PTSD 大鼠杏仁核神經(jīng)元凋亡相關(guān)基因 Bax、Bcl-2.doc

ptsd 大鼠杏仁核神經(jīng)元凋亡相關(guān)基因 bax、bcl-2的表達及與細胞凋亡的關(guān)系1丁金蘭，韓芳，石玉秀* 中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，沈陽（110001） e-mail：摘要：觀察創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(ptsd)大鼠杏仁核神經(jīng)元細胞凋亡相關(guān)基因的表達與細胞凋 亡，從杏仁核神經(jīng)元細胞凋亡揭示ptsd的部分發(fā)病機制。成年健康雄性wister大鼠50只，隨 機分為sps模型的1d、4d、7d、14d組及正常對照組。應(yīng)用免疫組化和western blotting技術(shù)檢 測凋亡相關(guān)基因bax、bcl-2在ptsd杏仁核神經(jīng)元的表達；采用 tunel法檢測ptsd大鼠杏仁 核神經(jīng)元細胞凋亡。ptsd大鼠杏仁核神經(jīng)元凋亡相關(guān)基因bax/bcl-2于4天達高峰，之后漸趨 下降。tunel陽性細胞在sps各組模型均出現(xiàn)，4天達最高峰。ptsd大鼠杏仁核神經(jīng)元細胞 凋亡中，凋亡相關(guān)基因bax、bcl-2各自發(fā)揮促進凋亡和抑制凋亡的作用，bax/bcl-2比值升高 促進細胞發(fā)生凋亡，可能與杏仁核調(diào)節(jié)的ptsd恐懼異常的發(fā)病機制相關(guān)。 關(guān)鍵詞：ptsd；杏仁核；凋亡；bcl-2；bax中圖分類號： r32281文獻標識碼： a1. 引言創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(posttraumatic stress disorder, ptsd)是指由異常威脅性或災(zāi)難性心理創(chuàng) 傷導(dǎo)致延遲出現(xiàn)和長期持續(xù)的精神障礙1。在嚴重創(chuàng)傷應(yīng)激急性期，邊緣系統(tǒng)為應(yīng)激應(yīng)答敏 感區(qū),其功能和應(yīng)激聯(lián)系密切，杏仁核是邊緣系統(tǒng)中重要的皮質(zhì)下核團，因此在 ptsd 的發(fā) 病中起重要作用。目前的 ptsd 研究已表明，mri 檢測報道海馬萎縮2，由于海馬神經(jīng)元凋 亡，致體積減小3, 4。杏仁核和海馬的功能密切相關(guān)，海馬的功能受杏仁核的調(diào)節(jié)而實現(xiàn)5， 有研究報道 ptsd 杏仁核體積變小,杏仁核的活動量與癥狀的嚴重程度成正相關(guān)6, 7，那么 ptsd 杏仁核體積變小是否由神經(jīng)元凋亡所導(dǎo)致呢？近年的研究顯示，凋亡相關(guān)基因 bax 和 bcl-2 在細胞凋亡的調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用。bax 和 bcl-2 被認為是細胞凋亡調(diào)控的最后 通路之一，并且二者比值增大時,細胞趨于凋亡8，因此把兩者作為杏仁核神經(jīng)元細胞凋亡中 的一對基因共同研究顯得尤為重要。本研究通過國際上公認的 sps 模型，采用免疫組化、 western blotting 和 tunel 染色方法對大鼠杏仁核神經(jīng)元細胞進行了檢測，旨在為研究 ptsd 杏仁核神經(jīng)元細胞的形態(tài)、功能及部分發(fā)病機制提供豐富的理論和形態(tài)學(xué)證據(jù)。2. 材料和方法2.1 實驗動物及分組成年健康雄性wistar大鼠50只，體重150180g，中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，隨 機分為5組，即sps的1d、4d、7d、14d組及正常對照組,每組10只。2.2 動物模型的建立和取材采用日本文部省召開的“基礎(chǔ)和臨床的研究進展”的會議確定的關(guān)于 ptsd 模型sps 刺1本課題得到國家自然科學(xué)基金（項目編號 30600341）的資助。*通信聯(lián)系人。- 7 -激。sps 刺激是指將大鼠連續(xù)進行下述步驟處理，即：大鼠禁錮 2 小時后，立即強迫游泳20min（水深 40cm，水溫 25）。經(jīng)過 15min 的恢復(fù)，乙醚麻醉至意識喪失，在籠子中不再 經(jīng)任何刺激正常飼養(yǎng)至取材。分別取 sps 1d、4d、7d、l4d 及正常對照組大鼠進行灌流固定。