大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞技術(shù).doc

大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞技術(shù)摘要： 細(xì)胞培養(yǎng)工作始于20世紀(jì)初，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)各個(gè)領(lǐng)域，成為細(xì)胞與組織研究的重要技術(shù)之一。近年來(lái)，隨著基因工程和細(xì)胞工程技術(shù)的不斷發(fā)展，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)已成為大規(guī)模生產(chǎn)一系列有商品價(jià)值的生物制品的重要宿主，當(dāng)前人們已經(jīng)能夠生產(chǎn)多種單克隆抗體、激素、細(xì)胞因子、病毒疫苗和具有特殊功能的效應(yīng)細(xì)胞等。但是，實(shí)驗(yàn)室采用的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)獲得的細(xì)胞量有限，不能滿足生產(chǎn)的需求，必修改用超產(chǎn)培養(yǎng)技術(shù)方法方可獲得大量細(xì)胞，目前這種技術(shù)種類繁多，歸納起來(lái)有三大類：貼壁培養(yǎng)法；懸浮培養(yǎng)法；固定化培養(yǎng)法。細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，為組織和器官培養(yǎng)以及現(xiàn)代生物技術(shù)前沿的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)、克隆技術(shù)、干細(xì)胞定向分化、體外受精、性別控制等一系列技術(shù)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：細(xì)胞培養(yǎng)；貼壁；懸??；固定化前言動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)開(kāi)始于本世紀(jì)初1962年，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模開(kāi)始擴(kuò)大，發(fā)展至今已成為生物、醫(yī)學(xué)研究和應(yīng)用中廣泛采用的技術(shù)方法，利用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)具有重要醫(yī)用價(jià)值的酶、生長(zhǎng)因子、疫苗和單抗等，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)已成為醫(yī)藥生物高技術(shù)產(chǎn)業(yè)的重要部分。利用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)的生物制品已占世界生物高技術(shù)產(chǎn)品市場(chǎng)份額的50%。動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)是生物技術(shù)制藥中非常重要的環(huán)節(jié)。本文對(duì)細(xì)胞的培養(yǎng)工藝做一綜述。1.細(xì)胞培養(yǎng)的定義細(xì)胞培養(yǎng)是指從體內(nèi)組織取出細(xì)胞模擬體內(nèi)環(huán)境，在無(wú)菌、適當(dāng)溫度及酸堿度和一定營(yíng)養(yǎng)條件下，使其生長(zhǎng)繁殖，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的一種培養(yǎng)技術(shù)。細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)物為單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞群。在醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)研究中應(yīng)用最廣泛的是外周血淋巴細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞和各種能在體外長(zhǎng)期生長(zhǎng)的細(xì)胞系。外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)具有時(shí)間短、技術(shù)簡(jiǎn)便、可重復(fù)取材等優(yōu)點(diǎn)，它在臨床染色體分析中使用最廣泛。體外培養(yǎng)細(xì)胞株可在培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)生自發(fā)的或在外界作用下的轉(zhuǎn)化，成為永久細(xì)胞系，也可直接建成永久細(xì)胞系，永久細(xì)胞系能在體外無(wú)限制制的傳代和生長(zhǎng)。