雙波長法快速測定蛋白質(zhì)含量.doc

蘇州醫(yī)學(xué)院學(xué)報 2000 ;20 (1)39朱華亭劉繼明殷昌碩張學(xué)光(蘇州醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)研究室 ,蘇州 ,215007)摘要目的為了建立一種快速而靈敏的蛋白質(zhì)檢測方法。方法在考馬斯亮蘭法測定蛋白質(zhì)含量時 ,通過采用 590nm和 450nm雙波長代替單波長檢測 ,并以酶標(biāo)檢測儀取代紫外 -可見分光光度計作為檢測儀。結(jié)果此種改進不但提高了考馬斯亮蘭法檢測蛋白質(zhì)的靈敏度 ( 0. 127g/ ml)和檢測范圍 ( 0. 12731. 25g/ ml) ,而且使大量標(biāo)本的檢測可在一次檢測過程中完成。標(biāo)準(zhǔn)直線相關(guān)系數(shù) r2 = 0. 9965 ,表明在檢測限內(nèi) A595 / A450和蛋白質(zhì)濃度 C呈良好線形關(guān)系。結(jié)論雙波長法可作為一種快速、敏的蛋白質(zhì)檢測方法。關(guān)鍵詞蛋白質(zhì) ;定量 ;雙波長 ;考馬斯亮蘭中圖法分類R392 - 33Rapid Two - colorimetric Assay for Protein QuantitiesZhu Huating , L iu Ji ming , Yin Changshuo , et al(Depart ment of Immunology Suzhou Medical College ,Suzhou ,215007)AbstractObjectiveTo improve t he sensitivit y of t he Coomassie brilliant blue protein assay.MethodsThe Coomassie brilliant blue assay is accomplished by measurement of absorbance at 590and 450nm. To linear wit h protein concent ration by t he ratio of t he absorbance ,590 nm over 450 nm ,toreader as t he detecting equipment . ResultsThis simple process increases t he accuracy and improvessionsThis assay can be as sensitive and rapid a met hod for protein quantities.Key wordsProtein quantit y ; two - colorimet ric ; Coomassie brilliant blue考馬斯亮蘭蛋白質(zhì)定量法 ,也被稱為 Bradford本 ,能減少系統(tǒng)誤差。本實驗擬用雙波長代替單波測定法 1 。該方法具有易開展 ,快速和對蛋白質(zhì)特長 ,并用酶標(biāo)儀代替紫外 -可見分光光度計提高檢異性好 ,所以被廣泛用于蛋白質(zhì)的測定 2 。但該方測靈敏度。法也有其局限性 ,首先其檢測靈敏度較低 ,只能檢測mg級水平的蛋白質(zhì) ;其次 ,考馬斯亮蘭檢測的線性 1材料和方法范圍窄 ,在 2 10g/ ml之間 3 。鑒于其有上述缺 1. 1試劑 :考馬斯亮蘭 G - 250和結(jié)晶牛血清白蛋點 ,是否能通過方法上的改進 ,拓展考馬斯亮蘭法的白 (購自 Sigma)。其它所用試劑為分析純 ,去離子應(yīng)用范圍。在酸性條件下 ,考馬斯亮蘭染料呈紅色 ,雙蒸水作為溶劑。2 亮蘭染料和考馬斯亮蘭 -蛋白質(zhì)結(jié)合物有不同的吸 50ml 95 %乙醇中 ,再加入 100ml的濃磷酸 ( 85 %光系數(shù)。