薄層色譜技術.doc

包括制板、點樣、展開、顯色、檢測等。（一）制板方法：涂布法、傾注法、浸潤法、噴涂法。這里介紹傾注法：1、清板：載板是表面平滑的玻璃板，矩形，規(guī)格根據(jù)需要定，常見有：515；520；820；1020；2020等。同玻璃儀器洗滌方法洗凈、晾干或烘干、用乙醇擦凈。2、調漿：稱一定量吸附劑于研缽中（0、3mm薄層100平方厘米需硅膠G1克三氧化二鋁1、2克），加2倍量水（先加部分，迅速研磨，再倒入全部水），研磨至漿液剛粘稠時進行涂布。注意：掌握加水量；研磨動作適中，防止產生氣泡；掌握漿液的涂布“火候”。3、涂布：將漿液沿玻棒倒于板的一端，并將這端提起，用玻棒帶動吸附劑涂遍整板迅速震拍使厚薄均勻，平放、晾干（10-15分鐘）。這一步是關鍵，要求涂布好的薄層，厚薄均勻、表面平滑、沒有氣泡波紋、牢固不易脫落。4、活化：風干后的薄層板直接放于烘箱中烘干或放在干燥鋁架上烘干。烘干溫度與時間視需要定，一般硅膠板在105下烘1小時，三氧化二鋁板在200-220下烘4小時?；罨蟮谋影鍍Υ嬖诟稍锲鲀纫恢芎髴硇谢罨?。（二）點樣這是關鍵的操作，只有原點足夠小，形狀規(guī)則，才有可能得到較高的分離度和靈敏度。要求：點樣精確、迅速（不超過10分鐘）；斑點集中（溶劑擴散直徑不超過3mm）；各點大小一致，在同一起始線上。工具：微量注射器或定體積毛細管。操作：刀片刮去薄層板邊緣的吸附劑；作出起始線和溶劑前沿記號（起始線距底端2-3厘米，前沿視展距而定）；用注射器點樣，點與點間距1、0-1、5厘米，點與邊緣距離0、5厘米。注意：板不得點破；點樣體積少于2微升；點樣量幾至幾十微克；邊點邊用洗耳球吹風以去溶劑；點樣時間長時要在干燥盒內點樣。（三）展開方法：上行法、下行法、園形離心法、園形向心法、程序多級展開法等，最多的是上行法。裝置：展開 （立式、臥式）（內襯濾紙，以使溶劑揮發(fā)）。方法：1、內加適量展開劑，加蓋密閉10分鐘，使內溶劑蒸汽飽和。2、將薄層板點有樣品液的一端浸入展開劑中（5-7mm）。蓋好蓋子（注意展開劑不得浸沒樣點、浸沒部分要與起始線平齊）。3、展開到達溶劑前沿時取出薄層板揮干溶劑。注意：展開劑用過1-2次后要更換，因底劑與洗脫劑的比例已改變；展開過程中槽內要保證溶劑蒸氣飽和，以防邊緣效應。（四）顯色1、顯色劑顯色法：噴霧顯色，借助噴霧器噴細霧至板面濕潤。2、紫外線照射法：如AFTB1在WL365nm觀察；有機氯在254nm下顯色。3、對本身是有色的斑點則不需顯色。（五）定性定量1、定性：斑點顯色后量出高度，求得Rf值，通過查閱文獻鑒別各種物質。但Rf可受到外界因素的影響而使不易重現(xiàn)，這些外界因素有：吸附劑的種類及粗細度、粘合劑的性質及含量、薄層厚度、展開系統(tǒng)組成、展開槽內蒸汽的飽和程度、展距、薄層板活性及點樣量大小等。所以通常的定性方法是將樣液和標液點到同薄層上作對照。為了增加鑒定可靠性，可進行確證或更換展開系統(tǒng)。2、定量：傳統(tǒng)的方法是目視半定量法，此法簡便易行，無需貴重儀器，易于推廣。（1）最低檢出量法，用不同濃度的標準溶液點板、展開、顯觀察、反復核定在該實驗條件下標準物質的最低檢出量是多少。最低檢出量（ug）=最低檢出量時的體積（ul）*標準溶液濃度（ug/ul）將不同量的樣液與最低檢出量時的標液點板，薄層色譜分離，經顯色后觀察。如果各標準點相同位置上樣液的斑點大小、顏色深淺相同，就可以認為滴加的樣液中含有最低檢出量待測物；如果比最低檢出量點顏色深，則需稀釋，直到相同。（2）目視直接比較法：在同一薄層板上點不同體積的樣液和各種濃度的標液，展開、顯色后，用肉眼觀察比較與標準的面積大小和顏色深淺，臺兩者近似，即可以認為此樣品液體積中含待測物量與標準點中所含物質的量相同。近十年，原位直接定量有了新的