永久細(xì)胞系通常具有非整倍體細(xì)胞和各個(gè)細(xì)胞的核型不完全相同特征。但細(xì)胞克隆的細(xì)胞系其這一特征可以不明顯。2.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝2.1貼壁培養(yǎng)法貼壁培養(yǎng)是指細(xì)胞貼附在一定的固相表面進(jìn)行單層培養(yǎng)。貼壁依賴性細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)要貼附于培養(yǎng)容器的壁上，細(xì)胞一經(jīng)貼壁就迅速鋪展，然后開(kāi)始有絲分裂，并很快進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。一般數(shù)天后就鋪滿培養(yǎng)表面，并形成致密的細(xì)胞單層。貼壁培養(yǎng)系統(tǒng)主要有滾瓶、中空纖維、玻璃珠、微載體系統(tǒng)等，其中尤以滾瓶培養(yǎng)和微載體生物反應(yīng)器培養(yǎng)更為多見(jiàn)。2.1.1滾瓶培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)貼壁依賴性細(xì)胞最初采用滾瓶系統(tǒng)培養(yǎng)。滾瓶培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)在于能增加供細(xì)胞貼壁的表面積，同時(shí)溫和的滾動(dòng)有利于細(xì)胞生長(zhǎng)。細(xì)胞接種在滾動(dòng)的圓筒形滾瓶中，培養(yǎng)過(guò)程中滾瓶不斷滾動(dòng)，在培養(yǎng)瓶滾動(dòng)時(shí)，細(xì)胞有一段時(shí)間離開(kāi)培養(yǎng)基，使細(xì)胞交替接觸培養(yǎng)液和空氣，增加了氣體的交換，有利于細(xì)胞生長(zhǎng)。滾瓶培養(yǎng)具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，投資少，技術(shù)成熟，重復(fù)性好，放大只需要簡(jiǎn)單的增加滾瓶數(shù)量等優(yōu)點(diǎn)。但滾瓶培養(yǎng)也有其缺點(diǎn)，勞動(dòng)強(qiáng)度大，占地空間大，單位體積提供細(xì)胞生長(zhǎng)的表面積小，細(xì)胞生長(zhǎng)密度低，培養(yǎng)時(shí)監(jiān)測(cè)和控制環(huán)境條件受到限制等。2.1.2微載體培養(yǎng)系統(tǒng)微載體培養(yǎng)技術(shù)于1967年被用于動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)1。經(jīng)過(guò)30余年的發(fā)展，該技術(shù)目前已日趨完善和成熟，并廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)病毒疫苗和重要蛋白質(zhì)產(chǎn)品等。微載體培養(yǎng)原理是將對(duì)細(xì)胞無(wú)害的微載體顆粒加入到培養(yǎng)容器的培養(yǎng)液中，作為載體，使細(xì)胞在微載體表面附著生長(zhǎng)，同時(shí)通過(guò)持續(xù)攪動(dòng)使微載體始終保持懸浮狀態(tài)。貼壁依賴性細(xì)胞只有貼附在固體基質(zhì)表面才能增殖，但動(dòng)物細(xì)胞無(wú)細(xì)胞壁，對(duì)剪切力敏感，所以無(wú)法靠提高攪拌轉(zhuǎn)速來(lái)增加接觸概率。通常的操作方式是在貼壁期采用低攪拌轉(zhuǎn)速，時(shí)攪時(shí)停，數(shù)小時(shí)后，待細(xì)胞附著于微載體表面后，維持低轉(zhuǎn)速（最大速度75r/min），進(jìn)入培養(yǎng)階段。我國(guó)從20世紀(jì)80年代后期開(kāi)始了細(xì)胞培養(yǎng)專用介質(zhì)的研究工作，成功地開(kāi)發(fā)了CT-1、CT-2和CT-3等適合于不同細(xì)胞系培養(yǎng)的微載體2,3。微載體法培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞有很多好處1：可在反應(yīng)器中提供大的比表面積；兼有懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)；可采用均勻懸浮培養(yǎng)；可用普通顯微鏡觀察細(xì)胞在微載體上的生長(zhǎng)情況；放大容易；適用于多種貼壁依賴性細(xì)胞培養(yǎng)；細(xì)胞收獲容易；勞動(dòng)強(qiáng)度小，占地面積小。微載體系統(tǒng)也有它的缺陷：細(xì)胞生長(zhǎng)在微載體表面，易受到剪切損傷；微載體價(jià)格比較貴；需要較高的接種細(xì)胞量。近年來(lái)，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了許多新的多孔性微載體和新的反應(yīng)器系統(tǒng)，以彌補(bǔ)微載體系統(tǒng)的不足。張孝兵等4,5以明膠為原料，用懸浮成球、甲苯制孔的方法制備了大孔明膠微載體。