泌尿系感染產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶(ESBLs)大腸埃希菌的耐藥表型和基因分型.doc

泌尿系感染產(chǎn)超廣譜內(nèi)酰胺酶(ESBLs)大腸埃希菌的耐藥表型和基因分型【關(guān)鍵詞】 大腸埃希菌Resistant phenotype and genotype of extended spectrum lactamase (ESBLs) produced in Escherichia coli isolated from urinary infectionsGENG Yan1, ZHANG WangGang1, WANG XiangLing1, YANG HuiBin2, HUANG Fang1, ZHANG Yi11Department of Clinical Laboratory, Second Hospital, Xian Jiaotong University, Xian 710004, China, 2Department of Transportation Management of Xian City, Xian 710065, China【Abstract】 AIM: To study the resistant phenotype and genotype of extended spectrum lactamase (ESBLs) produced in Escherichia coli isolated from urinary infections. METHODS: Organisms of clinical infection were identified by automatic microbial system (Vitek) and the bacterial susceptibility was tested by KirbyBauer (KB) method as described in NCCLS. ESBLs was detected by disk diffusion confirmatory test and CTXM or SHV specific PCR were used to determine the genotype of ESBLs. RESULTS: 24.0% of E.coli produced ESBLs. Fortytwo of the 62 ESBLs producing strains (67.7%) expressed CTXM lactamase and 9 of the 62 ESBLs producing strains (14.5%) expressed SHV lactamase. CONCLUSION: ESBLs producers are mainly resistant to cefotaxime and cefiriaxone and most of them are multidrug resistant. Cefotaxime resistance is partially due to the production of CTXM lactmase. CTXM lactmase is most prevalent.【Keywords】 Escherichia coli; extended spectrum lactamase; phenotype, antibiotics resistant; genotype【摘要】 目的:了解本地區(qū)泌尿系感染產(chǎn)超廣譜內(nèi)酰胺酶(ESBLs)大腸埃希菌耐藥表型及其基因型分布. 方法：收集200303/200406間臨床分離的尿培養(yǎng)陽性大腸埃希菌共258株, ESBLs的檢測采用NCCLs規(guī)定的ESBLs型篩選和確定實(shí)驗(yàn)，用KB瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行藥物敏感性檢測，并應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）方法對所分離的產(chǎn)ESBLs菌株進(jìn)行SHV, CTXM基因型檢測. 結(jié)果：產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌檢出率為24.0%(62株），67.7%(42株)攜帶CTXM基因，14.5%(9株) 的菌株攜帶SHV型基因，并有1.6%(1株)同時攜帶CTXM基因和SHV型基因. 結(jié)論：本地區(qū)泌尿系感染產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌以耐頭孢曲松和頭孢噻肟為主; CTXM型的ESBLs最為常見.【關(guān)鍵詞】 大腸埃希菌；超廣譜內(nèi)酰胺酶；表型,耐藥；基因分型0引言內(nèi)酰胺類抗生素是臨床抗感染治療中使用最廣的一類抗菌藥物，產(chǎn)內(nèi)酰胺酶是細(xì)菌對此類抗菌藥物耐藥的主要機(jī)制，由質(zhì)粒介導(dǎo)的超廣譜內(nèi)酰胺酶（ESBLs）是導(dǎo)致革蘭氏陰性桿菌對內(nèi)酰胺類抗生素耐藥性的最重要機(jī)制，一旦這類酶由于某種機(jī)制而產(chǎn)生了大量由染色體或質(zhì)粒介導(dǎo)的內(nèi)酰胺酶（青霉素酶、頭胞菌素酶、碳青酶烯類酶等），則可使包括第三代頭胞菌素在內(nèi)的許多內(nèi)酰胺類抗生素失活，成為目前臨床治療感染性疾病的重大難題. 