浙江大學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)-基本技術(shù).ppt

細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù) 培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞系的建立和鑒定培養(yǎng)物的固定 染色顯微鏡觀察 1 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 細(xì)胞原代培養(yǎng)細(xì)胞傳代培養(yǎng)細(xì)胞凍存和復(fù)蘇細(xì)胞的運(yùn)輸 1 1細(xì)胞的原代培養(yǎng) 是將機(jī)體內(nèi)的某組織取出 分散成單細(xì)胞 在人工條件下培養(yǎng)使其生存并不斷生長繁殖的方法 借助這種方法可以觀察細(xì)胞的分裂繁殖 細(xì)胞的接觸抑制 細(xì)胞的衰老 死亡等生命現(xiàn)象 幼稚狀態(tài)的組織和細(xì)胞 如動(dòng)物的胚胎 幼仔的臟器等更容易進(jìn)行原代培養(yǎng) 意義 原代培養(yǎng)的最大優(yōu)點(diǎn)是細(xì)胞剛剛離體 生物性狀尚未發(fā)生很大變化 具有二倍體的遺傳性 而且大多數(shù)細(xì)胞表現(xiàn)出原來組織的特性 利用原代培養(yǎng)做各種實(shí)驗(yàn) 藥物測試 細(xì)胞分化及病毒學(xué)方面 效果很好 原代培養(yǎng)也是建立各種細(xì)胞系 株 必須經(jīng)過的階段 掌握無菌操作技術(shù)了解小鼠解剖操作技術(shù)了解原代細(xì)胞培養(yǎng)的一般方法與步驟了解培養(yǎng)細(xì)胞的消化分散了解倒置顯微鏡的使用 原代細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 孕鼠或新生小鼠液體 細(xì)胞生長液 內(nèi)含20 小牛血清 0 25 胰蛋白酶平衡鹽溶液70 乙醇器材 滅菌鑷子 剪刀 滅菌培養(yǎng)皿 細(xì)胞培養(yǎng)瓶 小瓶 燒杯 吸管 酒精燈 原代細(xì)胞培養(yǎng)方法 胰酶消化法組織塊直接培養(yǎng)法 消化法 采用無菌操作的方法 把組織 或器官 從動(dòng)物體內(nèi)取出 經(jīng)酶消化處理 使分散成單個(gè)細(xì)胞 然后在人工條件下培養(yǎng) 使其不斷地生長和繁殖 貼塊法 消化法 原代培養(yǎng)方法分類 分次消化 消化法的分類 外植塊培養(yǎng)步驟圖解 操作步驟1 取材 用頸椎脫位法使孕鼠迅速死亡 把整個(gè)孕鼠浸入盛有75 乙醇的燒杯中數(shù)秒鐘消毒 取出后放在大平皿中攜入超凈臺(tái) 用無菌的鑷子和剪子在前腿下作一腹部水平切口 用無菌鑷子將皮膚扯向后腿 用另一無菌的剪刀和鑷子切開腹部 取出含有胚胎的子宮 置于無菌的培養(yǎng)皿上 剔除胚胎周圍的包膜 若胚胎較大 應(yīng)剪去頭 爪 將胚胎放于無菌的含有平衡鹽溶液的培養(yǎng)皿中 漂洗胚胎 去掉平衡鹽溶液 繼續(xù)用平衡鹽溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮為止 操作步驟2 切割 將部分胚胎轉(zhuǎn)移至一個(gè)無菌小瓶中 用平衡鹽溶液漂洗 然后用眼科手術(shù)剪刀小心地絞碎胚胎 直到成1mm3左右的小塊 再用平衡鹽溶液清洗 洗到組織塊發(fā)白為止 靜置 使組織塊自然沉淀到管底 棄上清 胰酶消化法操作步驟 消化 接種培養(yǎng) 視組織塊量加入5 6倍的0 25 胰酶液 37 中消化20 40min 每隔5min振蕩一次 或用吸管吹打一次 使細(xì)胞分離 加入3 5ml細(xì)胞生長液以終止胰酶消化作用 或加入胰酶抑制劑 靜置5 10min 使未分散的組織塊下沉 取懸液加入到離心管中 1000rpm 離心5 10min 棄上清液 加入平衡鹽溶液5ml 沖散細(xì)胞 再離心一次 棄上清液 加入細(xì)胞生長液l 2ml 視細(xì)胞量 血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù) 將細(xì)胞調(diào)整到5 105 ml左右 轉(zhuǎn)移至25ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中 37 下培養(yǎng) 胰酶消化法操作步驟 消化 接種培養(yǎng) 也可將此步驟簡化為 視組織塊量加入5 6倍的0 25 胰酶液 37 中消化20 40min 每隔5min振蕩一次 靜置 吸去上清 用細(xì)胞生長液漂洗消化后的組織塊 用吸管反復(fù)吹打組織塊 使細(xì)胞分離 靜置 使未分散的組織塊下沉 