【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）馬鈴薯四倍體栽培種莖段組織的EMS誘變研究蔬菜學(xué)碩士論文

密級(jí)： 論文編號(hào)： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩士學(xué)位論文 馬鈴薯四倍體栽培種莖段組織 的 變研究 on in on in I 摘 要 誘變育種是解決育種資源不足的一種有效的育種技術(shù)?；瘜W(xué)誘變劑 用于活或失活基因功能，經(jīng)過(guò)篩選和鑒定，能夠創(chuàng)造或改良作物的性狀。這種方法在許多作物上已有運(yùn)用并育成品種。由于多倍體染色體間更為復(fù)雜的互作，多倍體作物的誘變效率尚不確定 。本研究通過(guò)誘變劑 理馬鈴薯四倍體栽培種的莖段組織，探討 馬鈴薯四倍體（ 4X）的誘變效果。 試驗(yàn)中，以馬鈴薯四倍體栽培種（ 管苗帶頂芽、腋芽、側(cè)隱芽的莖段組織和愈傷化莖段組織為試驗(yàn)材料，研究了 理的誘變效應(yīng)，對(duì)處理后代的試管生長(zhǎng)和大棚生長(zhǎng)進(jìn)行了跟蹤觀(guān)察及群體分析。試驗(yàn)結(jié)果如下： 1. 濃度 1%的 液對(duì)中薯 2 號(hào)馬鈴薯栽培種莖段組織具有誘變效應(yīng)。誘變劑 夠進(jìn)入莖段組織中，使側(cè)隱芽及周?chē)M織呈現(xiàn)白化，數(shù)天后從白化組織中再生出綠色小芽。使側(cè)腋芽呈現(xiàn)部分白化，腋芽經(jīng) 歷一個(gè)生長(zhǎng)減慢或停滯的時(shí)期，在 20 50d 內(nèi)逐步恢復(fù)生長(zhǎng)速度。不同品種對(duì)誘變劑的耐受能力不同，誘變后對(duì)處理的反應(yīng)也不同。經(jīng) 1% 察到的如下變異：植株矮化、花器官變異、葉形變異、莖色變異及薯色變異。 2. 對(duì)無(wú)性系帶側(cè)隱芽和側(cè)腋芽莖段的誘變后代群體的生長(zhǎng)發(fā)育狀況和形態(tài)色澤的觀(guān)察以及塊莖主要成分的測(cè)試統(tǒng)計(jì)分析表明：經(jīng)誘變的 4 個(gè)群體與同等條件下培養(yǎng)的對(duì)照在生長(zhǎng)發(fā)育狀況指標(biāo) 株高、莖粗、結(jié)薯數(shù)和花蕾上存在不同程度的差異；植株的莖、葉形態(tài)和色澤也有一定比例的變異。其中葉形變異在棚栽二代表現(xiàn)出可遺傳的 特性，表明 時(shí)，雖然誘變后代塊莖干物重和淀粉含量并未出現(xiàn)超常的變異范圍，但干物質(zhì)中還原糖含量表現(xiàn)出了 3 倍于正常群體的變異系數(shù)和較大的變幅，說(shuō)明 馬鈴薯四倍體誘變還原糖含量方面具有較大的育種潛力。 a) 帶側(cè)隱芽和側(cè)腋芽莖段的誘變后代兩次棚栽試驗(yàn)中都觀(guān)察到了莖色變異性狀，可以作為輔助性狀進(jìn)行觀(guān)察篩選；莖形、葉色、花蕾性狀的變化可能是性狀對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)基因的改變。由于這些性狀表現(xiàn)同時(shí)發(fā)生相關(guān)的變化，也可能反應(yīng)植株的成熟期控制基因的變化，可以用作品種成熟期變異的指示性狀。 b) 生長(zhǎng) 中遇 溫天氣條件時(shí)，對(duì)照群體中 植株發(fā)生紅斑并不能正常生長(zhǎng)， 株全株壞死，葉形變異群體中 28%發(fā)生少量紅斑，無(wú)因寒冷而死亡的個(gè)體，表現(xiàn)出了良好的抗寒性。該結(jié)果表明 時(shí)植株的形態(tài)變異可能與其他變異相關(guān)聯(lián)，有望成為潛在的指示性狀。 