目前國(guó)外相繼研制了數(shù)種適合進(jìn)行微載體大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器系統(tǒng)和培養(yǎng)模式，如攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng)、旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器系統(tǒng)和灌注式生物反應(yīng)器培養(yǎng)模式等。（1）攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng) 該系統(tǒng)已有較長(zhǎng)的歷史，具備簡(jiǎn)單、實(shí)用及價(jià)格低廉等特點(diǎn)。Werner等6成功地在該系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行了肝細(xì)胞大規(guī)模擴(kuò)增的研究。（2）旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器（RCCS） RCCS既可以用于微載體大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)，又能在其中培育細(xì)胞與支架形成的三維空間復(fù)合體。至今，近百種的組織細(xì)胞均在該系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行了大規(guī)模擴(kuò)增7。 （3）灌注式生物反應(yīng)器培養(yǎng)模式 其特點(diǎn)是在細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器系統(tǒng)中安裝細(xì)胞/微載體截流裝置，培養(yǎng)中不斷加入新鮮培養(yǎng)基以及不斷地抽走含細(xì)胞代謝廢物的培養(yǎng)基，使細(xì)胞得以在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的生長(zhǎng)環(huán)境內(nèi)增殖，既省時(shí)省力，又減少了細(xì)胞發(fā)生污染的機(jī)會(huì)，可以提高細(xì)胞密度在10倍以上8。在生物反應(yīng)器中用微載體大規(guī)模培養(yǎng)貼壁細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞經(jīng)消化進(jìn)行傳代，操作很復(fù)雜?，F(xiàn)在已有不經(jīng)消化直接進(jìn)行微載體間細(xì)胞轉(zhuǎn)移的成功報(bào)道，通常稱為“球轉(zhuǎn)球”。張立等9用球轉(zhuǎn)球方法，以5LCelliGen細(xì)胞培養(yǎng)用生物反應(yīng)器作法，在國(guó)產(chǎn)50LCellCul-50A細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器中培養(yǎng)Vero細(xì)胞，通過(guò)換液和灌注的方法，培養(yǎng)8天，細(xì)胞密度達(dá)1.2107個(gè)/ml，然后接種狂犬病毒，連續(xù)培養(yǎng)10天，病毒滴度超過(guò)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。另外，用這種球轉(zhuǎn)球方法，放大培養(yǎng)雞胚細(xì)胞生產(chǎn)法氏囊病毒液獲得了成功10。2.1.3巨載體培養(yǎng)巨載體培養(yǎng)，是相對(duì)微載體和細(xì)胞而言的。在這種培養(yǎng)方式中，細(xì)胞雖然也像微載體一樣貼附于固定的表面生長(zhǎng)，但巨載體在生物反應(yīng)器中是固定的，不因?yàn)閿嚢瓒S培養(yǎng)液一起運(yùn)動(dòng)。2.2懸浮培養(yǎng)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)是指在反應(yīng)器中自有懸浮生長(zhǎng)的過(guò)程。懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)主要用于非貼壁依賴性細(xì)胞的培養(yǎng)。雜交瘤細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)是研究得最廣泛和透徹的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程，培養(yǎng)規(guī)模最大，操作最成熟。近年來(lái)，隨著無(wú)血清培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的貼壁依賴性細(xì)胞被馴化適合于無(wú)血清懸浮培養(yǎng)，例如重組CHO細(xì)胞和BHK細(xì)胞的大規(guī)模懸浮培養(yǎng)都獲得了成功11。2.3固定化培養(yǎng)固定化培養(yǎng)是將動(dòng)物細(xì)胞與水不溶性載體結(jié)合起來(lái)，再進(jìn)行培養(yǎng)的方法。