大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉腹腔 注射麻醉后，用 0.01mpbs 緩沖配置的 4多聚甲醛心臟灌流，取出腦組織，并浸入同種固定液中續(xù)固定 3h，常規(guī)石蠟包埋，切 5m 厚的冠狀切片。2.3 免疫組化（pv法）進行bax、bcl-2染色與圖像分析切片脫蠟后，將切片入枸櫞酸鹽緩沖液中抗原熱修復(fù)，滴加兔抗鼠bax抗體(購于santa cruz biotechnology公司，工作濃度為1：50），4過夜，滴加igg抗體-hrp多聚體（pv試 劑盒購于zsgb-bio公司）37 30min，dab顯色，蘇木素染核，常規(guī)脫水，透明，中性樹 膠封片。光學(xué)顯微鏡(olympus，bx60，japan)下觀察，攝片。bcl-2為羊抗兔一抗抗體(購 于santa cruz biotechnology公司，工作濃度為1：50），其余步驟同bax。應(yīng)用metamorph/dpio/bx41形態(tài)學(xué)圖象分析系統(tǒng)軟件，對上述免疫組化染色切片進行了半定量 分析。在高倍（1040倍）視野下，每張免疫組化染色切片取 5 個視野，記錄每個視野內(nèi)陽性細胞 光密度值，取平均光密度。每組大鼠共選取 5 張切片，然后求相應(yīng)組的bax與bcl-2的比值，具 體半定量分析結(jié)果。2.4 western blotting檢測凋亡基因bax、bcl-2的表達取新鮮杏仁核組織經(jīng)勻漿、超聲粉碎后高速低溫離心，11000rmpmin，取上清；采用 考馬斯亮藍法定蛋白濃度為3mgml；每例標本提取蛋白5og，10%sdspage變性凝膠 電泳，濃縮膠90v、30 min和分離膠110v、 120 min；恒壓轉(zhuǎn)移到pvdf膜上，4過夜，5% 脫脂奶粉封閉60min；兔抗鼠bax、bcl-2一抗(工作濃度1：500)中孵育4過夜；igg抗體-hrp 多聚體(工作濃度1：5000)孵育2h，定影，顯影，圖像分析。應(yīng)用image j分析軟件分析上述結(jié)果,目的條帶bax、bcl-2 的平均灰度值分別表示bax、bcl-2蛋白水平（灰度值越大，蛋白表達越少）,求各條帶的平均灰度值的比值。2.5 tunel 染色采用tunel法原位標記dna片段檢測凋亡細胞，原位細胞凋亡檢測試劑盒(由roch公司 提供) ,組織切片常規(guī)脫蠟至水，0.3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性，蛋白酶k消化, tdt反應(yīng)液、anti-fluorescein antibody 工作液37 各作用1 h, dab顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī) 脫水，透明，中性樹膠封片。不含tdt反應(yīng)液的為陰性對照。每張玻片分別隨機取5個高倍鏡視野，計數(shù)凋亡細胞數(shù)和細胞總數(shù)，計算凋亡指數(shù)，凋 亡指數(shù)凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)100。2.6 統(tǒng)計學(xué)分析所得數(shù)據(jù)使用spss13.0 統(tǒng)計軟件。計量資料用平均數(shù)標準差表示。應(yīng)用單因素方差分 析， p0.05 判為具有統(tǒng)計學(xué)意義。3. 結(jié)果3.1 大鼠杏仁核bax, bcl-2的免疫組化染色結(jié)果免疫組化染色陽性信號為棕黃色，陽性表達的bax 和bcl-2 染色定位于細胞漿（圖1，2）。bax免疫組化結(jié)果顯示，在正常組大鼠杏仁核中極少量bax陽性信號，而在sps1天，杏 仁核中 bax表達明顯增多；bax的這種高表達在sps4天達到高峰，而在7天，bax表達量下降，14天表達進一步下降，明顯低于sps4天組，與正常對照組相似（圖1）。bax在sps后表達增 加，這是促進細胞凋亡的特征。bcl-2免疫組化結(jié)果顯示，在正常組大鼠杏仁核中bcl-2呈極弱陽性反應(yīng)，而在sps1天時， 杏仁核中bcl-2表達較正常對照組大鼠明顯增高，sps4天、7天、14天，bcl-2表達量較1天組 漸趨下降（圖2）。bcl-2在正常大鼠杏仁核中幾乎沒有表達，但在sps后則出現(xiàn)表達，這是 機體對抗凋亡的一種反應(yīng)。圖1. 1a 正常對照組bax 免疫反應(yīng)陽性細胞 400fig.1 1a immunoreaction of bax in rat amygdala of control group4001b sps 4天組bax免疫反應(yīng)陽性細胞4001b immunoreaction of bax in rat amygdala of sps 4d4001c sps 14天組bax免疫反應(yīng)陽性細胞4001c immunoreaction of bax in rat amygdala of sps 14d400圖2. 