取細(xì)胞懸液接種至加了細(xì)胞生長液的培養(yǎng)瓶中 調(diào)整細(xì)胞濃度到5 105 ml左右 37 下培養(yǎng) 注意 省略了離心 計(jì)數(shù)等步驟 組織塊直接培養(yǎng)法操作步驟 組織塊接種 將組織塊轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶 貼附于瓶底面 翻轉(zhuǎn)瓶底朝上 將細(xì)胞生長液加至瓶中 培養(yǎng)液勿接觸組織塊 37 靜置3 5h 輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶 使組織浸入細(xì)胞生長液中 勿使組織漂起 37 繼續(xù)培養(yǎng) 原代細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果 細(xì)胞接種后一般幾小時(shí)內(nèi)就能貼壁 并開始生長如接種的細(xì)胞密度適宜 5 7d即可形成單層 1 2傳代細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞 一代 指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)的一段期間 與細(xì)胞世代或倍增不同 在一代中 細(xì)胞培增3 6次培養(yǎng)的細(xì)胞形成單層匯合以后 由于密度過大生存空間不足而引起營養(yǎng)枯竭 將培養(yǎng)的細(xì)胞分散 從容器中取出 以1 2或1 3以上的比率轉(zhuǎn)移到新的容器中進(jìn)行培養(yǎng) 即為傳代培養(yǎng) 也是一種將細(xì)胞種保存下去的方法 同時(shí)也是利用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)的必經(jīng)過程 懸浮型細(xì)胞直接分瓶就可以 而貼壁細(xì)胞需經(jīng)消化后才能分瓶 細(xì)胞傳代方法 根據(jù)細(xì)胞生長的恃點(diǎn) 傳代方法有3種 1 懸浮生長細(xì)胞傳代離心法傳代 離心 1000轉(zhuǎn) 分 去上清 沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代 直接傳代法 懸浮細(xì)胞慢慢沉淀在瓶壁后 將上清培養(yǎng)液去除1 2 2 3 然后用吸管直接吹打形成細(xì)胞懸液再傳代 2 半懸浮生長細(xì)胞傳代 HeLa細(xì)胞 此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象 但貼壁不牢 可用直接吹打法使細(xì)胞從瓶壁脫落下來 進(jìn)行傳代 3 貼壁生長細(xì)胞傳代采用酶消化法傳代 常用消化液是0 25 胰蛋白酶液 消化法傳代培養(yǎng)步驟 選取生長良好的細(xì)胞 在超凈工作臺(tái)的酒精燈旁 倒去瓶中的舊培養(yǎng)液 加入2 3ml的D Hanks液 輕輕振蕩漂洗細(xì)胞 以除去懸浮在細(xì)胞表面的碎片 思考 還有什么作用 加入適量0 1 0 25 胰蛋白酶消化液 室溫消化 倒置顯微鏡下觀察 待細(xì)胞單層收縮突起出現(xiàn)空隙時(shí) 倒去酶液用Hanks液洗滌1次 加入適量培養(yǎng)液 反復(fù)吹打細(xì)胞 使其成細(xì)胞懸液 以1 2或1 3進(jìn)行分裝 并在培養(yǎng)瓶上做好標(biāo)記 注明代號 日期 輕輕搖勻 37 CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 觀察 細(xì)胞培養(yǎng)24h后 即可觀察培養(yǎng)液的顏色及細(xì)胞的生長情況 貼壁生長細(xì)胞傳代方法 傳代細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果 一般情況 傳代后的細(xì)胞在2h時(shí)左右就能附著在培養(yǎng)瓶壁上 2 4d就可在瓶內(nèi)形成單層 需要再次進(jìn)行傳代 取生長良好的細(xì)胞 在超凈工作臺(tái)用無菌吸管把培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞吹打均勻 轉(zhuǎn)移到無菌的離心管中 蓋緊膠蓋 平衡后離心 1000rpm min 5min 區(qū)別貼壁傳代 在超凈工作臺(tái)中吸去上清液 加入適量新培養(yǎng)液 用吸管吹打細(xì)胞 制成懸液 以1 2或1 3進(jìn)行分裝 并在培養(yǎng)瓶上做好標(biāo)記 注明代號 日期 輕輕搖勻 37 CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 