細(xì)胞固定化的制備方法很多包括吸附法、共價(jià)貼附法、離子/共價(jià)交聯(lián)法、包埋法、微載體法、自絮凝發(fā)等。（1）吸附法 用固體吸附劑將細(xì)胞吸附在其表面而使細(xì)胞固定化的方法。（2）共價(jià)貼附法 利用共價(jià)鍵將動(dòng)物細(xì)胞與固相載體結(jié)合的固定化方法。（3）離子/共價(jià)交聯(lián)法 雙功能試劑處理細(xì)胞懸浮液，在細(xì)胞間形成橋而絮結(jié)產(chǎn)生交聯(lián)作用的方法。（4）包埋法 將細(xì)胞包埋在多孔載體內(nèi)部制成固定化細(xì)胞的方法。（5）微載體法12 用一層親水的半透膜將細(xì)胞包圍在珠狀的微囊里，細(xì)胞不能逸出，但小分子物質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可自由出入半透膜的方法。（6）自絮凝發(fā)13 許多哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，特別是在無(wú)血清培養(yǎng)下，具有相互聚集、形成細(xì)胞團(tuán)的傾向。利用細(xì)胞的這一特性，可以采用沉降或過(guò)濾的手段，是細(xì)胞團(tuán)截流在攪拌培養(yǎng)系統(tǒng)中，起到類似于微載體和多孔微載體的作用，結(jié)合細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的檢測(cè)成，提高機(jī)體對(duì)礦物質(zhì)和微量元素的利用率 產(chǎn)生消化酶提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用率。和控制，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞高密度長(zhǎng)期培養(yǎng)和產(chǎn)物高效生產(chǎn)的方法。3.發(fā)展前景現(xiàn)利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)可以產(chǎn)出多種生物制品，如：狂犬病、小兒麻痹癥等病毒疫苗，表皮生長(zhǎng)因子等生長(zhǎng)因子，激素、干擾素、白細(xì)胞介素等生物調(diào)節(jié)劑，單克隆抗體及酶制劑等。細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)已成為必然趨勢(shì)，大規(guī)模生產(chǎn)細(xì)胞技術(shù)將的到廣泛應(yīng)用。參考文獻(xiàn)1 李雨田,陳因良,丁健椿.細(xì)胞培養(yǎng)專用微載體M.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,1993:12202 張書(shū)元,徐殿勝,王國(guó)政.用于培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞微載體的制備J.華東化工學(xué)院學(xué)報(bào),1989,15:143 陳因良,李雨田,張書(shū)元,等.小牛皮提取的膠原-微載體用于動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)J.生物工程學(xué)報(bào),1992,8:1571634 趙孝兵,張?jiān)d,李雨田.大孔明膠微載體的制備J.華東理工大學(xué)學(xué)報(bào),1997,23:412416,4215 趙孝兵,張?jiān)d.用大孔明膠微載體培養(yǎng)Vero細(xì)胞J. 華東理工大學(xué)學(xué)報(bào),1997,23:4174216 Werner A,Duvar S,Muthing J.Cultivation of immortalized human hepatocytes HepZ on macroporous CultiSpher GmicrocarriersJ.Biotechnol Bioeng,2000,68:59707 Mitteregger R,Vogt G,Rossmanith E,et al.Rotary cell culture system(RCCS):a new method for cultivating hepatocytes on microcarriersJ.Int J Artif Organs,1992,22:8168228 Oh D J,Choi S K,Chang H N.High-density continuous cultures of hybridoma cells in a depth filter perfusion systemJ.Biotechnol Buoeng,1994,44:8959019 張立,嚴(yán)春,范衛(wèi)民,等.Vero細(xì)胞的微載體培養(yǎng)放大過(guò)程中的接種工藝J.華東理工大學(xué)學(xué)報(bào),1998,24:65966310 Zhang L,Zhang Y,Yan C,et al.The culture of chicken embryo fibroblast cells on 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導(dǎo)言 200年前，愛(ài)德華詹納第一次引種牛痘病毒抵御天花病毒，這是人們歷史上唯一一次非常成功的公眾健康干預(yù)事例。