綜上所述，本研究證實(shí)了 用于 馬鈴薯四倍體 栽培種離體莖段組織，能夠產(chǎn)生明顯的誘變效果，具有一定的育種潛力。同時(shí)，本研究表明， 變是一種馬鈴薯育種手段的有效補(bǔ)充。 關(guān)鍵詞 馬鈴薯 組 織培養(yǎng) 變 突變體篩選 is an to in of is is of NA of of of MS in is to be to n in is In we MS to y . , MS in in of % h. as in a B5 to in MS of t in of of nt 1. We in MS a to in 0 of in 0% of 0 of 2. In of s of of of of in of so in nd in of a 3 a) In nd in in a 34C of of of g in 8% of of b) We MS is to in a in in a to a to in be as a 錄 第一章 文獻(xiàn)綜述 1 物誘變研究進(jìn)展 1 1 化學(xué)誘變劑的誘變譜 3 體細(xì)胞無(wú)性系變異 3 突 變體的篩選 4 嵌合體及其純化 5 物誘變?cè)隈R鈴薯育種上的應(yīng)用 6 項(xiàng)研究的意義和目的 7 第二章 研究材料與方法 8 究材料 8 研究方法 9 第三章 研究結(jié)果與討論 13 段胚性愈傷組織誘導(dǎo) 13 同品種對(duì)莖段胚 性愈傷組織 的反應(yīng) 13 株的不同部位愈傷誘導(dǎo)效果的差異 13 段的不同部位對(duì)胚性愈傷組織形成的影響 13 代次數(shù)對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)和再生植株的影響 14 16 處理效果 16 理不同組織的誘變效應(yīng) 16 理不同品種的誘變效應(yīng) 16 理對(duì)植株植物學(xué)形態(tài)的影響 17 理后代的田間表現(xiàn) 21 株矮化 21 官顏色變異 22 器官形態(tài)變異 23 異植株的耐低溫表現(xiàn) 23 變第 6 代（ 栽試驗(yàn)結(jié)果與分析 26 生長(zhǎng)量變異狀況分析 26 莖主要成分變異狀況分析 26 植株外觀(guān)及生育性狀變異狀況分析 28 遺傳因素和栽培因子對(duì)植株生長(zhǎng)、結(jié)薯狀況的影響 29 尖染色 31 第四章 結(jié)論與討論 32 參考文獻(xiàn) 35 致謝 40 作者簡(jiǎn)歷 41 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 1 第一章 緒 論 變研究進(jìn)展 1 誘變作用機(jī)理 損傷及生物修復(fù)系統(tǒng)的功能 自然條件下， 傷和發(fā)生復(fù)制差錯(cuò)的頻率都是很高的。 1989)對(duì)鼠肝臟因氧化作用引起的 傷作了統(tǒng)計(jì)，核基因組每 130， 000 1 個(gè)損傷，線(xiàn)粒體 每 8000一個(gè)堿基損傷。 制的錯(cuò)誤包括轉(zhuǎn)座、倒位、移碼和丟失。 988)報(bào)道 “ 制錯(cuò)誤頻率大約是 10每一個(gè)復(fù)制的基因中會(huì)出現(xiàn)一個(gè)錯(cuò)誤”。而個(gè)體突變的頻率僅為 1010因是這些錯(cuò)誤“大部分被各種 復(fù)系統(tǒng)在復(fù)制中或復(fù)制后修復(fù)”。因而，修復(fù)系統(tǒng)的高效率是物種維持遺傳穩(wěn)定的決定因素。 991)曾對(duì)高等植物除紫外修復(fù)以外的 復(fù)提 出了疑問(wèn)，原因是當(dāng)時(shí)關(guān)于修復(fù)系統(tǒng)的研究都集中在關(guān)于微生物、酵母和擬南芥上，大多數(shù) 復(fù)系統(tǒng)的研究都基于低等生物和少數(shù)模式植物。