觀察 細(xì)胞培養(yǎng)24h后 即可進(jìn)行觀察 懸液細(xì)胞的傳代培養(yǎng) 要預(yù)先與臨床外科醫(yī)生和護(hù)士商量 并做好一切必要的準(zhǔn)備工作 爭取拿到的標(biāo)本新鮮 無菌 少壞死等 聯(lián)系好手術(shù)時(shí)間后 立即做好如下準(zhǔn)備工作 準(zhǔn)備1 2個(gè)貯有培養(yǎng)液和抗生素的標(biāo)本收集瓶 將蓋蓋緊 保持無菌 瓶外貼上標(biāo)簽 寫上工作人員名字 地點(diǎn)和電話號碼 將收集瓶送往醫(yī)院 并與醫(yī)生和護(hù)士講清取手術(shù)標(biāo)本的部位及注意事項(xiàng) 1 3人體活檢 或手術(shù) 材料 標(biāo)本放入收集瓶后 送出手術(shù)間 立即送往組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室 工作人員最好是等在手術(shù)間外 但有時(shí)手術(shù)時(shí)間難以掌握 則請護(hù)士將收集材料的瓶子蓋好后 放入4 冰箱 盡快打電話通知工作人員 取臨床標(biāo)本時(shí) 雖然盡可能做到無菌操作 但仍有污染可能性的存在 可選用抗生素類控制污染 如手術(shù)標(biāo)本比較大 約200mg以上 可將其浸于70 酒精中約30 60秒 這樣會(huì)減少表面污染而不損壞內(nèi)部組織的結(jié)構(gòu)和存活 不要用紗布包裹標(biāo)本 紗布纖維易粘附在組織上 人體活檢 或手術(shù) 材料 整個(gè)取材過程中 都要注意保持組織的濕潤 隨時(shí)給組織塊滴加一些培養(yǎng)液或平衡鹽溶液 一般情況下 最好是使用冰冷的液體 在剪碎或切割組織塊時(shí) 盡量使用鋒利的刀剪 防止以鈍器對組織揉 捻 撕拉等而造成細(xì)胞損傷 整個(gè)取材過程耗時(shí)越短越好 在萬不得已的情況下 取材后也可將組織貯存在冷的 4 含平衡鹽溶液 或其它緩沖鹽溶液 的營養(yǎng)液中 最好不超過24 48h 視不同組織類型而定 需要注意的事項(xiàng) 1 4培養(yǎng)細(xì)胞生長測定 是腫瘤體外研究中應(yīng)用最廣的技術(shù)手段之一 任何培養(yǎng)瓶內(nèi)生長的細(xì)胞都由死細(xì)胞和活細(xì)胞組成 從形態(tài)上區(qū)別死 活細(xì)胞是困難的 方法 細(xì)胞計(jì)數(shù)法臺(tái)盼藍(lán)染色法生長曲線法四唑鹽 MTT 比色法 細(xì)胞計(jì)數(shù) 用細(xì)胞計(jì)數(shù)法測定細(xì)胞生長動(dòng)力學(xué)是目前采用的最普遍的方法 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板人工計(jì)數(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù)器血細(xì)胞計(jì)數(shù)板 常用的是改良的紐巴氏 Neubauer 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板 細(xì)胞計(jì)數(shù) 實(shí)驗(yàn)原理 血球計(jì)數(shù)盤一般有二個(gè)chambers 每個(gè)chamber中細(xì)刻9個(gè)1mm2大正方形 其中4個(gè)角落之正方形再細(xì)刻16個(gè)小格 深度均為0 1mm 當(dāng)chamber上方蓋上蓋玻片后 每個(gè)大正方形之體積為1mm2 0 1mm 1 0 10 4ml 使用時(shí) 計(jì)數(shù)每個(gè)大正方形內(nèi)之細(xì)胞數(shù)目 乘以稀釋倍數(shù) 再乘以104 即為每ml中之細(xì)胞數(shù)目 存活測試為利用染料會(huì)滲入死細(xì)胞中而呈色 而活細(xì)胞因細(xì)胞膜完整 染料無法滲入而不會(huì)呈色 細(xì)胞計(jì)數(shù) 具體操作 1 將計(jì)數(shù)板及蓋片用75 酒精擦拭干凈 并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板 2 吸取少許混合均勻的細(xì)胞懸液 滴加在蓋片邊緣 使懸液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間 靜置3min 注意蓋片下不要有氣泡 也不能讓懸液流入旁邊槽中 3 計(jì)算板四大格細(xì)胞總數(shù) 壓線細(xì)胞只計(jì)左側(cè)和上方的 然后按公式計(jì)算 細(xì)胞數(shù) mL 四大格細(xì)胞總數(shù) 4 104 稀釋倍數(shù) 注意 