑒定，從“正常核型” 中篩查隱匿的染色體畸變，成為精確的染色體分析不可缺少的手段。 FISH探針的片段相對(duì)較長(zhǎng)，?？蛇_(dá)數(shù)百kb，甚至大于1Mb，跨越融合基因每一側(cè)多個(gè)外顯子區(qū)域，只要發(fā)生在這些區(qū)域的缺失或易位都能被檢測(cè)到，極少發(fā)生漏檢，假陰性率很低。,舉例 男性46歲患者，2003.2.24內(nèi)科急診發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞增高（25109/L） 。 骨髓顯示粒系極度增生，紅系、巨核系以及血小板增生尚可，NAP積分49分，核型分析結(jié)果為46,XY20。 隨訪3年，其白細(xì)胞始終維持在20-30109水平。,一、診斷,2006.5.4發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞增高至170109，血小板511109，血紅蛋白118g/dL。 骨髓象顯示早幼粒細(xì)胞占6%，中幼粒細(xì)胞占13%，核型分析未見分裂象。 BCR-ABL 210基因陰性，經(jīng)單融合FISH探針證實(shí)骨髓59%細(xì)胞BCR-ABL融合基因陽(yáng)性。 接受格列衛(wèi)治療，2006.9.7復(fù)查，F(xiàn)ISH陽(yáng)性細(xì)胞比例降低至7.4%，2006.10.23以后的復(fù)查結(jié)果FISH都為陰性。,一、診斷,其他常用于診斷的探針還有：PML/RARA，AML1/ETO，CBF，TEL/AML1等。 以CBF探針為例： 發(fā)生16號(hào)染色體倒位的細(xì)胞其熒光信號(hào)由2F變成1F/1R/1G。 有研究表明CBF探針對(duì)inv(16)導(dǎo)致的CBF-MYH11融合基因的檢出率與分子生物學(xué)的方法相當(dāng)。,一、診斷,一、診斷急性淋巴細(xì)胞白血病,急性淋巴細(xì)胞白血病,一、診斷淋巴瘤,鑒別診斷，以BCR/ABL探針為例： 額外信號(hào)的BCR/ABL探針（ES） 根據(jù)熒光信號(hào)的模式不同，可以鑒別MBCR斷裂點(diǎn)（P210）和mBCR斷裂點(diǎn)(P190)。 MBCR斷裂點(diǎn)的細(xì)胞呈現(xiàn)1Y/2R/1G的信號(hào)模式，而mBCR斷裂點(diǎn)的細(xì)胞則是2Y/1R/1G的信號(hào)模式。,一、鑒別診斷,一、鑒別診斷,雙色雙融合信號(hào)探針（DF）雖不能區(qū)分MBCR和mBCR，但能檢測(cè)der（9）的部分序列缺失。 ABL和BCR基因同時(shí)缺失：1R/1G/1Y ABL基因單獨(dú)缺失： 1R/2G/1Y 。 ES探針卻無(wú)法檢測(cè)der（9）的部分序列缺失，其信號(hào)均顯示1R/1G/1Y 。,一、鑒別診斷,IgH-CCND1 男性，54歲患者，左頜下腫塊2月余 白細(xì)胞增高（21.3109/L） 骨髓涂片見到增生活躍，以成熟淋巴細(xì)胞增生為主，考慮慢性淋巴細(xì)胞白血病。 流式分析顯示CD5+CD19+細(xì)胞占86.5%，以CD19+的細(xì)胞群設(shè)門，CD23+細(xì)胞約占16.3%。 FISH檢測(cè)患者外周血，約50%的圓形細(xì)胞顯示融合信號(hào)，提示套細(xì)胞淋巴瘤可能性大。 病理證實(shí)了左頜下淋巴結(jié)非霍奇金套細(xì)胞淋巴瘤。