三角褐指藻戶外高密度培養(yǎng)技術研究畢業(yè)論文.doc

本科畢業(yè)設計（論文）題目：三角褐指藻戶外高密度培養(yǎng)技術研究 學 院 輕工與食品學院 專 業(yè) 食品科學與工程（糖工程）學生姓名 魏 峰 學生學號 200930401131 指導教師 魏 東 教授 提交日期 2013年 06月 03日 摘 要三角褐指藻（Phaeodactytuum tricornutunm）是一種常用的海水經(jīng)濟硅藻，生長迅速，易于培養(yǎng)，富含豐富的多不飽和脂肪酸，特別是二十碳五烯酸（C20:5，EPA），是水產(chǎn)動物養(yǎng)殖的優(yōu)質餌料。目前，三角褐指藻的戶外高密度培養(yǎng)技術仍處于研發(fā)階段。為探究不同條件（環(huán)境條件和營養(yǎng)鹽）對三角褐指藻生長以及其脂肪酸組成和含量的影響，本研究用單一變量法分別對其培養(yǎng)條件進行對比優(yōu)化實驗。主要結果如下：矚慫潤厲釤瘞睞櫪廡賴。（1）選用不同鹽度的培養(yǎng)基對三角褐指藻進行戶外高密度培養(yǎng)，鹽度設定為3個梯度，20、25、30。結果表明，在鹽度為20條件下，三角褐指藻的生長狀況要優(yōu)于其他兩種鹽度，其OD值最高為0.998、細胞密度最高為6.0106個/mL、細胞干重最高為177.78mg/L。對脂肪酸的測定結果表明，25鹽度下三角褐指藻細胞的脂肪酸含量最高（124.95mg/g），20鹽度與25鹽度基本相同（123.12mg/g），而30鹽度最低（105.67mg/g）。聞創(chuàng)溝燴鐺險愛氌譴凈。（2）在20鹽度下，通入CO2控制培養(yǎng)基的不同pH值，對三角褐指藻進行戶外高密度培養(yǎng)。pH值設定為3個梯度，7.5、8.0、8.5。結果表明，控制pH8.0，三角褐指藻的生長狀況要遠好于其他兩種pH值，其OD值最高為1.045、細胞密度最高為5.8106個/mL、細胞干重最高為166.39mg/L。對脂肪酸的測定結果表明，pH值為8.5時三角褐指藻細胞的脂肪酸含量最高（145.91mg/g），pH值為8.0的稍低（134.92mg/g），pH值7.5的脂肪酸含量最低（109.76mg/g）。殘騖樓諍錈瀨濟溆塹籟。（3）在20鹽度、pH 8.0條件下，分別選用碳酸氫銨和尿素作為氮源對三角褐指藻進行戶外高密度培養(yǎng)。結果表明，分別使用碳銨和尿素，三角褐指藻的生長狀況基本相同，其最終OD值分別為0.689和0.716，細胞密度分別為3.9106個/mL和4.0106個/mL，細胞干重分別為136.11mg/L和146.11mg/L。但通過對脂肪酸的測定，結果表明當使用碳銨作為氮源時三角褐指藻細胞的脂肪酸含量最高（169.72mg/g），尿素作為氮源時脂肪酸含量則相對較低（109.76mg/g）。釅錒極額閉鎮(zhèn)檜豬訣錐。（4）在20鹽度，pH8.0，碳銨作為氮源的條件下，當培養(yǎng)基中氮耗盡時，通過一個晝夜24小時對三角褐指藻的取樣研究，結果表明，在上午10點鐘時，三角褐指藻中所積累的脂肪酸含量最高（136.15mg/g），而在其他時間段，脂肪酸的含量則相對較低。彈貿(mào)攝爾霽斃攬磚鹵廡。（5）在20鹽度，pH8.0，碳銨作為氮源的條件下，通過對三角褐指藻的一個生長周期內的氮磷同化規(guī)律研究表明，三角褐指藻戶外高密度生長過程中，對氮的需求需求量很大，平均每天要消耗10.4mg/L的碳酸氫銨。而對磷的需求則相對較小，每天平均只消耗0.13mg/L的磷酸二氫鈉。謀蕎摶篋飆鐸懟類蔣薔。關鍵詞：三角褐指藻；鹽度；pH值；氮源；脂肪酸 AbstractPhaeodactytuum tricornutunm is a commonly used seawater economic diatoms, rapid growth, easy to culture, rich in polyunsaturated fatty acids, especially eicosapentaenoic acid (C20: 5, EPA), is Aquatic animal breeding quality bait. Currently, Phaeodactylum outdoor high-density culture technology is still in development stage. To explore the different conditions (environmental conditions and nutrients) on the growth of Phaeodactylum and their fatty acid composition and content of, a single variable method used in this study were to compare their culture conditions optimization experiments. The main results are as follows:廈礴懇蹣駢時盡繼價騷。