鏡下偶見有兩個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán) 應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算 若細(xì)胞團(tuán)10 以上 說明分散不好 需重新制備細(xì)胞懸液 由于死細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變 某些染料可大量進(jìn)入?yún)s不被排出 因而細(xì)胞呈色 而活細(xì)胞反之 能排出進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的染料 因而不易著色 此法的原理即是利用死 活細(xì)胞對染料的不同反應(yīng)而區(qū)分開兩種細(xì)胞 臺(tái)盼藍(lán)染細(xì)胞時(shí) 時(shí)間不宜過長 約2min 臺(tái)盼藍(lán)排除檢測法 將1滴細(xì)胞懸液 貼壁細(xì)胞可經(jīng)0 25 胰蛋白酶溶液消化后 吹打制成細(xì)胞懸液 與2滴臺(tái)盼藍(lán)液混合后 滴入細(xì)胞計(jì)數(shù)板 2min后 在顯微鏡下計(jì)數(shù)至少200個(gè)細(xì)胞 未著色的為活細(xì)胞 呈藍(lán)色的為死細(xì)胞 計(jì)算活細(xì)胞百分比 活體染色與細(xì)胞計(jì)數(shù) 細(xì)胞生長曲線的繪制 細(xì)胞生長曲線 cellgrowthcurve 是觀測細(xì)胞在一代生存期內(nèi)的增生過程的重要指標(biāo) 可根據(jù)細(xì)胞生長曲線分析細(xì)胞增殖速度 確定細(xì)胞傳代 細(xì)胞凍存或具體實(shí)驗(yàn)的最佳時(shí)間 它以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo) 細(xì)胞密度為縱坐標(biāo)作坐標(biāo)圖 1 培養(yǎng)細(xì)胞首先在2 孔培養(yǎng)板內(nèi)分別接種相同數(shù)量的細(xì)胞 計(jì)數(shù)并記錄接種的細(xì)胞懸液之密度 接種時(shí)間記為0h 2 計(jì)數(shù)細(xì)胞密度從接種時(shí)間算起 每隔24h計(jì)數(shù) 孔內(nèi)的細(xì)胞密度 算出平均值 為提高準(zhǔn)確率 對每孔細(xì)胞可計(jì)數(shù)2 3次 如此操作至第七天結(jié)束 3 繪制曲線以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo) 細(xì)胞密度為縱坐標(biāo) 將全部結(jié)果在坐標(biāo)紙上繪圖 即得所培養(yǎng)細(xì)胞的生長曲線 四唑鹽 MTT 商品名為噻唑藍(lán)四唑鹽比色法的原理 活細(xì)胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶于水的藍(lán)紫色產(chǎn)物 formazan 并沉淀在細(xì)胞中 而死細(xì)胞沒有這種功能 二甲亞砜 DMSO 能溶解沉積在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物 溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比 用酶標(biāo)儀測定OD570nm值 MTT法簡單快速 準(zhǔn)確 廣泛應(yīng)用于新藥篩選 細(xì)胞毒性試驗(yàn) 腫瘤放射敏感性實(shí)驗(yàn)等 四唑鹽 MTT 比色法 操作步驟 四唑鹽 MTT 比色法 100 L單細(xì)胞懸液接種于96孔板 5 104 37 5 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時(shí)間加入2mg ml的MTT液 50 L 孔 繼續(xù)培養(yǎng)3h 吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后 加入DMSO液 150 L 孔 將培養(yǎng)板置于微孔板扳蕩器上振蕩10min 使結(jié)晶物溶解 酶標(biāo)儀檢測各孔OD值 檢測波長570nm 記錄結(jié)果 高濃度血清可影響光吸收值 在加入異丙醇溶液或DMSO前盡量吸凈培養(yǎng)液 吸去培養(yǎng)液時(shí)動(dòng)作要慢 以免吸去形成的結(jié)晶 1 5細(xì)胞凍存和復(fù)蘇 Spallanzani 1776 最早發(fā)表了 冷 處理對 細(xì)胞 生命活動(dòng)影響的報(bào)道 1900年前后 科學(xué)家基本上肯定了生物成分 如精子 能夠在零下溫度貯存的事實(shí) Polge等人 