為了解本地區(qū)泌尿系感染產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌耐藥表型和基因型分布特征,我們對臨床標(biāo)本中所分離到產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌進(jìn)行分子生物學(xué)研究.1材料和方法1.1材料收集200303200406西安交通大學(xué)第二醫(yī)院細(xì)菌室臨床尿培養(yǎng)分離的大腸埃希菌共258株. 培養(yǎng)基:MuellerHinton瓊脂，羊血營養(yǎng)瓊脂購自上海醫(yī)化所，ESBLs的陽性質(zhì)控菌株肺炎克雷伯菌ATCC700603. 藥敏實(shí)驗(yàn)質(zhì)控菌株：大腸埃希菌E.coli ATCC25922. 藥敏紙片：阿米卡星(AN)、復(fù)方磺胺 (SXT)、呋喃妥因（F）、環(huán)丙沙星(CIP)、左旋氧氟沙星（LEV）、頭孢唑啉（KZ）、頭孢呋新（CXM）、頭孢噻肟(CTX)、頭孢曲松（CRO）、頭孢他啶(CAZ)、氨曲南(ATM)、頭孢西丁(FOX)、頭孢吡肟(FEP)、亞胺培南(IMP)、頭孢哌酮舒巴坦（SCF）、替卡西林克拉維酸(TIM)、哌拉西林 三唑巴坦(TZP) 、頭孢他啶 克拉維酸(CD02)、頭孢噻肟 克拉維酸(CD03)，紙片為英國OXOID公司產(chǎn)品. 每周用質(zhì)控菌株進(jìn)行質(zhì)量控制.1.2方法1.2.1ESBLs的檢測采用全自動微生物分析儀Vitek GNI+卡對所分離菌株進(jìn)行鑒定. 抗生素敏感性試驗(yàn)采用紙片擴(kuò)散法即KB法，大腸埃希氏菌ATCC25922做藥敏質(zhì)控. 藥敏結(jié)果按NCCLS標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定（S, I, R）. 按1999年NCCLS100S10推薦的方法進(jìn)行超廣譜內(nèi)酰胺酶ESBLs的檢測和判定，采用紙片擴(kuò)散法，包括篩選和確認(rèn)實(shí)驗(yàn)兩步. 選用頭孢他啶、頭孢噻肟兩種藥敏紙片（30 g/片），凡頭孢他啶22 mm、頭孢噻肟27 mm，均應(yīng)進(jìn)一步作確認(rèn). 當(dāng)頭孢他啶（30 g/片）與頭孢他啶/棒酸（30 g/10 g）或頭孢噻肟（30 g/片）與頭孢噻肟/棒酸（30 g/10 g）中任意一組藥物的抑菌環(huán)直徑相差5 mm，可確認(rèn)為ESBLs陽性菌株. ESBLs的質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC25922（頭胞他啶與頭胞他啶+克拉維酸相差2 mm）肺炎克雷伯菌ATCC 700603（頭胞他啶與頭胞他啶+克拉維酸相差5 mm）.1.2.2PCR試驗(yàn)取單個菌落接種于5 mL LB肉湯，37振蕩培養(yǎng)20 h. 取1.5 mL菌懸液在4以650 g離心5 min，棄上清. 加入500 L的無菌去離子水，振蕩混懸. 95水浴加熱10 min，4 650 g離心5 min，上清即為制備的模板DNA. 在Genbank里利用Primer3.0設(shè)計(jì)引物. 引物序列為：左側(cè)引物5CGCCTGTGTATTATCTCCCTGT3，右側(cè)引物5TTAGCGTTGCCAGTGCTC3. CTXM型酶引物序列為：左側(cè)引物5AAAAATCACTGCGTCAGTTCA3，右側(cè)引物5TTACAAACCGTTGGTGACGA3. 引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成. PCR反應(yīng)總體積為50 L，其中10Buffer為5 L；dNTP混合物，各組分0.2 mmol/L；Taq酶2 U；左右側(cè)引物各0.5 mol/L；MgCl2濃度為2.0 mol/L；模板2 L. 在加入Taq酶前，首先在95預(yù)變性10 min. PCR循環(huán)條件為93變性1 min，55退火1 min，72延伸1 min，共30循環(huán). 瓊脂糖電泳：在電壓為4 V/cm2條件下電泳35 min，紫外燈下觀察結(jié)果，并用凝膠成像系統(tǒng)照像.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理: 應(yīng)用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（包括Fisher精確概率法、2檢驗(yàn)）. P0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.2結(jié)果泌尿系感染產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的分離率在門診和住院有差異（P0.05, Tab 1）. 