逆轉錄PCR講義.doc

逆轉錄巢式PCR（nested RT-PCR）一、實驗目的：學習RT-PCR反應的基本原理。掌握血液等液體標本中提取RNA并逆轉錄的技術。了解其他標本（如組織塊）中提取RNA的技術。二、實驗原理RT-PCR是將RNA的逆轉錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈式擴增（PCR）相結合的技術。首先經(jīng)逆轉錄酶的作用以RNA為模板合成cDNA，再以cDNA為模板擴增合成目的片段。RT-PCR技術靈敏而且用途廣泛，可用于檢測細胞中基因表達水平，細胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉錄的RNA產(chǎn)物。無論使用何種RNA，關鍵是確保RNA中無RNA酶和基因組DNA的污染。巢式PCR是一種特殊的聚合酶鏈反應(PCR)，使用兩對（而非一對）PCR引物擴增完整的片段。第一對PCR引物（外引物）擴增片段與普通PCR相似；第二對引物（內(nèi)引物）結合在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部，使得第二次PCR擴增片段短于第一次擴增。巢式PCR的好處在于如果第一次擴增產(chǎn)生了錯誤片段，則第二次繼續(xù)在錯誤片段上進行引物配對并擴增的概率極低。因此，巢式PCR特異性非常高。三、主要儀器PCR擴增儀、高速冷凍離心機/臺式高速離心機、Vortex震蕩混勻器、水平電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、電熱恒溫水浴鍋四、主要試劑TRIzol ReagentTM、AMV逆轉錄酶、RNA酶抑制劑、Taq DNA聚合酶（MgCl2）、dNTP Mixture，10 mmol/L、瓊脂糖、溴化乙錠*、DNA Marker、三氯甲烷（氯仿）、異丙醇DEPC*（焦碳酸乙二酯）處理水：加100l DEPC于100ml超純水中，使DEPC的體積分數(shù)為0.1%，室溫震蕩至少4h；然后高壓蒸汽滅菌20min。溶解RNA所需的DEPC水用無RNase的1.5ml 微量離心管分裝，-20保存；用于配置75%乙醇的DEPC水則直接置于4保存。75%乙醇溶液：取75ml無水乙醇用DEPC處理水定容至100ml，4保存。所用容器及量筒均需洗凈后200干烘8h。5TBE：Tris堿54g，硼酸27.5g，0.5mol/L EDTA（pH8.0）20ml，加蒸餾水定容至1L，室溫保存。0.5TBE緩沖液：用蒸餾水將50TBE緩沖液稀釋10倍，于室溫下保存。五、操作步驟病毒RNA的提取：1. 將待測標本、陰陽性對照取出解凍；再取出2套RNase-free（無RNase）的1.5ml微量離心管和2支RNase-free的0.5ml微量離心管，并進行標記；2. 取一套標記好的離心管，每管加入TRIzol 500l，再加入100l血清/細胞培養(yǎng)液等液體標本和對照（陰性對照最先加，標本居中，陽性對照最后加；注意將槍尖伸至TRIzol中），用Vortex震蕩混勻5sec（液體無明顯分層），室溫靜置5min；3. 每管加入氯仿100l（注意沿著管壁加液，避免液體飛濺），用Vortex震蕩混勻15sec（液體無明顯分層），室溫靜置3min；4. 4、12000rpm離心15min；待離心結束后，小心吸取上層水相至另一套標記好的RNase-free的1.5ml 微量離心管，加入等體積異丙醇（根據(jù)吸取的量估算，可適當多加一些；注意沿著管壁加液，避免液體飛濺），顛倒混勻，室溫靜置15-30min；同時，確認恒溫水浴鍋已打開；5. 4、12000rpm離心10min；待離心結束后，直接倒去上清，每管加入75%乙醇500l重懸沉淀（注意沿著管壁加液，避免液體飛濺），輕柔顛倒混勻5次；與此同時，取出特異性引物/寡核苷酸引物/隨機引物、RNasin、5RT Buffer、dNTP Mixture解凍；6. 4、8000rpm離心5min；待離心結束后，小心倒去上清；用瞬時離心機簡短離心1-2s，仔細觀察沉淀位置，沿管壁吸出底部殘余液體；室溫晾干5-10min（應防止過分干燥）；7. 最后加入20l DEPC處理水溶解RNA沉淀，直接用于后續(xù)實驗，或保存于-80備用。逆轉錄（RT）：在0.5ml RNase-free（無RNase）的微量離心管中依次加入：DEPC處理水9.0l外循環(huán)下游引物（20pmol/l）0.6lRNA酶抑制劑（40U/l）0.1l總體積9.7l再加入RNA溶液5l，70水浴5min，再冰浴5min；再依次加入：5AMV逆轉錄反應緩沖液4.0ldNTP Mixture（10mol/L）1.0lRNA酶抑制劑（40U/l）0.1lAMV逆轉錄酶（5U/l）0.2l總體積5.3l42溫育40min。巢式PCR（nested PCR）：第一輪PCR擴增體系為：10PCR反應緩沖液2.0lMgCl2（25mol/L）1.2ldNTP Mixture（10mol/L）0.2l上游引物（20 pmol/l）0.2l下游引物（20 pmol/l）0.2lTaq DNA聚合酶（5U/l）0.2lcDNA2.0ldd H2O補足反應體積至20l第二輪PCR擴增體系為：10PCR反應緩沖液2.0lMgCl2（25mol/L）1.2ldNTP Mixture（10mol/L）0.2l上游引物（20 pmol/l）0.2l下游引物（20 pmol/l）0.2lTaq DNA聚合酶（5U/l）0.2l第一輪PCR產(chǎn)物2.0ldd H2O補足反應體積至20lPCR儀擴增條件為：94 預變性 5min94 變性 30s53 復性 30s 35個循環(huán)72 延伸 40s 72 再延伸 5minPCR產(chǎn)物的檢測（瓊脂糖凝膠電泳）：1. 瓊脂糖凝膠板的制備：稱取2.0g瓊脂糖，加入100ml 0.5TBE，于微波爐中加熱融化均勻，冷卻到60-70加EB至終濃度0.5g/ml，倒入封好的凝膠槽，厚度約3-5mm，在距底板0.5-1mm的位置放置樣品梳，待冷卻成形后取出梳子及隔板，放入水平電泳槽中，緩沖液沒過膠面1-2mm即可；2. 加樣：樣品中加入1/5體積的6凝膠上樣緩沖液，混勻，取5-6l加入凝膠點樣孔中，同時加入DNA Marker；3. 電泳：100V恒壓，電泳30min，使PCR產(chǎn)物向陽極移動。待溴酚藍移至凝膠的2/3距離時，關閉電源；4. 取出凝膠，置于紫外交聯(lián)透射儀上檢測擴增條帶并在凝膠成像系統(tǒng)下拍照。首先，你要確認切膠后是否回收到了RTPCR的產(chǎn)物（方法、操作不當會導致回