1949 發(fā)現(xiàn)了甘油對低溫下貯存細(xì)胞的保護(hù)作用 Luyet 1951 與Lovelock 1953 等多位學(xué)者發(fā)現(xiàn)電解質(zhì)濃度增大是造成冷凍貯存細(xì)胞損傷的主要原因 Lovelock等人 1959 發(fā)現(xiàn)了一種新的化學(xué)保護(hù)劑 這就是現(xiàn)在人們熟知的二甲基亞砜 DMSO 當(dāng)前低溫液氮凍存貯存細(xì)胞已是細(xì)胞培養(yǎng)室常規(guī)性通用技術(shù) 貯存時(shí)間幾乎是無限的 細(xì)胞凍存 cryopreservation 將體外培養(yǎng)物懸浮在冷凍保護(hù)劑的溶液中 以一定的降溫速率降至零下某一溫度 70 并在此溫度下對其長期保存的過程 復(fù)蘇 thawing 以一定的復(fù)溫速率將凍存的培養(yǎng)物恢復(fù)到常溫的過程 影響冷凍效果的因素 1 冷凍速率細(xì)胞冷至 5 15 之間時(shí) 細(xì)胞外溶液先出現(xiàn)結(jié)冰而細(xì)胞內(nèi)仍保持未結(jié)冰狀態(tài) 細(xì)胞內(nèi)未結(jié)冰的水分子會(huì)向細(xì)胞外流動(dòng) 冷凍速度慢 細(xì)胞內(nèi)水分外滲多 細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)濃度增高 細(xì)胞內(nèi)不發(fā)生結(jié)冰 但脫水嚴(yán)重 細(xì)胞體積嚴(yán)重收縮 甚至使細(xì)胞失去活性 冷凍速度快 細(xì)胞內(nèi)水分沒有足夠的時(shí)間外滲 隨著溫度的下降會(huì)發(fā)生細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰 造成細(xì)胞膜及細(xì)胞器的破壞 影響冷凍效果的因素 2 冷凍保存溫度液氮溫度 196 是目前最佳冷凍保存溫度 70 80 條件冷凍保存細(xì)胞 短期內(nèi)對細(xì)胞活性無明顯影響 時(shí)間延長 細(xì)胞存活率下降 3 復(fù)溫速率是在細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)溫度升高的速度一般復(fù)溫速度越快越好1 2min內(nèi)從 196 升溫至37 水浴鍋 4 冷凍保護(hù)劑可以保護(hù)細(xì)胞免受冷凍損傷的物質(zhì) 滲透性 甘油 DMSO非滲透性 聚乙烯吡咯烷酮 PVP 蔗糖 聚乙二醇 影響冷凍效果的因素 甘油或DMSO分子量小 溶解度大 易穿透細(xì)胞 可使冰點(diǎn)下降 提高細(xì)胞膜對水的通透性 且對細(xì)胞無明顯毒性 甘油和DMSO并不能防止細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰 在使用該類冷凍保護(hù)劑時(shí) 需要一定的時(shí)間進(jìn)行預(yù)冷 慢凍程序 標(biāo)準(zhǔn)程序 采用細(xì)胞凍存器當(dāng)溫度在 25 以上時(shí) 1 2 min當(dāng)溫度達(dá) 25 以下時(shí) 5 10 min當(dāng)溫度達(dá) 100 時(shí) 可迅速放入液氮 196 C 中簡易程序 將冷凍管 管口要朝上 放入紗布袋內(nèi) 紗布袋系以線繩 通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口 按每分鐘溫度下降1 2 的速度 在40min內(nèi)降至液氮表面過夜 次晨投人液氮中 傳統(tǒng)程序 冷凍管置于4 1h 20 1h 80 16 18h 或隔夜 液氮槽長期儲(chǔ)存 低溫保護(hù)劑的應(yīng)用 在細(xì)胞凍存時(shí)加入低溫保護(hù)劑 能大大提高凍存效果 常用的低溫保護(hù)劑是二甲基亞楓 DMSO 它是一種滲透性保護(hù)劑 可迅速透入細(xì)胞 提高胞膜對水的通透性 降低冰點(diǎn) 延緩凍結(jié)過程 能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外 在胞外形成冰晶 減少胞內(nèi)冰晶 從而減少冰晶對細(xì)胞的損傷 常溫下DMSO對細(xì)胞的毒副作用較大 在4 時(shí) 其毒副作用大為減弱 凍存時(shí)DMSO平衡應(yīng)在4 下進(jìn)行 細(xì)胞凍存方法 預(yù)先配制凍存液 10 DMSO 細(xì)胞生長液 20 血清 基礎(chǔ)培養(yǎng)液 取對數(shù)生長期細(xì)胞 經(jīng)胰酶消化后 加入適量凍存液 用吸管吹打制成細(xì)胞懸液 1 5 106cell ml 加1ml細(xì)胞于凍存管中 