泌尿系感染大腸埃希菌產(chǎn)ESBLs與ESBLs陰性菌的耐藥性（Tab 2）：ESBLs陽性與ESBLs陰性的大腸埃希菌兩者的耐藥率（包含中介）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05). 62株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的分子生物學(xué)初步分型結(jié)果顯示：67.7%(42株)攜帶CTXM基因，14.5%(9株) 的菌株攜帶SHV型基因，并有1.6%(1株)同時攜帶CTXM基因和SHV型基因. 研究提示本地區(qū)泌尿系感染產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的主要基因型為CTXM基因，同一菌株可能同時攜帶多種質(zhì)粒介導(dǎo)的ESBLs，導(dǎo)致其耐藥基因的復(fù)雜性.表1表2(略)3討論自從1983年在德國從臭鼻克雷伯桿菌中分離出SHV2型ESBLs以來，大量的新型ESBLs從不同的細(xì)菌、不同的國家和地區(qū)分離出來，導(dǎo)致ESBLs在地區(qū)間的分布呈現(xiàn)明顯的差異性1,在西安地區(qū)泌尿系感染患者尿培養(yǎng)的大腸埃希菌株中ESBLs的檢出率達(dá)26.05%,與國內(nèi)其他地區(qū)的平均水平相當(dāng)2,3.文獻(xiàn)報道ESBLs不能水解頭霉素類，但本研究結(jié)果提示，對于產(chǎn)ESBls菌株頭孢西丁仍有近40產(chǎn)生耐藥，這可能與細(xì)菌細(xì)胞外膜的改變或細(xì)菌同時產(chǎn)生AmpC酶有關(guān)4-5. 盡管NCCLS明確指出對ESBLs，不管其體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果如何，都應(yīng)被視為對所有頭孢菌素類抗生素耐藥6，頭孢吡肟對于產(chǎn)ESBLs的抗菌活性文獻(xiàn)報道不一，但由于頭孢吡肟具有更強(qiáng)的細(xì)胞膜穿透性、對酶的低親和性和對酶更強(qiáng)的穩(wěn)定性等特點(diǎn)7，大部分認(rèn)為其對高產(chǎn)AmpC酶菌株具有強(qiáng)大的抗菌活性8，但對同時攜帶ESBLs的陰溝腸桿菌應(yīng)謹(jǐn)慎應(yīng)用.在體外藥敏試驗(yàn)中,產(chǎn)ESBLs菌對氨基糖甙類、磺胺類和喹諾酮類抗生素的耐藥亦相當(dāng)嚴(yán)重，與國外報道相比9，產(chǎn)ESBLs菌對氟喹酮類抗生素的敏感性明顯低，左旋氧氟沙星和環(huán)丙沙星耐藥率超過60%，這與臨床泌尿系感染更習(xí)慣選擇氟喹酮類抗生素有關(guān). 其原因可能由于產(chǎn)誘導(dǎo)酶的細(xì)菌通過DNA 轉(zhuǎn)移酶變異和外膜蛋白通透性降低而導(dǎo)致對喹諾酮類抗菌藥物耐藥，同時這與產(chǎn)ESBLs菌株在攜帶有ESBLs的質(zhì)粒上可同時攜帶有多個對氨基糖甙類、喹諾酮類和磺胺類等抗生素的耐藥基因有關(guān)10.本研究中，對可疑菌株進(jìn)行ESBLs表型確證試驗(yàn)，98株細(xì)菌為產(chǎn)ESBLs菌，其中僅表現(xiàn)為CD02抑菌圈直徑比頭孢他啶的增大值5 mm的菌株有8株，僅表現(xiàn)為CD03比頭孢噻肟的抑菌圈直徑增大值5 mm的有38株，兩者同時具有的為16株. 說明本地區(qū)檢測到的ESBLs的水解底物主要為頭孢噻肟，頭孢他啶在體外對產(chǎn)ESBLs菌的抗菌活性要比頭孢噻肟強(qiáng).根據(jù)ESBLs的同源性可分為TEM型、SHV型和CTXM型等. 其中前兩型最多見，呈世界范圍流行，其對頭孢他啶的水解活性較強(qiáng)；而CTXM型酶對頭孢噻肟具有高度水解活性，對頭孢他啶的水解作用很小，其在南美、東歐和東亞地區(qū)比較流行11. 我國以CTXM型為主，本試驗(yàn)PCR結(jié)果也同時證明了這一點(diǎn)：在產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌中，CTXM型檢出率為67.7，SHV型檢出率僅為7.69,因此，在西安地區(qū)產(chǎn)ESBLs菌中，CTXM型較為流行，這可能與本地區(qū)大量使用頭孢噻肟和頭孢曲松有一定的關(guān)系，說明西安地區(qū)同樣面臨著CTX M型ESBLs的威脅.本試驗(yàn)中,我們從一株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌同時檢測到SHV, CTXM兩種ESBLs. 說明本地區(qū)臨床分離菌中所產(chǎn)生內(nèi)酰胺酶的復(fù)雜性和多樣性,同時也可能是導(dǎo)致臨床菌株耐藥水平高、耐藥譜擴(kuò)大的原因之一12.【參考文獻(xiàn)】1 王輝，吳偉元，陳民鈞. 腸桿菌科細(xì)菌中超廣譜內(nèi)酰胺酶的研究J. 中華微生物與免疫雜志，2001;21(6):676-679.Wang H, Wu WY, Chen MJ. 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