(1) selection of different salinity media on Phaeodactylum outdoor high-density culture, salinity gradient is set to 3, 20 , 25 , 30 . The results showed that under the conditions of salinity of 20 , Phaeodactylum growth conditions better than the other two salinity, its highest OD value of 0.998, the highest cell density 6.0 106 個 / mL, the highest cell dry weight was 177.78mg / L. The results show that for the determination of fatty acids, 25 salinity Phaeodactylum cell fatty acid content of the highest (124.95mg / g), 20 and 25 salinity salinity is basically the same (123.12mg / g), and 30 salt lowest (105.67mg / g).煢楨廣鰳鯡選塊網(wǎng)羈淚。(2) at 20 salinity, leads to CO2 control medium at different pH values of Phaeodactylum outdoor high-density culture. pH gradient value is set to 3, 7.5,8.0,8.5. The results show that the control pH8.0, Phaeodactylum growth conditions far better than the other two pH values, the OD values of up to 1.045, the highest cell density of 5.8 106 個 / mL, cell dry weight up to 166.39mg / L. The measurement results show that the fatty acid, pH value of 8.5 Phaeodactylum highest fatty acid content of the cell (145.91mg / g), pH 8.0 is lower (134.92mg / g), pH of the fatty acid content of 7.5 minimum ( 109.76mg / g).鵝婭盡損鵪慘歷蘢鴛賴。(3) at 20 salinity, pH 8.0 conditions, were selected ammonium bicarbonate and urea as a nitrogen source for Phaeodactylum outdoor high-density culture. The results show that the use of ammonium bicarbonate and urea, respectively, Phaeodactylum basically the same growth conditions, the final OD values were 0.689 and 0.716, the cell density was 3.9 106 cells / mL and 4.0 106 個 / mL, cell dry weight were 136.11mg / L and 146.11mg / L. But through the fatty acids measured, the results show that when using ammonium bicarbonate as a nitrogen source Phaeodactylum cell fatty acid content of the highest (169.72mg / g), urea as a nitrogen source when the fatty acid content is relatively low (109.76mg / g) .籟叢媽羥為贍僨蟶練淨。(4) at 20 salinity, pH8.0, ammonium bicarbonate as a nitrogen source conditions, when the medium is depleted of nitrogen, 24 hours a day through a pair Phaeodactylum sampling, the results showed that in the morning 10 oclock, Phaeodactylum fatty acid content 預頌圣鉉儐歲齦訝驊糴。of the accumulated maximum (136.15mg / g), while in other time periods, fatty acid content is relatively low.滲釤嗆儼勻諤鱉調硯錦。