色譜法的理論與實踐.ppt

2019/7/15,1,色譜法的理論與實踐,2019/7/15,2,一、色譜基礎(chǔ)理論概述,色譜法或稱層析法（chromatography）是一種物理或物理化學(xué)的分離分析方法。 1906年俄國植物學(xué)家Tswett M將碳酸鈣裝在豎立的玻璃柱內(nèi)，從頂端倒入植物色素的石油醚浸取液，并用石油醚沖洗，在柱的不同部位形成色帶，因而命名為色譜法。,2019/7/15,3,色譜法是利用物質(zhì)在不同的兩相中分配、吸附或其他親和作用的差異，通過多次重復(fù)使微小的差別積累起來變成大的差異，從而使混合物中各組分達到分離。 色譜技術(shù)在近二十多年中的飛速發(fā)展已形成一門專門的科學(xué)，稱為色譜學(xué)。廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域，成為多組分混合物的最重要的分離分析方法。,2019/7/15,4,二、色譜法的分類,按流動相與固定相的分子聚集狀態(tài)分類 按流動相的分子聚集狀態(tài)分類 GC， LC，超臨界流體色譜（SFC） 按固定相的聚集狀態(tài)分類 氣相色譜法（氣-固，氣-液） 液相色譜法（液-固，液-液） 按操作形式分類 柱色譜，平面色譜，逆流分配,2019/7/15,5,按色譜過程的分離機制分類,吸附色譜（adsorption ） 利用吸附能力的差別. 分配色譜（partition ） 利用分配系數(shù)的差別. 空間（分子）排阻色譜（steric exclusion ）或稱凝膠色譜法（gel ） 利用被測物分子大小不同而導(dǎo)致的滲透系數(shù)差異.,2019/7/15,6,離子交換色譜（ion exchange ） 利用在離子交換樹脂上的交換能力差別。又可分為: 氨基酸分析（aminoacid analysis） 離子色譜法（ion chromatography） 親合色譜（affinity ） 將生物活性配位基（酶、輔酶，抗體等）鍵合到載體表面形成固定相，利用親合力大小進行分離(專用于蛋白質(zhì)等生化樣品）。,2019/7/15,7,毛細管電色譜（capillary electro- ） 依靠色譜與電場兩種作用力，利用分配系數(shù)和電泳速度差別而分離。 毛細管電泳 （capillary electrophoresis） 以高壓電場為驅(qū)動力，根據(jù)樣品組分的淌度和分配系數(shù)而分離。 手性色譜（chiral chromatography） 利用手性識別原理，用于手性藥物的分離分析。,2019/7/15,8,2019/7/15,9,熱力學(xué)理論塔片理論 是由平衡的觀點來研究分離過程，是一種半經(jīng)驗理論，以塔片理論為代表。 動力學(xué)理論速率理論 是從動力學(xué)觀點，即速度來研究各種動力學(xué)因素對柱效的影響，以Van Deemeter方程式為代表。,三、色譜理論,2019/7/15,10,基本概念 色譜峰（peak）樣品產(chǎn)生的電信號強度對洗脫時間作圖。稱為流出曲線，濃度 -時間曲線，也稱色譜帶（band）。 色譜峰有三種形式： 對稱峰 拖尾峰（tailing peak） 前延峰（leading peak）,2019/7/15,11,峰形參數(shù)： 對稱因子（symmetry factor，fs） fs =(A+B)/2A； 或用： 拖尾因子（tailing factor，T）來衡量 T=W0.05h/2d1 T=0.951.05(正常峰) T0.95(前延峰) T1.05(拖尾峰),掌握,2019/7/15,12,T=W0.05h/2d1， 或fs=(A+B)/2A,W0.05h = x =h/20,峰的對稱性,2019/7/15,13,一個色譜峰，可用三項參數(shù)來描述： 峰高或峰面積定量 峰位（保留值）定性 峰寬 衡量柱效,掌握,2019/7/15,14,基線（base line ）在操作條件下，檢測器中只有流動相通過時的流出曲線稱為基線。它反映了儀器的噪音隨時間的變化。 噪音（noise ，N）各種未知的偶然因素引起的基線起伏的現(xiàn)象稱為噪音。