由近年來(lái)的研究看來(lái)，修復(fù)系統(tǒng)的作用是明顯的，只不過(guò)它的功能并不是精確無(wú)誤的。 et 1988）年提出，實(shí)驗(yàn)表明細(xì)菌可以選擇性發(fā)生有利于存活的突變。 為在選擇壓力下為獲得適應(yīng)性作的基因水平的突變似乎是被允許的，有選擇性壓力比中性環(huán)境更多獲得基因的突變。突變形成只出現(xiàn)在包含允許錯(cuò)誤修復(fù)的 合酶 編碼基因 的克隆里，篩選條件既可以刺 激 變體的反轉(zhuǎn)突變 也可以促使野生型基因發(fā)生適應(yīng)性突變。 E.， C（ 1994）用 變大腸桿菌報(bào)道了 賴(lài)型的突變。在 白過(guò)量表達(dá)的細(xì)胞中富含 )和另一基因 )突變率增高。他們的研究也表明導(dǎo)產(chǎn)生的突變位點(diǎn)在細(xì)胞饑餓時(shí)被 化的重組修復(fù)方式修復(fù)。正常情況下 化的重組修復(fù)方式是避免復(fù)制錯(cuò)誤發(fā)生的途徑，但在代謝活躍的細(xì)胞里，由于有 譯合成的 合酶 3 全酶復(fù)合體的出現(xiàn)，也會(huì)以易產(chǎn)生差錯(cuò)的修復(fù)途經(jīng)進(jìn)行修復(fù)。以上研究不同程度地表明生物體為在逆境中求生是可以產(chǎn)生適應(yīng)性突變的。 2002）等人對(duì)阻遏蛋白 碼基因進(jìn)行誘變，發(fā)現(xiàn)沙門(mén)氏菌中 效突變體是致死突變，也就是說(shuō) 效突變體不是突變效應(yīng)的增效基因。這一結(jié)果和大腸桿菌中一樣。進(jìn)一步研究表明： 特殊修復(fù)方中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 2 式的作用因子。能造成 傷或復(fù)制受抑制的逆境會(huì)引發(fā)一系列稱(chēng)為應(yīng)急反應(yīng)（ 復(fù)雜的 誘導(dǎo)修復(fù)效應(yīng)。在不利環(huán)境中當(dāng)突變有利于生物的生存的情況下，細(xì)胞為避免死亡而啟動(dòng)這項(xiàng)特殊的求生功能，包括 傷修復(fù)、誘變效應(yīng)、細(xì)胞分裂的抑制以及溶原性細(xì)菌釋放噬菌體等。 統(tǒng)有 復(fù)和導(dǎo)致變異兩條支路，具有雙重功效。該反應(yīng)由 白和 遏蛋白相互作用引起。 白是 應(yīng)系統(tǒng)的發(fā)動(dòng)因子，單鏈 在時(shí)， 白被激活促進(jìn) 遏蛋白水解，使 應(yīng)的一系列基因得到表達(dá)，其中包括紫外線(xiàn)損傷的修復(fù)基因 別編碼切除酶的亞基 )以及 因本身，與誘變作用有關(guān)的基因 細(xì)胞分裂有關(guān)的基因 等。 從突變的后果看，并非所有的堿基改變都能影響基因的功能和表型。突變可能的后果有三個(gè)，即基因功能的丟失、新功能的獲得和對(duì)基因表達(dá)完全沒(méi)有影響，分別由編碼區(qū)的突變和非編碼區(qū)的突變引發(fā)。基因編碼區(qū)的突變可能會(huì)引起單個(gè)堿基的替換、缺失等造成合成的蛋白質(zhì)類(lèi)型改變，因而造成基因功能的丟失或新功能的獲得；或者因移碼引起閱讀框改變合成了另一種蛋白質(zhì)或提前終止轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)譯而不合成有功能蛋白，也能造成基因功能改變或尚失 。