(5) in 20 salinity, pH8.0, under conditions of ammonium bicarbonate as a nitrogen source, through Phaeodactylum during the growth cycle of a law of assimilation of nitrogen and phosphorus that Phaeodactylum outdoor high-density growth in great demand for nitrogen demand, the average daily consumption of 10.4mg / L of ammonium bicarbonate. The demand for phosphorus is relatively small, the average daily consumption of only 0.13mg / L sodium dihydrogen phosphate.鐃誅臥瀉噦圣騁貺頂廡。Keyword: Phaeodactytuum tricornutunm; Salinity; pH; Nitrogen; Fatty acid擁締鳳襪備訊顎輪爛薔。目錄摘 要I贓熱俁閫歲匱閶鄴鎵騷。AbstractII壇摶鄉(xiāng)囂懺蔞鍥鈴氈淚。第一章 緒 論11.1國內外微藻及其脂肪酸研究進展1蠟變黲癟報倀鉉錨鈰贅。1.2硅藻及三角褐指藻概述21.3硅藻及三角褐指藻培養(yǎng)技術31.4影響硅藻脂肪酸組成和含量的環(huán)境因子4買鯛鴯譖曇膚遙閆擷凄。1.5本課題的研背景和意義51.6本課題的研究內容5第二章 實驗材料與測試方法72.1實驗材料與儀器72.2試驗方法72.2.1實驗室階段培養(yǎng)82.2.2戶外培養(yǎng)及采收82.3分析與測試92.3.1細胞密度、OD值和細胞干重9綾鏑鯛駕櫬鶘蹤韋轔糴。2.3.2培養(yǎng)基中氮、磷含量的測定10驅躓髏彥浹綏譎飴憂錦。2.3.3脂肪酸組成與含量的測定11貓蠆驢繪燈鮒誅髏貺廡。第三章 不同條件對三角褐指藻生長及脂肪酸積累情況探究13鍬籟饗逕瑣筆襖鷗婭薔。3.1鹽度133.1.1實驗方法133.1.2結果分析133.2 pH值163.2.1實驗方法163.2.2結果分析163.3氮源種類183.3.1實驗方法183.3.2結果分析19第四章 晝夜變化對三角褐指藻脂肪酸組成和含量的影響21構氽頑黌碩飩薺齦話騖。4.1實驗方法214.2結果分析21第五章戶外培養(yǎng)過程中細胞對氮、磷的同化規(guī)律研究23輒嶧陽檉籪癤網(wǎng)儂號澩。5.1實驗方法235.2結果分析23第五章 結果與展望24參考文獻25致 謝27第一章 緒 論1.1國內外微藻及其脂肪酸研究進展微藻是一類體積小、結構簡單、生長繁殖迅速的單細胞藻類。微藻在海洋生物生態(tài)系統(tǒng)中起著重要的作用，他們是構成海洋初級生產(chǎn)力的重要組成部分，是許多海洋動物的優(yōu)質餌料【1】。目前在地球上存活的微藻超過20萬種，微藻每年固定的CO2大約占全球凈光和產(chǎn)量的40%，在能源轉化和碳元素循環(huán)中起著舉足輕重的作用【2】。微藻種類繁多，生物量巨大，富含著豐富的、結構獨特的生物活性物質，如抗生素、類胡蘿卜素、蝦青素、藻紅蛋白、不飽和脂肪酸等在醫(yī)藥和保健品的開發(fā)應用方面具有巨大的潛力【3】。堯側閆繭絳闕絢勵蜆贅。微藻脂肪酸組成的研究多集中在多不飽和脂肪酸（PUFAs）。微藻含有大量的多不飽和脂肪酸，PUFAs由于在營養(yǎng)、保健和醫(yī)學上的重要作用，引起了人們廣泛的興趣，特別是二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA），對維護生物膜的結構和功能，防治心血管疾病、動脈硬化、癌癥、風濕關節(jié)炎等人類疾病，提高人類的記憶功能都？有明顯的效果【4】。目前海洋魚油是EPA和DHA等多不飽和脂肪酸的主要來源，但從魚油中提取PUFAs會有以下缺點：魚油中提取的PUFAs普遍膽固醇含量較高，并帶有腥味，極大地影響了產(chǎn)品的品質；魚油中PUFAs的組成和含量會隨著魚的種類、季節(jié)、地理環(huán)境等條件的變化而改變；魚油的加工工藝會降低魚油中PUFAs的產(chǎn)量，導致產(chǎn)品價格昂貴。識饒鎂錕縊灩筧嚌儼淒。其實魚類并不是PUFAs的真正生產(chǎn)者，它是通過吞食富含PUFAs的藻類后實現(xiàn)體內PUFAs的積累，因此微藻才是PUFAs真正的生產(chǎn)者【5】。早在20世紀50年代，國外就對利用微藻生產(chǎn)多不飽和脂肪酸進行了研究，迄今為止，已測定包括硅藻、紅藻、金藻、褐藻、綠藻、甲藻、隱藻、藍藻和黃藻等在內的上百種脂肪酸含量【6】。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)小新月菱形藻（Nitzschia closterium）、假微型海鏈藻（Thalssionema psendonana）、三角褐指藻（Phaeodactylum tricormutum）、小球藻（Chlorlla minutissima）等藻富含EPA。凍鈹鋨勞臘鍇癇婦脛糴。利用海洋微藻生產(chǎn)PUFAs的研究起始于20世紀80年代初期，并且多以自養(yǎng)微藻生產(chǎn)EPA和DHA為主，其中三角褐指藻、鹽生微小綠藻、紫球藻、球等鞭金藻等被認為最有可能實現(xiàn)微藻生產(chǎn)PUFAs產(chǎn)業(yè)化。