密封后標(biāo)記冷凍細(xì)胞名稱和冷凍日期 液氮長期保存 注意事項(xiàng) 控制凍存細(xì)胞的質(zhì)量不宜將凍存的細(xì)胞放置在 20 過長時(shí)間 易引起低溫?fù)p傷凍存小管宜用塑料凍存管 保存細(xì)胞的復(fù)蘇方法 快速解凍凍存細(xì)胞從液氮中取出后 立即放入37 水浴中 輕輕搖動(dòng)冷凍管 使其在1min內(nèi) 不要超過3min 全部融化解凍后的細(xì)胞可直接接種到含完全生長培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶進(jìn)行培養(yǎng) 24h后再用新鮮完全培養(yǎng)液替換舊培養(yǎng)液 以去除DMSO如果細(xì)胞對冷凍保護(hù)劑特別敏感解凍后的細(xì)胞應(yīng)先通過離心去除冷凍保護(hù)劑 然后再接種到含完全生長培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中 準(zhǔn)備水浴取凍存管 入水浴快速晃動(dòng)至完全融化去除DMSO4 加入培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液 移入培養(yǎng)瓶培養(yǎng) 注意事項(xiàng) 盡快使細(xì)胞恢復(fù)到常溫盡快離心棄去冷凍保護(hù)液 防止對細(xì)胞的毒害 凍存和復(fù)蘇的原則 慢凍快融 冷到零度以下 細(xì)胞可以產(chǎn)生以下變化 細(xì)胞器脫水 細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高 并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶 如果緩慢冷凍 可使細(xì)胞逐步脫水 細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶 相反 結(jié)晶就大 大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜 細(xì)胞器的損傷和破裂 復(fù)蘇過程應(yīng)快融 目的是防止小冰晶形成大冰晶 即冰晶的重結(jié)晶 1 6細(xì)胞的運(yùn)輸 由于培養(yǎng)細(xì)胞株 系 的商品化 細(xì)胞培養(yǎng)室之間的交流 交換和購買已成為生命科學(xué)研究中的一個(gè)重要組成部分 培養(yǎng)細(xì)胞的運(yùn)輸成為研究工作的一個(gè)重要環(huán)節(jié) 如果不了解所要細(xì)胞的性狀 培養(yǎng)液特點(diǎn)及培養(yǎng)注意事項(xiàng) 運(yùn)輸時(shí)不注意使用特殊容器或溫度等 就可能影響細(xì)胞的生長 或出現(xiàn)差錯(cuò) 或?qū)е屡囵B(yǎng)失敗等 裝運(yùn)細(xì)胞的主要方法如下 冷凍儲(chǔ)存運(yùn)輸充液法 細(xì)胞的運(yùn)輸 冷凍儲(chǔ)存運(yùn)輸 利用特殊容器內(nèi)盛液氮或干冰的運(yùn)輸方法 保存效果較好 但缺點(diǎn)是比較麻煩 不宜長時(shí)間運(yùn)輸 多需空運(yùn) 代價(jià)較大 細(xì)胞的運(yùn)輸 充液法 一般選擇生長良好的細(xì)胞 以生長1 3 1 2瓶底壁為宜 去掉舊培養(yǎng)液 補(bǔ)充新的培養(yǎng)液至瓶頸部 保留微量空氣 擰緊瓶蓋 并用膠帶密封 放在一運(yùn)送盒內(nèi) 用棉花等做防震防壓處理 運(yùn)輸時(shí)間需4 5d 一般放在貼身口袋即可 到達(dá)目的地后倒出多余的培養(yǎng)液 只需保留維持生長所需的培養(yǎng)液置37 培養(yǎng) 次日傳代 如果在市內(nèi)運(yùn)輸或僅需數(shù)小時(shí)運(yùn)輸路程 也可將細(xì)胞附著面朝上 或把培養(yǎng)液全部倒掉放在胸部口袋運(yùn)送 靠附著于細(xì)胞表面的培養(yǎng)液 可使細(xì)胞短時(shí)間不受損 2 細(xì)胞系的建立 正常細(xì)胞系癌細(xì)胞系轉(zhuǎn)化細(xì)胞系細(xì)胞克隆 正常細(xì)胞系建立的程序 原代培養(yǎng) 第一次傳代 常規(guī)傳代 凍存和復(fù)蘇 癌細(xì)胞系建立的程序 步驟類似正常細(xì)胞系建立注意 取轉(zhuǎn)移灶組織癌細(xì)胞 癌最外層組織去除癌組織中的間質(zhì)細(xì)胞 膠原酶法 細(xì)胞系的維持 細(xì)胞系檔案要記錄好 組織來源 培養(yǎng)基要求 傳代時(shí)間等 傳代換液有規(guī)律 否則會(huì)引起生物學(xué)特性改變 多種細(xì)胞維持傳代 要防止交叉污染 要有充足的凍存儲(chǔ)備 