而非編碼區(qū)的突變是否影響基因功能就有很強(qiáng)的選擇性，以 讀框上游 35 非保守區(qū)發(fā)生堿基突變并不影響下游基因的啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，但 50 和 40區(qū)， 的突變就影響很大，可以引起基因功能的變化甚至表型變化。起始位點(diǎn)上，甚至單獨(dú)一個(gè)堿基的突變都造成基因表達(dá)失活，產(chǎn)生表型變異。 誘變劑 用的機(jī)理 文名為甲基磺酸乙酯。無(wú)色液體，分子量 124，分子式 中溶解度為 8%， 件下在水中半衰期 20時(shí)是 93h， 30時(shí) 26h。 烷化劑的一種。烷化劑通常帶有 1 個(gè)或多個(gè)活性烷基 ,此基團(tuán)能夠轉(zhuǎn)移到其它電子密度高的分子上去 ,使堿基許多位置上增加了烷基 ,從而在多方面改變氫鍵的能力。證明是最為有效而且負(fù)面影響小的誘變劑。與其他烷化誘變劑類(lèi)似是通過(guò)與核苷酸中的磷酸、嘌呤和嘧啶等分子直接反應(yīng)來(lái)誘發(fā)突變。 發(fā)的突變主要通過(guò)兩個(gè)步驟來(lái)完成 , 首先鳥(niǎo)嘌呤的 置被烷基化 , 成為一個(gè)帶正電荷的季銨基團(tuán) ,從而發(fā)生兩種遺傳效應(yīng) :一是烷化的鳥(niǎo)嘌呤與胸腺嘧啶配對(duì) ,代替胞嘧啶 ,發(fā)生轉(zhuǎn)換型的突變 ;二是由于鳥(niǎo)嘌呤的 糖苷鍵斷裂造成脫嘌而后在 烷基化鳥(niǎo)嘌呤與胸腺嘧啶配對(duì) ,導(dǎo)致堿基替換 , 即 G C 變?yōu)?A T。誘變劑也可與核苷結(jié)構(gòu)的磷酸反應(yīng) , 形成酯類(lèi)而將核苷酸從磷酸與糖分子之間切斷 , 產(chǎn)生染色體的缺失。這些 構(gòu)上的變化都可能促使不表達(dá)的基因或區(qū)段被激活，而表現(xiàn)出被掩蓋的性狀。 學(xué)誘變產(chǎn)生點(diǎn)突變的頻率較高 ,而染色體畸變相對(duì)較少 ,可以對(duì)作物的某一種特殊性狀進(jìn)行改良。與其它誘變劑相比 ,變后產(chǎn)生的突變頻率高 ,且多為顯性突變體 ,易于突變體的篩選。是目前運(yùn)用最中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 3 廣泛也是公認(rèn)最為有效的 化學(xué)誘變劑的誘變譜 人們觀(guān)察到的突變現(xiàn)象中，雄性不育的突變成為觀(guān)察到較多的性狀，原因是兩種不同類(lèi)型的不育都在誘變譜的范圍里。細(xì)胞質(zhì)不育是報(bào)道最早的突變類(lèi)型之一。而在 2003 年 et 四倍體棉花誘發(fā)突變后代中分離出，分離比接近 1： 1 的核基因不育型個(gè)體，證實(shí)核不育也在誘變譜中。 生產(chǎn)中需要的矮化類(lèi)型，也在誘變譜內(nèi)，而且已證明是單基因控制的性狀；此外，觀(guān)賞植物需要的突變類(lèi)型集中在花型和葉型上也是誘變最敏感，易觀(guān)察到的性狀。葉片的蠟質(zhì)、有毛或無(wú)毛性狀有非常多的報(bào)道。根 據(jù)筆者的試驗(yàn)，有關(guān)葉綠素的突變?nèi)琰S化和白化也是高頻發(fā)生的誘變性狀。其他報(bào)道較多的突變性狀還有抗病性及一些產(chǎn)量、品質(zhì)相關(guān)的性狀如穗粒數(shù)、糖含量等。 不同的誘變劑有不同的誘變譜。谷愛(ài)秋等（ 1994）采用三種烷化試劑 酸二乙脂），和 烯亞胺）對(duì)黑龍江地區(qū)的大豆推廣品種進(jìn)行誘變，得到形態(tài)變異頻率大致相同，而早熟突變頻率差異很大，豐產(chǎn)性狀突變率以 最佳，并從中選育出高抗、優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的大豆新品種，以 變處理后也獲得了優(yōu)異的新品種。 