傳統(tǒng)考馬斯亮蘭法利用考馬斯亮蘭 -蛋白 W/ V) ,最后加蒸餾水至 200ml ,此染料于 4避光結(jié)合物最大吸收波長 595nm時的吸收度 A來反映可存放 6個月。臨用前 1稀釋。蛋白質(zhì)的濃度 ,而忽略了游離考馬斯亮蘭染料在此 1. 3吸收光譜測定 :將染料 1稀釋并過濾 ,在干波長下也有一定的吸收度。在 EL ISA檢測和 M T T凈試管內(nèi)加入 0. 8ml稀釋好的染料 ,再加入 0. 2ml測定中 ,常利用雙波長法來消除雜吸收的影響從而的待測樣本 ,對照品為蒸餾水 ,反應(yīng)時間至少 5min ,提高檢測的靈敏度 4 。酶標(biāo)儀可一次檢測大量標(biāo)但不超過 30min。用紫外 -可見分光光度計 (上海3國防科技預(yù)研項目 ( Y5573162)雙波長法快速測定蛋白質(zhì)含量 3but not t he absorbance of 590nm ,and replace t he UV/ V IS spect rophotometer wit h t he microplate au2t he sensitivit y of t he assay about 20 - fold ,also make a lot of samples be detected in one cycle. Conclu2而當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合時變成蘭色。因此考馬斯1. 2染料的配制 :將 100mg考馬斯亮蘭溶解在靈5540分光光度計廠 , 752C)在 460 700nm波長內(nèi) ,每10nm檢測樣品的透光率 ,換算成吸收度 ,根據(jù)吸收度 -波長繪制吸收光譜圖。1. 4蛋白質(zhì)測定 :方法同上 ,樣品和染料用量減少1/ 4。用酶標(biāo)儀 (Bio - Rad ,model550)代替紫外 -可見分光光度計作為檢測儀 ,酶標(biāo)檢測板作為反應(yīng)池 ,檢測特定波長下不同蛋白濃度產(chǎn)生的吸收度。2結(jié)果2. 1吸收光譜 : 0. 8ml稀釋的染料加入 0. 2ml5mg/ ml的牛血清蛋白 ,使考馬斯亮蘭完全與蛋白結(jié)合 ,在 360700nm內(nèi)每相隔 10nm檢測待定樣品的吸收度。根據(jù)吸收度 -波長繪制考馬斯亮蘭 -蛋白質(zhì)結(jié)合物吸收光譜 (圖 la) ;以稀釋的染料為待測樣本 ,繪制游離考馬斯亮蘭染料的吸收光譜 (圖 lb)。ACTA ACADEMIA E MEDICINA E SU ZHOU 2000 ;20 (1)從吸收光譜圖可知 ,考馬斯亮蘭 -蛋白質(zhì)結(jié)合物的最大吸收波長為 590nm ,考馬斯亮蘭染料的最高吸收波長為 460nm ,590nm波長下游離考馬斯亮蘭染料也有較高的吸收度 ,而 460nm處染料 -蛋白質(zhì)結(jié)合物無吸收度。2. 2蛋白質(zhì)檢測的線性范圍 :為了適合酶標(biāo)儀濾光片的檢測 ,以 595nm和 450nm作為檢測波長 ,將 BSA從 1mg倍比稀釋至 240pg/ ml ,以檢測樣品在各濃度 C時的吸收度。分別以 A595 - C ,A450 - C和 A595/ A450 -C作圖 ,觀察單波長吸收度和雙波長吸收度之比與蛋白質(zhì)濃度的線性關(guān)系。由圖 2可知 ,A595和 A595/ A450在一定范圍內(nèi)和蛋白質(zhì)濃度成正比關(guān)系 ,A450和蛋白質(zhì)濃度無正相關(guān)。A595/ A450在線性范圍內(nèi)隨蛋白質(zhì)濃度的變化比 A595靈敏。為了明確 A595/ A450雙波長法檢測范圍 ,通過局部放大作圖 3。蘇州醫(yī)學(xué)院學(xué)報 2000 ;20 (1)41從圖 3a、3b可知 ,A595/ A450雙波長法最高檢測上限的蛋白質(zhì)濃度為 32. 25g/ ml ,最低檢測下限為0. 122g/ ml ;同理作圖 3c、3d ,A595單波長檢測上限為 7. 81g/ ml ,最低檢測下限為 0. 