防止因污染造成絕種 細(xì)胞暫時(shí)不用 最好凍存 以免老化或性狀改變 證明細(xì)胞系的種系 人源 鼠源或其他 染色體分析 同工酶分析 DNA指紋技術(shù)明確細(xì)胞系的組織來源 檢測細(xì)胞抗原標(biāo)記的方法細(xì)胞是否是正常細(xì)胞 有無發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化 正常細(xì)胞二倍體特征 惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞為異倍體細(xì)胞有無交叉污染 同工酶方法 DNA指紋技術(shù)也可以鑒定 鑒定細(xì)胞系的內(nèi)容 3 細(xì)胞培養(yǎng)物的固定 染色 培養(yǎng)物的常用固定方法染色方法 2 1常用固定方法 固定細(xì)胞的目的 把組織和細(xì)胞的原有結(jié)構(gòu)盡可能完整地保存下來 避免組織和細(xì)胞發(fā)生降解 自溶 腐敗和變形等 使細(xì)胞的化學(xué)物質(zhì)和酶能準(zhǔn)確定位 使細(xì)胞的各部分易于著色 適于觀察 長期保存和分析 2 1常用固定方法 固定細(xì)胞的原則 盡可能選用新鮮培養(yǎng)物 根據(jù)檢測工具 對象 目的和要求選擇固定劑和固定方法 培養(yǎng)物的準(zhǔn)備和固定前處理各種細(xì)胞培養(yǎng)物 雙蓋片懸滴和懸液培養(yǎng)物 離心 PBS漂洗2 3次 固定制片 蓋片單層培養(yǎng)物 蓋片從培養(yǎng)器中取出 PBS漂洗2 3次 固定 常用固定液 簡單固定液 甲醇 乙醇 醋酸 甲醛 戊二醛 丙酮 苦味酸 鉻酸 重鉻酸鉀 氯化汞 氯化鎘 鋨酸混合固定液 Mueller固定液 Flernming固定液 FAA固定液 Carnoy固定液 Rossman固定液 Altmann固定液 Bouing固定液 常用固定液 FAA固定液 90ml80 的酒精中加入冰乙酸和40 甲醛各5mlCarnoy固定液 60ml純乙醇中加入氯仿30ml及冰乙酸10mlBouing固定液 75ml飽和苦味酸 100ml水中加入1 2 1 4g 過濾 加入25ml福爾馬林 40 甲醛 有沉淀時(shí)禁用 再加入5ml冰醋酸 最好用前加 4 多聚甲醛 PBS 50ml蒸餾水中加入4g多聚甲醛 加熱至60 70oC 邊攪拌邊逐滴加入2M的NaOH至液體清澈透明 用1M的HCl調(diào)pH至7 4 冷卻后加入10mM的PBS至100ml鋨酸 在棕色試劑瓶中加入50 100ml的0 1MPBS pH7 0 7 4 再將裝有1g鋨酸的安培瓶放入 擊碎安培瓶 搖晃使鋨酸溶解 2 2染色方法 染色是利用化學(xué)染料與細(xì)胞及各種細(xì)胞器發(fā)生化學(xué)作用和 或吸附作用 使各種細(xì)胞結(jié)構(gòu)能夠通過染色而改變其折射率 從而清晰的顯現(xiàn)出來 影響因素 所用的固定液染液的pH值 組織的酸性成分用pH偏高的染液 堿性成分用偏酸染液 1 Giemsa染色 簡便 快速 適用于多種細(xì)胞和染色體染色染色液現(xiàn)用現(xiàn)配 保存時(shí)間最好不超過48h Giemsa液對pH敏感 母液制備 Giemsa粉0 5g 甘油22ml 在研缽內(nèi)將少量甘油和Giemsa粉混合研磨至無顆粒 加入剩余甘油 56oC保溫2h 加入33ml甲醇 棕色瓶保存 1 Giemsa染色 染色步驟 蓋片培養(yǎng)或涂片法 1 Sorensenbuf和Giemsa染液9 1體積比混合即得到染色液2 用甲醇固定細(xì)胞標(biāo)本10min 或醋酸 甲醇 1 3 固定30min3 用滴管將染色液布滿材料面 不要有氣泡 4 染色10 15min 用自來水將玻片沖洗干凈 空氣干燥 二甲苯透明5 光學(xué)樹脂膠封片后觀察結(jié)果 細(xì)胞核染成紫紅色或藍(lán)紫色 胞漿染成粉紅色 2 蘇木精 伊紅染色 染液制備 1 蘇木精染液 20 蘇木精0 5g 銨礬 NH4 2SO4Al2 SO4 324g H2O50ml NaIO30 5g 甘油30ml 冰醋酸2ml 2 1 伊紅染液 1g伊紅溶于100ml蒸餾水 2 蘇木精 伊紅染色 染色步驟 蓋片培養(yǎng)法 1 37oC溫PBS中漂洗3次 每次20 60sec 中性福爾馬林固定30min2 蒸餾水漂洗1次 用蒸餾水稀釋的1 蘇木精染液染色10min 自來水洗后置入1 NaHCO3中漂洗至藍(lán)紫色3 伊紅水溶液中染0 5 1min 蒸餾水洗后迅速通過丙酮2次 每次3 5min4 通過2 1和1 2丙酮 二甲苯各3次 每次1 2min 純二甲苯5 10min5 用光學(xué)樹膠封片 注意勿將蓋片的細(xì)胞面放反 后觀察結(jié)果 細(xì)胞核染成紅色 胞質(zhì)染成藍(lán)紫色 