微藻產(chǎn)業(yè)化培養(yǎng)主要有開放大池培養(yǎng)和密閉式光生物反應器培養(yǎng)兩種方式。目前國內外研究人員對利用微藻異養(yǎng)培養(yǎng)生產(chǎn)PUFAs進行了大量研究。Swaaf等研究了柯氏隱甲藻（Crypthecodiniumcohii）異養(yǎng)培養(yǎng)生產(chǎn)DHA，得到了11.7g/L的高產(chǎn)率【7】。微藻異養(yǎng)生產(chǎn)PUFAs具有相當好的商業(yè)應用開發(fā)前景，國際上已有Markek和Omega Tech等公司利用微藻異養(yǎng)培養(yǎng)生產(chǎn)PUFAs。我國微藻養(yǎng)殖方面發(fā)展較快，大都是采用開放式或半開放式的培養(yǎng)一些可以作為生物餌料或是食品添加劑的藻類，但是關于微藻工業(yè)化生產(chǎn)PUFAs研究得不多。恥諤銪滅縈歡煬鞏鶩錦。1.2硅藻及三角褐指藻概述硅藻是一類單細胞真核生物，硅藻與其他大多數(shù)海洋微藻不同的是它們具有一層高度硅質化的細胞壁，從而形成一個堅硬的殼體，殼體由上、下兩個半殼組合而成。硅藻的光合作用色素主要包含葉綠素a、葉綠素c和胡蘿卜素、巖藻黃素、硅藻甲黃素等，因此，硅藻的色素體會呈黃綠色或黃褐色【8】。硅藻大多以單細胞形式存在，也有兩個或多個細胞個體連結而成的其他形式的群體。硅藻的形態(tài)多種多樣，生長速度快，通常以一分為二的繁殖方法產(chǎn)生。硅藻是一類重要的海洋浮游生物，其生長分布極其廣泛，在地球上的各大海洋中，幾乎都有硅藻的蹤跡，特別是在熱帶、亞熱帶以及溫帶的大部分海區(qū)。硅藻的種類繁多，數(shù)量龐大，素有海洋的“草原”的美譽。鯊腎鑰詘褳鉀溈懼統(tǒng)庫。硅藻富含豐富的營養(yǎng)物質，易于消化，特別是脂肪酸含量非常高，硅藻是浮游動物、小魚、小蝦和貝類的優(yōu)質餌料。所以，硅藻等浮游類生物的數(shù)量多少對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)起著至關重要的影響。另外，根據(jù)許多數(shù)據(jù)顯示，微藻等海洋浮游生物每年大約可以產(chǎn)生氧氣360億噸，這個數(shù)值大約占到了地球上大氣氧含量的70%，硅藻又是這些浮游生物中最龐大的群體，可以占到海洋初級生產(chǎn)力的40%左右，所以，硅藻的作用可想而知。碩癘鄴頏謅攆檸攜驤蘞。三角褐指藻（Phaeodactytuum tricornutunm）在分類學上屬于硅藻門、羽紋綱、褐指藻目、褐指藻屬【9】。三角褐指藻的主要存在形式有三種類型，分別為卵形、梭形和三出放射形，在不同的環(huán)境條件下，這三種不同的細胞形態(tài)可以互相轉變。在正常的人工培養(yǎng)基條件下培養(yǎng)，三角褐指藻大多是三出放射形細胞和少量的梭形細胞。三出放射形細胞的長度大約為10-18微米（兩臂之間的垂直距離），細胞中心部分有一個細胞核，有1-3片黃褐色的色素。梭形細胞一般長約20微米，兩臂末端較鈍。卵形細胞長約8微米，寬約3微米，有一個硅質殼面，而缺少另一個殼面，也沒有殼環(huán)帶。三角褐指藻的繁殖通常也是一分為二的方式【10】。閿擻輳嬪諫遷擇楨秘騖。三角褐指藻是一種典型的硅藻，同時更是一種非常具有經(jīng)濟價值的海洋經(jīng)濟類硅藻。三角褐指藻富含豐富的多不飽和脂肪酸，特別是二十碳五烯酸（EPA），是許多魚、蝦和貝類幼體的優(yōu)質餌料，尤其是EPA，是這些水產(chǎn)動物所必須的營養(yǎng)物質【12】。氬嚕躑竄貿(mào)懇彈瀘頷澩。三角褐指藻易于生長，其對環(huán)境的適應范圍較廣，在9-92的鹽度范圍內都能正常生存，其最適鹽度為20-24。適溫范圍為5-30，最適溫度為18-24，即使是在0的條件下仍會有少量三角褐指藻繁殖，但如果超過了35細胞就會停止生長，最終全部死亡。三角褐指藻適應的光照強度范圍為1000-80000勒克斯，其最適的光照范圍為10000-30000勒克斯，但是如果在小型規(guī)模下培養(yǎng)三角褐指藻，切忌使用人工光源直接照射【11】。釷鵒資贏車贖孫滅獅贅。1.3硅藻及三角褐指藻培養(yǎng)技術目前國內外硅藻各種規(guī)模的培養(yǎng)方式如表1-1所示。表1-1各種硅藻培養(yǎng)技術的優(yōu)點和缺點【12】培養(yǎng)類型 示例 優(yōu)點 缺點室內 密封條件下用人工配制 可人為控制光照， 成本高培養(yǎng)基培養(yǎng) 溫度，營養(yǎng)元素； 避免污染、天敵 和其它競爭藻類戶外 用高級農(nóng)業(yè)肥料在戶外 成本低 難以控制其生長池塘中培養(yǎng) 環(huán)境封閉系統(tǒng) 封閉的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng) 可避免污染 成本高開放系統(tǒng) 池塘、水池和跑道池 成本低 容易被污染無菌系統(tǒng) 消毒玻璃培養(yǎng)皿 存活率高，不易污染 成本高，難以長期維持無菌系統(tǒng)非無菌系統(tǒng) 成本低 容易被污染連續(xù)培養(yǎng) 僅限于小規(guī)模的室內 高效，可連續(xù)生產(chǎn) 操作困難，復雜培養(yǎng) 高品質硅藻細胞 設備費用高半連續(xù)培養(yǎng) 室內或室外培養(yǎng)系統(tǒng) 簡單，效率稍高 產(chǎn)品質量不統(tǒng)一 批量培養(yǎng) 由試管到池塘培養(yǎng) 簡單、可靠、靈活 效益低，質量不統(tǒng)一，在初始接種和早期生長期間有污染風險，收獲、清潔、消毒和接種容器比較麻煩硅藻的戶外大規(guī)模培養(yǎng)主要有四大類型：大型水池培養(yǎng)、大型水箱培養(yǎng)、帶有旋轉混合器的圓形培養(yǎng)池培養(yǎng)和跑道池培養(yǎng)。