這種方法起源于英國(guó)格洛斯特郡，在農(nóng)場(chǎng)周圍被廣泛使用，最終在70年代末引起一場(chǎng)全球性消滅天花的運(yùn)動(dòng)的發(fā)生。雖然自然感染的天花病毒已由于人們的免疫接種而被消滅，但人們對(duì)牛痘病毒以及天花病毒牛痘疫苗的興趣并沒(méi)有消失。在過(guò)去的三十年中，研究人員通過(guò)各種實(shí)驗(yàn)室手段，發(fā)現(xiàn)并獲得一株高度減毒的、安全性能明顯提高的新型病毒。與此同時(shí)，牛痘基因組因其高度的復(fù)制能力和載體功能，被病毒學(xué)家視為生產(chǎn)多種病原微生物疫苗的首選。1.正痘病毒抗原交叉反應(yīng)和推廣戰(zhàn)略痘病毒分為8個(gè)屬。其中人們最感興趣的正痘病毒屬包括：天花病毒，即痘病毒的代表性病毒；牛痘病毒，即詹納最先使用的疫苗；疫苗毒，在19世紀(jì)的某些期已取代牛痘病毒成為首選的免疫制品。由于正痘病毒屬病毒蛋白結(jié)構(gòu)天然具有高度的保守性，因此由VACV可為其它多種正痘病毒例如猴痘病毒的感染，提供交叉保護(hù)。痘病毒具有大型的基因組（130,000-375,000個(gè)核苷酸），因其允許插入和表達(dá)外來(lái)的大型基因，使得它們成為理想的基因工程苗載體。痘病毒復(fù)制周期中的許多特點(diǎn)都將影響其作為疫苗在使用中的功效。復(fù)制起始階段，病毒核芯進(jìn)入細(xì)胞，早期基因轉(zhuǎn)錄的結(jié)果將產(chǎn)出一系列免疫調(diào)節(jié)蛋白，可封阻機(jī)體抗病毒反應(yīng)程序的啟動(dòng)，包括IFN的作用。經(jīng)過(guò)現(xiàn)代研究表明，敲除或修改這些病毒基因是修改病毒疫苗毒力的一種非常有效的手段。在其后的復(fù)制周期中，具有傳染性的病毒粒子即可產(chǎn)生具有牛痘疫苗效果的病毒蛋白，并在病毒粒子成熟后從病毒的囊膜表面釋放出來(lái)。通過(guò)基因敲除技術(shù)，改變病毒囊膜表面的特定蛋白（如B5R）也可以減弱病毒疫苗的毒力。2.全球消滅天花運(yùn)動(dòng)前牛痘苗的發(fā)展在人類對(duì)抗天花歷史上，1000年前已有人進(jìn)行人痘接種(Radetsky,1999)。人們從天花病人的膿胞液中獲取天花病毒，經(jīng)吹入法或劃痕法給人群接種，這種方法雖會(huì)引起嚴(yán)重的局部反應(yīng)、周身皮疹和全身癥狀，但它將由感染天花而導(dǎo)致的人群死亡率由20-30%降至0.5-2%。盡管并發(fā)癥的發(fā)生幾率比較高，但人痘接種還是被普遍的應(yīng)用，直至19世紀(jì)初期。因?yàn)槎徊《緦俪蓡T的抗原都具有較高的同源性，所以經(jīng)免疫后，人類幾乎可以抵抗任何痘病毒屬病毒的攻擊。17世紀(jì)后期，愛(ài)德華詹納發(fā)現(xiàn)牛痘可以幫助人們預(yù)防天花。自從人們發(fā)現(xiàn)牛痘接種比人痘接種要安全以后，牛痘接種很快成為了最主要的免疫手段。隨著時(shí)間的流逝，牛痘病毒疫苗已經(jīng)取代了人痘疫苗成為免疫的主要制劑。眾所周知，牛痘病毒疫苗在遺傳上與人痘病毒和天花病毒皆有所不同，雖然它與馬痘極其相近，但它的起源我們無(wú)從得知。詹納的牛痘病毒是第一代痘病毒的代表。3.第一代牛痘疫苗和全球消滅天花運(yùn)動(dòng)人類是唯一一個(gè)已知的天花病毒的自然宿主。正是由于這個(gè)原因以及牛痘疫苗的確切功效，使得人們?cè)?966年加緊了全球消滅天花計(jì)劃。這項(xiàng)計(jì)劃的基本策略是在每個(gè)地區(qū)建立監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，防止暴發(fā)流行。由于這些措施的有效實(shí)施，天花的發(fā)病率逐年降低，最后一個(gè)自然感染的天花病例出現(xiàn)在1977年的索馬里。1980年5月，世界衛(wèi)生大會(huì)發(fā)表聲明，世界將不會(huì)再有自然發(fā)病的天花病人（Rotz.等人,2001; Wehrle，1980）。1982年，在美國(guó)唯一一家允許生產(chǎn)牛痘疫苗的廠家停止生產(chǎn)一般用牛痘疫苗，1983年普通人群也停止了疫苗的使用。在消滅天花病毒計(jì)劃實(shí)施期間，這些疫苗的大多數(shù)是在活的綿羊、水牛及兔子的皮膚上生產(chǎn)的(Anon.,2002)。在消滅天花計(jì)劃過(guò)程中應(yīng)用了許多病毒毒株。美洲和非洲西部用的是紐約市衛(wèi)生局的毒株（NYCBH）。這個(gè)計(jì)劃的相關(guān)研究一直在惠氏公司的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，并持續(xù)到2007年8月前。Dryvax是唯一在美國(guó)可以有限制使用的商品化牛痘苗(Rosenthal et al.,2001)。Dryvax牛痘苗是以NYCBH為生產(chǎn)毒株，感染小牛