3 吖啶橙染色 吖啶橙 acridineroange AO 常用熒光染料 可用于活細(xì)胞 固定細(xì)胞染色 可與細(xì)胞中DNA和RNA結(jié)合而發(fā)出不同顏色的熒光 DNA亮綠色 RNA橘紅色至火紅色 快速 簡便 并有一定特異性 染液配制 用生理鹽水將AO配成1 的母液 冰箱保存 用時(shí)則0 1M的PBS pH4 8 稀釋成0 01 工作液 3 吖啶橙染色 染色步驟 蓋片培養(yǎng) 1 Hank s液洗蓋玻片上的貼壁細(xì)胞3次2 用95 乙醇固定細(xì)胞標(biāo)本15 30min 濾紙吸干3 1 醋酸作用30sec PBS清洗1min4 用0 01 的AO染液染色1 5min PBS清洗1min5 0 1MCaCl2分色0 5 2min PBS清洗3次 每次數(shù)秒6 1 1的甘油 PBS封片 立刻觀察 用激發(fā)波405的濾光片 4 免疫熒光染色 原理 用熒光素標(biāo)記已知抗體或抗原 檢查細(xì)胞或組織標(biāo)本中相應(yīng)的抗原或抗體 在熒光顯微鏡下 抗原抗體特異性結(jié)合部位的熒光素受激發(fā)光照射而發(fā)出明亮的熒光 熒光素 異硫氰酸熒光素 FITC 發(fā)射熒光波長為490 619nm 黃綠色熒光 四乙基羅丹明 RB200 發(fā)射熒光波長為540 660nm 橙紅色熒光 4 免疫熒光染色 染色步驟 間接熒光染色法 1 用95 乙醇固定單層細(xì)胞標(biāo)本10 30min 或冷丙酮固定5 10min PBS洗3次 每次5min 邊洗邊震蕩2 滴加未標(biāo)記的一抗液 37oC濕盒中30min PBS洗3次 每次5min 邊洗邊震蕩3 滴加熒光標(biāo)記二抗 37oC濕盒中30min PBS洗3次 每次5min 邊洗邊震蕩4 去除玻片周圍及材料上的水分5 熒光顯微鏡下觀察 5 細(xì)胞活體染色 臺(tái)盼藍(lán) 用Hank s液配制0 1 臺(tái)盼藍(lán)溶液用等比的0 5 胰酶和0 2 EDTA混合液消化貼壁細(xì)胞加入適量Hank s液制成細(xì)胞懸液 每ml懸液中加入0 1 的臺(tái)盼藍(lán)溶液10ul并混勻細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞中的活細(xì)胞 折光性強(qiáng)且不著色 和死細(xì)胞 染為藍(lán)色 數(shù)目 6 細(xì)胞骨架染色 微絲 PBS洗蓋片培養(yǎng)的細(xì)胞3次 每次0 5min2 的甲醛 PBS液固定3min0 5 的三硝基甲苯 PBS處理3次 每次10min PBS漂洗3次用羅丹明 rhodamine 標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽 phalloidin 1 10 室溫中反應(yīng)15min PBS漂洗3次60 甘油 熒光防淬劑封片后熒光顯微鏡觀察 6 細(xì)胞骨架染色 微管 PBS洗蓋片培養(yǎng)的細(xì)胞3次 每次0 5min3 的甲醛 PBS液室溫固定20min0 5 的三硝基甲苯 PBS處理3次 每次10min PBS漂洗3次 最后用濾紙吸干多余的PBS投入冷丙酮中 10 20oC 7min PBS漂洗3次 最后用濾紙吸干多余的PBS 6 細(xì)胞骨架染色 微管 向一干凈平皿中央滴一滴濃度為0 1 0 2mg ml的一級抗微管蛋白抗體 令小蓋片細(xì)胞面向下扣在抗體液上 將平皿置37oC溫箱中45 60min 加水盒 向平皿中緩緩加入PBS 浮起蓋片并用鑷子夾出 PBS漂洗3次 最后用濾紙吸干多余的PBS向另一干凈平皿中央滴一滴熒光標(biāo)記的二抗 0 1 0 2mg ml 然后同操作 和 滴甘油 PBS 1 9 pH8 5 少許于載物片上 把小蓋片的細(xì)胞面覆以大蓋片上 并熒光顯微鏡觀察 4 顯微鏡觀察 3 1光學(xué)顯微鏡 成像原理 光線自反射鏡折射入聚光器F1增強(qiáng)后照射在標(biāo)本上 標(biāo)本的像經(jīng)物鏡放大成倒像F2 目鏡將此物象進(jìn)一步放大在人眼視網(wǎng)膜上成正像F3 構(gòu)造 機(jī)械部分 照明部分 光學(xué)部分 光學(xué)顯微鏡的種類 光學(xué)顯微鏡觀察的一般過程 普通光學(xué)顯微鏡相差顯微鏡熒光顯微鏡暗視野顯微鏡偏振光顯微鏡 干涉顯微鏡掃描隧道顯微鏡原子力顯微鏡視頻顯微鏡共聚焦顯微鏡 1 相差顯微鏡 調(diào)節(jié) 1 將顯微鏡合軸 并把視野圈開大至與聚光器光闌邊緣一致2 將與物鏡放大倍數(shù)一致的相板放入聚光器中3 把調(diào)中目鏡換到目鏡筒中 旋動(dòng)調(diào)中目鏡上的調(diào)焦環(huán)至相板相環(huán)的圖像清晰 分別是兩個(gè)明暗不同的圓形圖像