2a 正常對照組bcl-2免疫反應(yīng)陽性細胞 400fig.2 2a immunoreaction of bcl-2 in rat amygdala of control group 4002b sps 4天組bcl-2免疫反應(yīng)陽性細胞4002b immunoreaction of bcl-2 in rat amygdala of sps 4d4002c sps 14天組bcl-2免疫反應(yīng)陽性細胞 4002c immunoreaction of bcl-2 in rat amygdala of sps 14d400對上述免疫組化染色切片在高倍視野下,記錄每個視野內(nèi)陽性細胞吸光度值，取平均光 密度(od)。然后求相應(yīng)組的bax與bcl-2的比值，具體半定量分析結(jié)果見表1。表1 不同時間點大鼠杏仁核神經(jīng)元bax及bcl-2表達情況(od)（xs，n=10）table 1 the amygdala neurons bax and bcl-2 expression at different time(od) (xs)組別baxbcl-2bax/ bcl-2正常組 sps-1d組 sps-4d組 sps-7d組 sps-14d組23.25522.152681.89115.369487.34434.3659858.6422 3.215440.4356 2.983525.69353.269763.15256.436143.53194.865237.17154.198332.29833.51640.70510.32641.29670.4381*2.00640.6325*1.57760.3953*1.25190.2967*注：與正常組比較，*表示 p 0.05。由表中可知，bax/ bcl-2的比值在4天達高峰，7天和14天漸趨下降至正常。3.2 western blotting結(jié)果正常組條帶較淡,sps各組條帶明顯比正常組深，與正常組相比,蛋白表達明顯上調(diào)（圖3）。 蛋白表達隨時間變化與免疫組化陽性細胞od值隨時間變化一致，見表2。表2 杏仁核bax 、bcl-2 western botting的平均灰度值（xs）table.2 the average gray value in amygdale of bax and bcl-2 western botting組別baxbcl-2bax/ bcl-2正常組 sps-1d組 sps-4d組 sps-7d組 sps-14d組189.691510.264571.70684.561265.11313.6294120.83316.8652141.63708.5497180.681413.152151.53617.2681161.05157.8249184.50628.9546198.94379.52751.0499 0.25840.47320.1537*0.40430.1263*0.65490.1948*0.71190.2161*注：與正常組比較，*表示 p 0.05。圖3 western blotting 檢測各組bax, bcl-2蛋白表達各條帶從左向右依次為正常對照組及sps的1、4、7、14d組fig3 the expression of bax, bcl-2 protein in different group (western blotting)3.3 tunel染色結(jié)果光鏡下見凋亡細胞深染為棕黃色,非凋亡細胞的核呈藍色。在未加tdt酶和標志液的切 片未見陽性細胞；正常組可見少量tunel陽性細胞。sps各組均可見散在的tunel陽性細 胞，sps4天陽性細胞數(shù)達高峰,（p0.05）之后呈逐漸下降趨勢（圖4）。sps各組與正常組 及sps組間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義( p 0.05) (見表 3)圖4. 4a 原位末端標記法（tunel）標記正常對照組的凋亡細胞400fig.4 4a tunel detected the normal control group of apoptotic cells4004b sps4d 原位末端標記法（tunel）標記出大量凋亡細胞4004b many tunel-positive cells were detected 4d after sps4004c sps14d 原位末端標記法（tunel）標記出少量凋亡細胞4004c few tunel-positive cells were detected 14d after sps400表3. 