目前硅藻，特別是三角褐指藻高密度戶外培養(yǎng)技術仍處于初級開發(fā)階段，國內乃至世界上都還沒有一套較為成熟的培養(yǎng)體系，也很難找到較大規(guī)模的硅藻海洋餌料生產(chǎn)實例。所以，要想實現(xiàn)其大規(guī)模高密度戶外培養(yǎng)，就必須在實際生產(chǎn)過程中對各種培養(yǎng)條件不斷地進行優(yōu)化改進。目前硅藻戶外高密度培養(yǎng)存在的主要問題就是自然環(huán)境中光照與溫度的難以控制性，以及各種污染帶來的影響。因此，本研究將對三角褐指藻的戶外高密度培養(yǎng)條件進行系統(tǒng)的優(yōu)化，以確定最適宜的培養(yǎng)條件，從而大規(guī)模的生產(chǎn)出高質量的三角褐指藻海洋餌料。慫闡譜鯪逕導嘯畫長涼。戶外硅藻大規(guī)模的培養(yǎng)產(chǎn)品目前主要是應用于水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)，作為魚、蝦和貝類幼體的餌料。硅藻是飼養(yǎng)海洋雙殼類軟體動物（蛤、牡蠣、扇貝等）的重要餌料，其富含豐富的脂肪酸，特別是EPA，是這些水產(chǎn)動物的必須營養(yǎng)物質。硅藻海洋餌料多種多樣，其中最為優(yōu)質的餌料包括角毛藻、海鏈藻和三角褐指藻等。根據(jù)目前的數(shù)據(jù)統(tǒng)計表明，在雙殼貝類的飼養(yǎng)餌料中海洋微藻類餌料的數(shù)量已經(jīng)超過了90%，其中大多數(shù)水產(chǎn)養(yǎng)殖者都選用以上3種硅藻作為首選餌料【12】。同時許多研究也表明在魚、蝦以及貝類的飼養(yǎng)過程中，如果采用多種餌料混合的養(yǎng)殖方法，通常情況下，餌料中的硅藻會被優(yōu)先攝入，這表明了硅藻餌料可以在魚、蝦以及貝類的生長過程中提供充足的營養(yǎng)，并且易于捕食，應當是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的首選餌料。諺辭調擔鈧諂動禪瀉類。1.4影響硅藻脂肪酸組成和含量的環(huán)境因子（1）硅藻自身的影響：硅藻的脂肪酸組成及含量受自身遺傳因素的影響，不同種類硅藻的脂肪酸組成差別很大。硅藻的主要脂肪酸為C14:0、C16:0、C16:1、C16:3和C20:5（EPA），以上5種脂肪酸總含量可以占到總脂肪酸的80%以上。其中飽和脂肪酸以C16:0所占比例最大，不飽和脂肪酸C16:1（n-7）、C16:3（n-4）和C20（n-3）含量較高。硅藻中C16:1（n-7）的含量要高于C16:0，并且有較高水平的EPA，C16:3（n-4）的含量也要高于其他藻類【13】。嘰覲詿縲鐋囁偽純鉿錈。（2）培養(yǎng)基主要成分氮、磷、硅的影響：培養(yǎng)基對硅藻脂肪酸組成和含量的影響主要集中在氮、磷、硅。對多數(shù)硅藻來說培養(yǎng)基中氮的含量及其來源對硅藻脂肪酸組成及多不飽和脂肪酸含量有較大影響【14】。Yongmanitchai等研究發(fā)現(xiàn)，三角褐指藻在利用銨、硝酸鹽和尿素等作為氮源時，EPA的含量分別占總脂肪酸的25.2%、10.0%、31.8%【15】。熒紿譏鉦鏌觶鷹緇機庫。磷是硅藻生長繁殖的必需元素，磷存在于單細胞藻的原生質和細胞核中，參與藻的光合作用、促進酶的活性、起調節(jié)作用等【16】。Yongmanitchai等研究發(fā)現(xiàn)，磷對三角褐指藻PUFAs的積累影響很明顯，當培養(yǎng)基中磷酸鹽的濃度在0.05-0.5g/L的范圍內對生物量的影響不大，但大于0.5g/L時，細胞則不能生長。磷酸鹽濃度在0.1-0.5g/L范圍內，EPA達到最佳水平【15】。鶼漬螻偉閱劍鯫腎邏蘞。硅是硅藻生長必不可少的營養(yǎng)元素，除了作為細胞壁結構成分外還參與光合色素、蛋白質、DNA的合成和細胞分裂等多種代謝和生長過程【17】。硅限制能夠導致硅藻脂肪酸百分比組成變化，EPA百分含量增加【18】。紂憂蔣氳頑薟驅藥憫騖。（3）溫度：溫度對硅藻中脂類種類的形成起著重要的作用，溫度變化也會導致硅藻脂肪酸組分的變化。溫度對硅藻脂肪酸的組成因種而異，總體的趨勢是隨著溫度的降低脂肪酸的不飽和度會增加，這可能是因為溫度降低，藻類會通過生產(chǎn)更多的PUFAs來保持細胞膜的流動性【19】，但當溫度降低時又會導致硅藻生長緩慢，生物量降低。（4）鹽度：鹽度對硅藻脂肪酸組成的影響也因種而異。Yongmanitchai等研究發(fā)現(xiàn)，當三角穎芻莖蛺餑億頓裊賠瀧。褐指藻的培養(yǎng)基中NaCl濃度為3-5g/L時，EPA含量保持穩(wěn)定；但當NaCl濃度超過5g/L時，EPA百分含量會迅速降低【15】。但無論哪種硅藻，當其處于不適的鹽度當中，都會產(chǎn)生一些代謝物以保護自身不受鹽分傷害并且保持與環(huán)境的滲透平衡【20】。