噪音的大小用噪音帶的寬度來描述。,基線漂移,掌握,2019/7/15,15,定性參數(shù) 保留值 保留時間，保留體積 相對保留值 保留指數(shù),2019/7/15,16,保留值 保留時間（retention time ，tR）進樣開始到組分色譜峰頂點時間間隔。 死時間（dead time ，t0或tM）流動相通過色譜系統(tǒng)的時間。,2019/7/15,17,調(diào)整保留時間（adjusted retention time，tR）也稱為表觀保留時間、校正保留時間某組分由于溶解或被吸附于固定相，比不溶解或不被吸附的組分在柱中多停留的時間，即： tR= tR t0，在實驗條件一定（溫度、固定相）， tR決定組分的性質(zhì)，故tR是定性的基本參數(shù)。,2019/7/15,18,2019/7/15,19,保留體積（retention volume，VR），又稱洗脫體積流動相攜帶樣品進入色譜柱，由進樣開始到某組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值時，通過色譜柱的流動相體積。,2019/7/15,20,相對保留值（1,2) 指組分（1）與參照物（2）兩者調(diào)整保留值的比值。 1,2= tR（1）/ tR（2） = K1/K2 (K為分配系數(shù)）,保留指數(shù)（I，Kovats指數(shù)） 是把組分的保留行為換算成相當于含有幾個碳的正構(gòu)烷烴的保留行為來描述。,2019/7/15,21,柱效率的參數(shù)（色譜峰的區(qū)域?qū)挾龋?標準差（，standard deviation) 半峰寬（peak width at half-height，W1/2或Y1/2） 基線寬度（peak width，W或Y）,熟悉,2019/7/15,22,標準差在正態(tài)分布曲線中，將x=1處（拐點）的峰寬之半稱為標準偏差。在實際工作中,標準差為峰高0.607h 處的峰寬之半。 峰形窄， 小，分散度小，柱效高。反之，柱效低。,2019/7/15,23,半峰寬也稱半腰寬，為色譜峰高之半處的峰寬。W1/2=2.355 ， W1/2易確定，且比值大，故測量誤差較小。,2019/7/15,24,峰寬也稱基線寬度。對色譜峰兩側(cè)的拐點作切線,在極限上所截的距離,稱為峰寬。 對色譜峰兩側(cè)作切線后為等腰三角形，底邊為峰寬，而為等腰三角形高度之半處的寬度之半，所以 ：W=4,2019/7/15,25, ,W,h,0.5h,0.607h,W1/2,W1/2=2.355 ，W=4=1.699W1/2,2019/7/15,26,分配系數(shù)（partition coefficient，K ） 在一定條件下，達到分配平衡后： 樣品組分在固定相中的濃度（Cs） 樣品組分在流動相中的濃度（Cm） K = Cs / Cm,2019/7/15,27,分離參數(shù) 分離參數(shù)用于衡量分離條件的優(yōu)劣，常用分離度，表示。 分離度（resolution，R） R= 即相鄰兩峰分開的距離是平均峰寬 (W1+W2)/2的幾倍。 R大, 分離效果好。,2019/7/15,28,2019/7/15,29,塔板理論 把色譜柱看作一個分餾塔，在每個塔板的間隔內(nèi)，樣品混合物在氣液兩相中達到分配平衡，經(jīng)多次分配平衡后，分配系數(shù)小的組分，先到達塔頂（先流出色譜柱）。由于色譜柱的塔板相當多，因此分配系數(shù)的微小差別就可獲得很好的分離效果。 在柱內(nèi)一小段長度H內(nèi)（相當于一個分餾塔），組分可以很快在兩相間達到平衡，H稱為理論塔板高度。,2019/7/15,30,理論板數(shù)（n）與理論板高度（H） n=（tR/）2 n=5.54 （tR/w 1/2）2 n= 16 (tR/w)2 n 越大 ，柱效越高。 如果用tR計算理論板數(shù)，所得值為有效理論板數(shù) n有效,2019/7/15,31,理論板數(shù)取決于： 固定相種類、性質(zhì)、填充狀況、柱長； 流動相及其流速； 被測物性質(zhì)等。 理論板高 (H) H=L / n L為色譜柱長度