大鼠杏仁核神經(jīng)元細胞的凋亡指數(shù)table.3 apoptotic index（ai）of rat amygdale neurons組別鼠數(shù)凋亡指數(shù)（%）正常組 sps-1d組 sps-4d組 sps-7d組 sps-14d組101.19641.5146109.21963.2913*1015.69512.1785*1010.13853.9291*103.35842.2435*注：與正常組比較，*表示 p 0.054. 討論近年來,由于戰(zhàn)爭、自然災(zāi)害、暴力事件等頻頻發(fā)生,創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙發(fā)病率越來越高， 造成腦內(nèi)各結(jié)構(gòu)功能失調(diào)，給人們的身心造成創(chuàng)傷。杏仁核是恐懼形成和表達的關(guān)鍵中樞， 作為大腦中一個關(guān)鍵的區(qū)域來調(diào)節(jié)這些消極應(yīng)激。杏仁核結(jié)構(gòu)的改變導(dǎo)致功能的異常，因此， 研究它的結(jié)構(gòu)從而研究它的發(fā)病機制越來越重要。從遭受腦損傷和情緒創(chuàng)傷性事件的越南老 兵身上我們發(fā)現(xiàn)大量這些個體中ptsd的出現(xiàn)損傷包括杏仁核的前顳部9。還有的研究發(fā)現(xiàn) 在ptsd時杏仁核體積減小，在應(yīng)激狀態(tài)下，杏仁核神經(jīng)元細胞可能發(fā)生了凋亡從而導(dǎo)致了 杏仁核的體積減小。本文從這一角度檢測了杏仁核神經(jīng)元細胞的形態(tài)改變。細胞凋亡(apoptosis)，又稱程序性細胞死亡(programmed cell death)，是指細胞為維持內(nèi) 環(huán)境穩(wěn)定，由基因活動指導(dǎo)下的主動性死亡。目前已知凋亡過程中伴隨著一系列凋亡相關(guān)基 因的表達，其中bcl-2基因蛋白家族在細胞凋亡的調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用，并被認為是細 胞凋亡調(diào)控的最后通路之一。bcl-2表達水平較高時,形成bcl-2/ bcl-2同源二聚體,抑制細胞凋亡，而 bax作為bcl-2的同源體，是bcl-2家族中最具有促進凋亡特征的基因。bax被表達并轉(zhuǎn)位于線粒體是對各種細胞死亡信號的反應(yīng), bax能誘導(dǎo)各種蛋白分解, 抑制bcl-2的作用， 從而有促進凋亡作用10，bax表達水平較高時,形成bax/ bax同源二聚體,加速細胞凋亡11。 近年的研究提示bcl-2與bax調(diào)節(jié)細胞凋亡,不僅取決于自身表達的高低,還與bax/ bcl-2比值 有關(guān), bax/ bcl-2在中樞神經(jīng)細胞凋亡中起關(guān)鍵作用。bax / bcl-2比值決定了在創(chuàng)傷刺激下細 胞是否進入凋亡12,13，當比值增大時,細胞趨于凋亡。因此,把兩者作為杏仁核神經(jīng)元細胞凋 亡中的一對基因共同研究顯得更為重要。本實驗結(jié)果顯示，bax/ bcl-2比值在sps后明顯上調(diào)， 提示凋亡相關(guān)基因bax和bcl-2調(diào)控ptsd杏仁核神經(jīng)元細胞的凋亡。ptsd大鼠杏仁核神經(jīng)元細胞凋亡中，凋亡相關(guān)基因bax、bcl-2各自發(fā)揮促進凋亡和抑 制凋亡的作用，bax/bcl-2比值升高促進細胞發(fā)生凋亡，可能與杏仁核調(diào)節(jié)的ptsd恐懼異常 的發(fā)病機制相關(guān)。本實驗通過tunel染色測定凋亡指數(shù)發(fā)現(xiàn)，sps各組的凋亡指數(shù)明顯高于正常對照組， 并且都具有統(tǒng)計學(xué)意義，表明ptsd大鼠杏仁核神經(jīng)元細胞發(fā)生凋亡，導(dǎo)致杏仁核結(jié)構(gòu)改變， 可能與ptsd杏仁核部分發(fā)病機制相關(guān)。目前，ptsd的全部發(fā)病機制機制尚未完全清楚，ptsd可能引起腦一系列神經(jīng)生化、生 理的異常，最終導(dǎo)致杏仁核損傷。因此對ptsd的發(fā)病機制還需進一步探討。參考文獻1kessler rc. post-traumatic stress disorder: the burden to the individual and to society. j clinpsychiatrt,2000, 61(suppl5) 4-12.2lindauer rj, vlieger ej, jalink m, et al. effectsof psychotherapy on 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