濫驂膽閉驟羥闈詔寢賻。（5）光照強度：光照強度是硅藻培養(yǎng)中影響其生長和生化組分變化的重要元素之一。早期的研究表明，增加光照強度能刺激C16和C18不飽和脂肪酸的合成，主要是C16:2（n-6）、C16:3（n-6）、C16:4（n-3）、C18:2（n-6）和C18:3（n-3），增加光照強度還能顯著增加甘油三酯的含量【1】。光照強度對硅藻脂肪酸的組成影響因種而異，多數(shù)硅藻在低光照強度時具有較高水平的EPA，DHA含量則隨著光照強度的降低而減少【21】。銚銻縵嚌鰻鴻鋟謎諏涼。（6）pH：不同硅藻生活的最佳pH值不同，偏離最佳pH值，硅藻生長和體內有關代謝活動即受抑制，海洋硅藻生長的最佳pH值與海水的pH值相近約為8.0【22】。一些研究學者認為pH會影響光合作用中CO2的可用性和硅藻對有機碳源的利用效率，并影響培養(yǎng)基中微藻細胞對離子吸收和利用以及細胞膜的滲透性【23】。目前有關pH值對海洋硅藻脂肪酸組成和含量的影響的報道較少。擠貼綬電麥結鈺贖嘵類。1.5本課題的研背景和意義三角褐指藻是一種常見的海水經(jīng)濟硅藻，具有適應性強、易于培養(yǎng)的特點，廣泛應用于藻類生理、生態(tài)研究以及水產(chǎn)養(yǎng)殖和醫(yī)藥行業(yè)。特別是在水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)，三角褐指藻作為優(yōu)質的硅藻海洋餌料，發(fā)揮著極其重要的作用。硅藻富含豐富的高度不飽和脂肪酸（PUFAs），特別是二十碳五烯酸（20:5n-3，EPA）和二十二碳六烯酸（22:6n-3，DHA）是許多魚類幼體、對蝦幼體以及雙殼類幼蟲的所必須脂肪酸，關系到其幼蟲和幼體的生長發(fā)育及存活。EPA和DHA雖然對有些動物并非必需，但在餌料中適當添加這些物質，可以提高投喂動物的生長速度和存活率。三角褐指藻中所富含的脂肪酸中EPA所占的比重非常大【】，這就意味著三角褐指藻必將會是水產(chǎn)動物養(yǎng)殖的重要餌料，具有很大的開發(fā)和利用潛力。賠荊紳諮侖驟遼輩襪錈。硅藻中脂肪酸的組成除了受到其自身遺傳因素的控制之外，還受到很多培養(yǎng)條件的影響，例如環(huán)境因素（營養(yǎng)鹽、光照、溫度、鹽度、pH值）都可導致脂肪酸，特別是EPA含量的變化。三角褐指藻的生物技術應用及大規(guī)模的商業(yè)化生產(chǎn)仍處于初級開發(fā)階段，因此戶外高密度培養(yǎng)三角褐指藻的條件優(yōu)化研究對于其大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。塤礙籟饈決穩(wěn)賽釙冊庫。1.6本課題的研究內容三角褐指藻戶外高密度培養(yǎng)條件優(yōu)化研究，主要分為以下5部分內容：（1）三角褐指藻戶外高密度培養(yǎng)的鹽度優(yōu)化研究：在一級跑道池（2.5平方米）中，在接種密度及其他條件相同的條件下，分別用20、25和30鹽度的消毒海水配制培養(yǎng)基以培養(yǎng)三角褐指藻。通過對細胞生長速度、細胞密度以及脂肪酸的積累情況進行分析對比，確定戶外高密度培養(yǎng)三角褐指藻的最適宜鹽度。裊樣祕廬廂顫諺鍘羋藺。（2）三角褐指藻戶外高密度培養(yǎng)的pH值優(yōu)化研究：在一級跑道池（2.5平方米）中，在接種密度及其他條件相同的條件下，通過通入CO分別控制培養(yǎng)基pH在7.5、8.0和8.5以培養(yǎng)三角褐指藻。通過對細胞生長速度，細胞密度以及脂肪酸的積累情況進行分析對比，確定戶外高密度培養(yǎng)三角褐指藻的最適宜pH值。倉嫗盤紲囑瓏詁鍬齊驁。（3）三角褐指藻戶外高密度培養(yǎng)的氮源種類優(yōu)化研究：在一級跑道池（2.5平方米）中，在接種密度及其他條件相同的條件下，分別用碳銨和尿素做氮源培養(yǎng)三角褐指藻，比較氮源種類，通過對細胞生長速度，細胞密度以及脂肪酸的積累情況進行分析對比，確定戶外高密度培養(yǎng)三角褐指藻的最適宜的氮源種類。綻萬璉轆娛閬蟶鬮綰瀧。（4）晝夜變化對三角褐指藻脂肪酸組成和含量的影響研究：在接種密度及其他條件相同的條件下，用碳銨做氮源培養(yǎng)三角褐指藻直到氮源用盡，分析對比在氮饑餓條件下每3小時取樣一次，通過對細胞密度以及脂肪酸的積累情況進行分析對比一個晝夜周期中的變化情況，確定三角褐指藻合成脂肪酸與氮源濃度和晝夜變化之間的關系。驍顧燁鶚巰瀆蕪領鱺賻。（5）戶外高密度培養(yǎng)過程中細胞對氮、磷同化規(guī)律研究：在一級跑道池（2.5平方米）、二級跑道池（10平方米）、三級跑道池（40平方米）進行三角褐指藻的戶外高密度培養(yǎng)。在一個生長周期內，通過分析得出三角褐指藻戶外高密度培養(yǎng)基中氮磷含量與細胞數(shù)、OD值、細胞干重以及脂肪酸變化情況的關系。瑣釙濺曖惲錕縞馭篩涼。第二章 實驗材料與測試方法2.1實驗材料與儀器藻種：三角褐指藻由廣東海洋大學黃翔鴻教授贈與。使用培養(yǎng)基配方（終濃度mg/L）9：碳酸氫銨139.5、NaH2PO4 10、NaSiO9HO 60、EDTANa 4.35、FeSO7HO 3.25、ZnSO7HO 0.022、MnCl4HO 0.18、NaMoO2HO 0.0065、CuSO5HO 0.00975、CoCl6HO 0.01。鎦詩涇艷損樓紲鯗餳類。