976g/ ml。2. 3標(biāo)準(zhǔn)曲線 :在檢測限范圍內(nèi) ,以蛋白質(zhì)濃度 C為橫坐標(biāo) ,吸收度 A為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。A595/A450 - C直線關(guān)系為 y = 0. 2011x + 1. 0395 ,相關(guān)系數(shù) r2 = 0. 9965 ;A595 - C直線關(guān)系為 y = 0. 0258x +0. 4859 ,相關(guān)系數(shù) r2 = 0. 9951。表明單、雙波長測定法在檢測限內(nèi)其吸收度與蛋白質(zhì)濃度呈良好線性關(guān)系。的人為影響因素。而采用酶標(biāo)儀作檢測儀 ,所需樣3討論本實驗結(jié)果證實 ,在考馬斯亮蘭法測定蛋白質(zhì)含量時 ,采用雙波長測定法其靈敏度可提高至0. 122g/ ml ,為單波長測定法靈敏度 ( 0. 976g/ ml )的 8倍。雖然單波長和雙波長法之間線性相關(guān)系數(shù)差別不大 ,但雙波長測定法比單波長測定法具有更寬線性測量范圍。雙波長測定法比單波長測定法定靈敏度高 ,主要是由于雙波長法不但反映了考馬斯亮蘭-蛋白質(zhì)結(jié)合物的吸收度 ,而且也反映了游離染料的吸收度。在測定過程中隨著蛋白質(zhì)濃度的增加 ,游離考馬斯亮蘭染料逐漸減少 ,因此在蛋白質(zhì)濃度發(fā)生改變時 ,不但染料 -蛋白質(zhì)結(jié)合物在 595nm的品僅 100l或更少 ,而且一次可檢測大量的標(biāo)本 ,過程自動化程度較高 ,適用于樣品體積較少和大量樣品的檢測。單波長 -酶標(biāo)法靈敏度為 0. 976g/ ml ,而傳統(tǒng)考馬斯亮蘭靈敏度為 2g/ ml ,可見減少誤差會提高實際測量的靈敏度。本實驗室多次使用證實 ,通過雙波長和酶標(biāo)法相結(jié)合應(yīng)用于考馬斯亮蘭蛋白質(zhì)定量 ,不但克服了傳統(tǒng)考馬斯亮蘭蛋白定量靈敏度低、線性范圍小 ( 210g/ ml)缺點 ,而且使定量過程更加快速、簡單和重復(fù)性好。這種方法上的略為改進 ,使考馬斯亮蘭法可廣泛適用于各種要求的蛋白質(zhì)定量檢測。吸收度發(fā)生改變 ,而且游離考馬斯亮蘭染料在參考文獻595nm的吸收度也要發(fā)生變化 ,所用單采用 595nm波長的吸收度不能確切反映染料 -蛋白質(zhì)濃度的變化。在 450nm波長時 ,其吸收度 A在一定范圍內(nèi)隨蛋白質(zhì)濃度呈負(fù)相關(guān) ,主要是因為隨著蛋白質(zhì)濃度的增加 ,游離染料逐漸減少 ,所以 A595/ A450隨蛋白質(zhì)濃度變化的靈敏性比 A595更明顯 (圖 4)。在傳統(tǒng)考馬斯亮蘭測定蛋白質(zhì)含量時 ,通常以可見 -紫外分光光度計作為檢測儀 2 。其檢測池所需樣品體積至少 1ml ,因此所需的檢測樣品較多 ,浪費較大。傳統(tǒng)分光光度法在檢測過程中 ,需不斷清洗樣品池和重復(fù)檢測過程 ,其重復(fù)性勞動性多 ,易出現(xiàn)操作錯誤 ,增加了實驗的系統(tǒng)誤差和可能出現(xiàn)1Kirazov L P , Venkov L G , Kirazov EP. Comparison of t heLowry and t he Bradford protein assays as applied for proteinestimation of membrane - containing fractions. AnalBiochem ,1993 ,208 (1)442Gasparov VS ,Degtiar V G. Protein determination by bindingwit h t he dye Coomassie brilliant blue G - 250. Biokhimiia ,1994 ,59 (6)763terference in t h