體細(xì)胞無(wú)性系變異 體細(xì)胞無(wú)性系變異的特點(diǎn) 體細(xì)胞無(wú)性系變異已被認(rèn)為是改良植物性狀的一種潛在的技術(shù)手段，并已運(yùn)用于馬鈴薯品種的改良中（ 992）。在組織培養(yǎng)中人們發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)組培過(guò)程的再生植株存在可以觀(guān)察到表現(xiàn)型發(fā)生變異的個(gè)體，這種現(xiàn)象稱(chēng)為體細(xì)胞無(wú)性系變異。進(jìn)一步的研究證明：這些變化有的是與細(xì)胞核質(zhì)內(nèi)的基因突變、基因重排、基因擴(kuò)增和轉(zhuǎn)座基因有關(guān)的（ 是可遺傳的變異。誘發(fā)的因素往往是培養(yǎng)基中的激素類(lèi)物質(zhì)（ J， 1981； F 和 K， 1986）及高濃度的鹽類(lèi)物質(zhì)（ 1986）。普遍的研究和生產(chǎn)實(shí)踐證實(shí)，大量的 染色體變異發(fā)生在愈傷組織誘導(dǎo)初期，利用含有葉、莖和芽基的幼嫩組織，則可保持正常的 體細(xì)胞無(wú)性系用于誘變的優(yōu)勢(shì) 發(fā)生在愈傷組織誘導(dǎo)初期的 染色體變異，對(duì)獲得愈傷組織再生植株突變體有利。愈傷組織的誘導(dǎo)相對(duì)容易，利用這條途徑獲得體細(xì)胞無(wú)性系變異體具有簡(jiǎn)便、有效的優(yōu)勢(shì)。 體細(xì)胞無(wú)性系的特點(diǎn)是繁殖快速，而含芽的莖葉外植體往往具有正常的 以保持品種穩(wěn)定的遺傳特性，因此在馬鈴薯脫毒苗工廠(chǎng)化生產(chǎn)中具有廣泛而成功的運(yùn)用?；瘜W(xué) 誘變?cè)噭┳饔糜诤康脑嚬苊缜o葉外植體，誘變后能快速地?cái)U(kuò)大篩選群體，快速稀釋誘變劑在植株體內(nèi)的殘留量以達(dá)到盡快讓遺傳物質(zhì)穩(wěn)中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 4 定的目的，一旦發(fā)現(xiàn)突變體也能快速擴(kuò)繁、快速檢驗(yàn)，繼代中可以保留所有的細(xì)胞，也有利于將突變的非生長(zhǎng)點(diǎn)細(xì)胞擴(kuò)繁并最終純化篩選出來(lái)。將化學(xué)試劑誘變建立在莖葉外植體的組織培養(yǎng)平臺(tái)上，具有操作便捷、變異誘因單一便于分析、篩選效率高等優(yōu)點(diǎn)，是一條新的值得嘗試的育種途徑。 突 變體的篩選 誘變是否成功很大程度取決于育種者的目標(biāo)是什么。篩選不同的性狀的難易不同，而不同的性狀有各自不同的遺傳力 。遺傳力高的性狀穩(wěn)定性好，不容易受到環(huán)境因素的影響，反之亦然。因此，選擇遺傳力高的性狀比遺傳力低的性狀容易成功。單基因控制的性狀更易篩選、觀(guān)察，如花色、葉形態(tài)、葉表面蠟質(zhì)、絨毛、矮化、核雄性不育以及一些抗病、抗生素抗性性狀等等都是遺傳力很高的表現(xiàn)型。這些性狀比多基因性狀容易被發(fā)現(xiàn)、確定和選擇。 而產(chǎn)量性狀的考察對(duì)象包括種子、葉子、花朵、果實(shí)、嫩莖、塊莖、塊根等等，涉及到株形、產(chǎn)量、蛋白、淀粉、糖、纖維含量、可溶性固形物含量、次生代謝產(chǎn)物及抗病性等。相應(yīng)成分的檢測(cè)，經(jīng)典的方法是在油菜油酸上采用的“半子葉法”， 即取種子中一半的子葉用于氣相色譜分析微量成分，種子其余部分仍正常生長(zhǎng)篩選其他性狀。 篩選方法分為常規(guī)方法和特殊方法。