主要儀器與設備：見表2-1表2-1 主要儀器與設備名稱 型號 生產(chǎn)廠家鹽度計 ATC 上海淋譽貿(mào)易有限公司筆式pH計 MT-8062 Exact Instrument可見分光光度計 721 上海佑科儀器儀表有限公司生物顯微鏡 PH100 中國江西鳳凰光學集團公司電子天平 BS224S Sartorius冷凍干燥機 Modulyod Thermor Eletron Corporation氣相質譜聯(lián)用儀 6890-5975i 氨氮測定儀 HI96715 Hanna Instruments高速離心機 TDL-4013 上海安享科學儀器廠掌上離心機 20B02450江蘇省海門市其林貝爾儀器制造有限公司光照強度測定儀 1339R TaiWan微型漩渦混合儀 WH-1 上海滬西分析儀器廠有限公司2.2試驗方法本研究分別采用一級跑道池（底面積2.5平方米）、二級跑道池（底面積10平方米）、三級跑道池（底面積40平方米）進行三角褐指藻的戶外高密度培養(yǎng)條件優(yōu)化研究，每級跑道池可以達到的培養(yǎng)液水深都為20cm。櫛緶歐鋤棗鈕種鵑瑤錟。培養(yǎng)基用水都是經(jīng)過0.5微米微孔濾膜過濾并用10ppm二氧化氯消毒后方可使用（空池及器具消毒采用50ppm二氧化氯消毒）。轡燁棟剛殮攬瑤麗鬮應。培養(yǎng)基的配制及使用嚴格按照f/2培養(yǎng)基配方用量及使用方法（N、P、Si為f用量）。三角褐指藻高密度培養(yǎng)過程是由實驗室250mL三角瓶培養(yǎng)開始，當藻液數(shù)量達到6至7個18L桶時，將藻液在一級池中首先接種，然后由一級池到二級池再到三級池分為三個階段擴大培養(yǎng)，并采用培養(yǎng)與采收循環(huán)的模式，即采收后在原池中留有部分藻液繼續(xù)添加培養(yǎng)基培養(yǎng)，從而達到三角褐指藻的高密度連續(xù)培養(yǎng)的目的，降低生產(chǎn)成本。峴揚斕滾澗輻灄興渙藺。三角褐指藻戶外高密度培養(yǎng)的主要目的是獲得富含多不飽和脂肪酸（尤其是EPA）。本研究的另外一個重點就是分析對比在三角褐指藻處于氮饑餓的條件下一個晝夜周期內脂肪酸，特別是EPA的變化情況，從而找到三角褐指藻積累脂肪酸與晝夜變化之間的關系。詩叁撻訥燼憂毀厲鋨驁。2.2.1實驗室階段培養(yǎng)三角褐指藻的實驗室階段培養(yǎng)主要包括培養(yǎng)基配制、擴種以及在實驗室人工光源的條件下連續(xù)培養(yǎng)。在實驗室中三角褐指藻最初由250mL的小三角瓶的藻種要擴種培養(yǎng)到18L的飲用水大桶中，要注意的是接種前要對用具和培養(yǎng)基進行嚴格的消毒。三角褐指藻在實驗室培養(yǎng)過程中每天要保持連續(xù)光照并且不斷通入空氣進行混合攪拌。當培養(yǎng)到6-7個大桶時即可接種到一個一級池中進行戶外培養(yǎng)。則鯤愜韋瘓賈暉園棟瀧。2.2.2戶外培養(yǎng)及采收戶外培養(yǎng)主要包括三角褐指藻由一級池到三級池的戶外培養(yǎng)以及采收工作。在戶外培養(yǎng)過程中每級跑道池的接種密度要達到起始OD680在0.2到0.3之間，接種時間一般選在早上光照不強的時間，接種以及培養(yǎng)過程中添加的培養(yǎng)基使用配方與實驗室培養(yǎng)階段培養(yǎng)基配方相同，但其中碳酸氫銨、硅酸鈉、磷酸二氫鈉以及EDTA要使用工業(yè)級產(chǎn)品。脹鏝彈奧秘孫戶孿釔賻。在戶外培養(yǎng)的過程中要盡量避免生物污染，特別是變形蟲的污染，所以各個階段都要嚴格做好水體、跑道池以及使用器具的消毒工作。配制培養(yǎng)基用的海水通過自來水稀釋濃縮海水獲得。配制培養(yǎng)基之前海水要經(jīng)過微孔濾膜過濾系統(tǒng)進行過濾，并用二氧化氯進行消毒過夜，第二天方可使用。鰓躋峽禱紉誦幫廢掃減。在戶外培養(yǎng)過程中人工可以控制的培養(yǎng)條件有培養(yǎng)基水深、培養(yǎng)基鹽度以及培養(yǎng)基的pH值，這些都要根據(jù)三角褐指藻的實際生長狀態(tài)和實驗要求進行調整。培養(yǎng)過程中藻液和培養(yǎng)基的輸送都采用空氣隔膜泵進行，空氣隔膜泵使用前后要進行清洗消毒。稟虛嬪賑維嚌妝擴踴糶。三角褐指藻戶外培養(yǎng)采收時采用循環(huán)培養(yǎng)的模式，即濃縮得到的高濃度藻液進行灌裝冷藏，濃縮過程的透過培養(yǎng)液則排入培養(yǎng)池中循環(huán)使用，但培養(yǎng)液的使用最多可以持續(xù)3批次的生長周期，其一個生長周期定義為OD值由0.3一下增長到1.3以上的過程。陽簍埡鮭罷規(guī)嗚舊巋錟。采收過程采用二級過濾的采收模式，即藻液首先通過20微米的預過濾裝置除去藻液中較大的雜質，再經(jīng)過0.5微米的微濾膜組件來濃縮藻液，藻液會被擋在0.5微米的溈氣嘮戇萇鑿鑿櫧諤應。10濾膜外，而培養(yǎng)液則會通過微孔濾膜，從而達到藻液與培養(yǎng)液分離的目的。這樣通過連續(xù)循環(huán)濃縮后藻液達到預期濃度，最后將濃縮藻液灌裝后冷藏備用。鋇嵐縣緱虜榮產(chǎn)濤團藺。圖2-1 一級培養(yǎng)池圖2-2 超濾采收裝置2.3分析與測試2.3.1細胞密度、OD值和細胞干重藻液OD值得測定：在試驗階段每天早上8點和晚上6點鐘分別取樣，取樣要在藻液攪拌混合均勻的情況下用滅菌后的燒杯取藻液約50mL，取到的藻液分別裝入3個5mL懨俠劑鈍觸樂鷴燼觶騮。