,CLL中的應(yīng)用 CLL的細(xì)胞大多處于間期，有絲分裂活性較低，細(xì)胞往往不分裂，即使分裂的細(xì)胞絕大多也是正常核型，核型分析的異常檢出率很低。 CLL的遺傳學(xué)異常被認(rèn)為與存活期有關(guān)： 正常核型和13q-預(yù)后相近 +12、11q-和17p-的預(yù)后均較差,二、治療和預(yù)后分層,FISH共檢出了23例異常（76.7%）。 完成核型分析的18例中僅2例檢出異常。 正常核型的9例中，F(xiàn)ISH檢出7例異常。 未見分裂象的7例中，F(xiàn)ISH檢出5例異常。 而且這些由FISH檢出的異?？寺”壤径荚?0%以上。,二、治療和預(yù)后分層,MM中的應(yīng)用 MM的骨髓瘤細(xì)胞有絲分裂指數(shù)低，且由于骨髓浸潤(rùn)程度不同，常規(guī)核型分析異常檢出率相對(duì)較低，檢出的異常往往是超二倍體和/或復(fù)雜核型。 MM的遺傳學(xué)異常同樣被認(rèn)為與預(yù)后相關(guān)，13q14的缺失被認(rèn)為是復(fù)發(fā)和預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，1q21擴(kuò)增、p53缺失也都提示預(yù)后不良。,二、治療和預(yù)后分層,二、治療和預(yù)后分層,FISH共檢出了17例異常（56.7%）。 完成核型分析的27例中6例檢出異常（22.2%）。 正常核型的15例中，F(xiàn)ISH檢出9例異常。 未見分裂象的7例中，F(xiàn)ISH檢出3例異常。 FISH檢出的異常克隆比例大多都低于30%。 漿細(xì)胞比例低于20%，異常檢出率會(huì)大大降低。,MDS中的應(yīng)用 FISH在MDS中的應(yīng)用價(jià)值相對(duì)較低。 MDS的患者大多能成功完成核型分析，且被分析的分裂象數(shù)目和質(zhì)量尚可。 FISH檢測(cè)普遍采用組合探針（-5/5q-、-7/7q-、+8、20q-和-Y）對(duì)五大類常見異常進(jìn)行分析。,二、治療和預(yù)后分層,在我院新近完成的70例MDS患者的研究中： 核型和FISH分別檢出21例和22例異常，異常檢出率相當(dāng)。 核型異常但FISH正常的6例，這6例異常均發(fā)生于探針覆蓋范圍以外區(qū)域。 核型正常而FISH異常7例，這7例的異?？寺〖?xì)胞比例大多較低（10%）。 對(duì)于未見分裂像和正常核型的患者有一定的應(yīng)用價(jià)值，能提高小克隆異常的檢出率。,二、治療和預(yù)后分層,三、監(jiān)測(cè)療效,對(duì)于某些不具有特定分子水平改變，或者是基因重排方式比較特殊，常規(guī)的分子生物學(xué)方法不能檢測(cè)，但其在疾病初發(fā)時(shí)有較大片段的易位、缺失、擴(kuò)增或重排并能被現(xiàn)有的FISH探針檢出的患者，可在治療后進(jìn)行FISH監(jiān)測(cè)。,FISH在異性別異基因造血干細(xì)胞移植后供受者嵌合比例的監(jiān)測(cè)中也有非常重要的價(jià)值。 比較未分選細(xì)胞的STR和FISH兩種技術(shù)，F(xiàn)ISH的敏感性和準(zhǔn)確度更高，對(duì)于早期提示復(fù)發(fā)或排斥反應(yīng)的臨床應(yīng)用價(jià)值更大。,四、識(shí)別移植后骨髓細(xì)胞來(lái)源,小 結(jié),FISH的優(yōu)點(diǎn)： 簡(jiǎn)便迅速。 雜交和檢測(cè)效率高。 敏感性和特異性高，能對(duì)間期細(xì)胞進(jìn)行分析。 缺點(diǎn)