的比色皿中，比色皿使用前必須用蒸餾水清洗3次，在用待測藻液潤洗三次，取另外一個清洗過的比色皿裝入蒸餾水作為參照，用可見分光光度計在680納米波長的光波下測得三個平行樣的OD值并計算平均值，即為測得的藻液的OD值。要注意的是，當?shù)谝淮螠y得OD值超過0.8的時候，就要將藻液稀釋一倍再測定其OD值并乘以2，即為最終的OD值。謾飽兗爭詣繚鮐癩別瀘。細胞密度的測定：在生物顯微鏡下，通過血球計數(shù)板計數(shù)獲得，分別計數(shù)四個角與中央方格共五個方格內的細胞數(shù)，然后將數(shù)得的數(shù)值乘以5再乘以10的4次方得到的數(shù)即為每毫升藻液中所包含的細胞數(shù)，即細胞數(shù)C=X5104個/mL，細胞計數(shù)要進行3次平行計數(shù)，取平均值得到最終的細胞密度。要注意的是，當細胞數(shù)過多的時候，要對藻液稀釋適當?shù)谋稊?shù)在進行細胞計數(shù)。咼鉉們歟謙鴣餃競蕩賺。細胞干重的測定：取樣后的藻液通過4000轉的臺式離心機離心8分鐘后，棄上清，藻泥用蒸餾水清洗一次進行2次離心，再用少量蒸餾水清洗取藻泥并入2ml離心管中。上清液用7000轉掌上離心機離心10分鐘，得到的藻泥進行冷凍干燥，然后用分析天平準確稱量干燥后藻粉的質量，通過計算得出每升藻液中含有的細胞干重，G=X/0.36mg/L?，撝C齷蘄賞組靄縐嚴減。2.3.2培養(yǎng)基中氮、磷含量的測定碳酸氫銨中銨態(tài)氮含量的測定通過氨氮測定儀測得。取樣后的藻液通過4000轉的臺式離心機離心8分鐘后，取上清液，用7000轉掌上離心機離心10分鐘，得到更為澄清的上清液，稀釋10倍后，用氨氮測定儀測定其銨態(tài)氮的含量。氨氮測定儀測得的數(shù)據(jù)為銨態(tài)氮的含量，通過計算得出f/2培養(yǎng)基中碳酸氫銨所對應的測試結果為15.89ppm。麩肅鵬鏇轎騍鐐縛縟糶。尿素氮含量的測定采用丁二酮肟比色法24。需要的試劑有：（1）0.2%氨基硫脲：0.2g氨基硫脲溶于100mL；（2）丁二酮肟：0.3g丁二酮肟加入10mL強酸，濃硫酸：85%磷酸=2:3；（3）尿素標準液：準確稱取尿素0.1g，加水定容至1000mL，用時稀釋10倍，即10mg/L。測定方法為：（1）制作標準曲線：準確吸取尿素標準溶液0、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL于15mL試管中，加水定容至4mL，再加入0.2mL的0.2%氨基硫脲和0.8mL的丁二酮肟，置于沸水浴中煮沸10分鐘，取出后用流動水冷卻，加蒸餾水至10mL，用分光光度計在520nm處測吸光度（A520）。繪制標準曲線，用最小二乘法進行回歸，得到回歸方程，尿素的濃度為Y（mg/L）=40.917A520+0.1104（R2=0.997）。納疇鰻吶鄖禎銣膩鰲錟。（2）樣品測定：藻液離心后取上清液，稀釋適當?shù)谋稊?shù)，準確吸取1mL樣品，用制作的標準曲線的方法進行測定，根據(jù)回歸方程計算培養(yǎng)基中殘留尿素的含量。風攆鮪貓鐵頻鈣薊糾廟。圖2-3 丁二酮肟比色法測定尿素濃度標準曲線磷酸鹽含量的測定采用磷鉬藍比色法【16】。方法為：藻液離心后取上清液，稀釋適當?shù)谋稊?shù)，取25mL上清液與試管，加入2.0mL的混合溶液，混勻。再加入0.5mL的抗壞血酸溶液，混勻，放置10分鐘。在分光光度計上于882納米波長處測吸光值A，查標準曲線。滅噯駭諗鋅獵輛覯餿藹。圖2-4 磷鉬藍比色法測定磷酸二氫鈉濃度標準曲線2.3.3脂肪酸組成與含量的測定脂肪酸的測定，首先要配制試劑：（1）內標液：準確稱量10mg內標（C19:0），加入10mL二氯甲烷，混勻后分別分到5個2mL的離心管中，密封。鐒鸝餉飾鐔閌貲諢癱騮。（2）飽和NaCl溶液：準確稱量50gNaCl，加入200mL去離子水，混勻。（3）飽和KOH-CH3OH溶液：準確稱量6g氫氧化鉀，加入150mL甲醇，混勻。（4）BF3-CH3OH（體積比為1:4）：準確量取35mL三氟化硼加入140mL甲醇，混勻。（5）正己烷：色譜純測量方法：準確稱取10mg藻粉于10mL螺口試管中，加入100L內標液，靜止干燥，待藻粉干燥后加入2mLKOH-CH3OH溶液，75攝氏度水浴加熱15分鐘，冷卻后加入2mLBF3-CH3OH，再在75攝氏度中水浴加熱15分鐘，待冷卻后加入1mL飽和NaCl和2mL正己烷，然后渦旋1分鐘進行混勻，并在4000轉下離心8分鐘，取上清液1mL過0.22m濾膜于進樣瓶中。制作好樣品后通過高效氣相色譜儀測得各脂肪酸的組成與含量，最后進行數(shù)據(jù)分析處理。攙閿頻嶸陣澇諗譴隴瀘。第三章 不同條件對三角褐指藻生長及脂肪酸積累情況探究目前三角褐指藻的戶外高密度培養(yǎng)技術仍處于開發(fā)階段，沒有一個相對成熟的培養(yǎng)體系，也沒有比較成功的生產(chǎn)實例。為了得到一個三角褐指藻戶外高密度培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)體系，本研究將對三角褐指藻戶外高密度培養(yǎng)的主要條件進行優(yōu)化研究。研究主要包括：鹽度的優(yōu)化實驗，pH值的優(yōu)化實驗，氮源種類的優(yōu)化實驗，晝夜變化對三角褐指藻脂肪酸組成和含量的影響實驗以及三角褐指藻生長過程中氮、磷同化規(guī)律的研究實