常規(guī)方法指對(duì)作物突變后代進(jìn)行外觀(guān)性狀、豐產(chǎn)性狀、品質(zhì)性狀、育性和抗逆、抗病性狀的觀(guān)察、檢測(cè)及評(píng)價(jià)，從中篩選出具有源材料不具備的性狀或某一數(shù)量性狀表達(dá)量顯著高于源材料的突變體。 非常規(guī)方法往往是在植物誘變的不穩(wěn)定期施加額外的選擇壓，如在微生物誘變時(shí) ,在培養(yǎng)基中添加不利生長(zhǎng)的成分以協(xié)迫細(xì)胞發(fā)生有利存活的變異。 1 篩選方案的選擇 對(duì)于嚴(yán)格自交的作物 1979）提供 了四個(gè)確定 群體大小的可選擇的方案：）每個(gè) 植株只收獲一粒種子； 2）每個(gè) 植株獲取一個(gè)可繁殖器官如果實(shí)、豆莢、穗等；）每個(gè) 植株收取多個(gè)可繁殖器官果實(shí)、豆莢、穗 ；）把從 植株不同部位收取的種子混在一起 。 對(duì)于一些遺傳力低的復(fù)雜性狀， 1975）對(duì)燕麥?zhǔn)褂瞄g接篩選的方法，通過(guò)計(jì)算顆粒與生長(zhǎng)量比值作為豐產(chǎn)指數(shù)，進(jìn)行篩選。這個(gè)方法化繁為簡(jiǎn)，能高效地篩選表現(xiàn)好的個(gè)體。缺點(diǎn)是可能會(huì)漏選個(gè)別低生長(zhǎng)量但高產(chǎn)的突變體。 2 起始篩選世代的確定 受到誘變處理的材料 習(xí)慣上看作是 此產(chǎn)生種子萌發(fā)的植株是 性繁殖材料，相應(yīng)稱(chēng)為 考慮到誘變后細(xì)胞和染色體極不穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)和修復(fù)損傷的需要，同時(shí)誘變劑的后效作用也需要通過(guò)世代傳遞來(lái)消除，通常突變體的篩選從 開(kāi)始。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 5 選擇產(chǎn)量性狀之類(lèi)多基因控制的性狀，有人認(rèn)為篩選工作必須在突變表型穩(wěn)定的 以后才能開(kāi)始進(jìn)行。應(yīng)用數(shù)量遺傳學(xué)計(jì)算可知，由于種子誘變中出現(xiàn)的突變基因中最初的幾代中會(huì)因減數(shù)分裂而經(jīng)歷較高的丟失率，其概率函數(shù)為（ Z） Z 1。在第一代突變基因絕跡率為，令 （ 0） 0 1 二代及其后世代為 （ 0）（ 就是說(shuō)種子誘變的突變基因必須在 7 代以后才能相對(duì)穩(wěn)定，因此嚴(yán)格的育種者對(duì)田間突變體的選擇往往從第 7 代開(kāi)始。 對(duì)于抗病性，冷的忍受性，固氮特性可以在 苗期進(jìn)行篩選。 種子本身是個(gè)基因型復(fù)合體。種皮來(lái)自母細(xì)胞，胚和胚乳是新的基因型。如果突變發(fā)生在種皮上，必須在 能進(jìn)行篩選 ，如果突變發(fā)生在胚乳上，就會(huì)隨著胚的萌發(fā)和胚乳的程序性死亡而變成無(wú)效突變。 3 篩選規(guī)模的確定 理論上，規(guī) 模越大越有利突變體的篩出，但育種者對(duì)材料的處理能力是有限的，因此篩選的規(guī)模常常視育種者的處理能力而定。種子突變體篩選時(shí)常以十萬(wàn)為數(shù)量的最小值。 而花粉誘變時(shí)處理群體較小。 1978）和 1991）等認(rèn)為：花粉處理平均每個(gè)位點(diǎn)單個(gè)基因的隱性和顯性突變率可達(dá) 1010者以上。因此一套 30005000 的 體應(yīng)該包括所有隱性突變，可以篩選到所需要的質(zhì)量性狀突變體。 嵌合體及其純化 嵌合體在多細(xì)胞組織自發(fā)或誘導(dǎo)突變中都很常見(jiàn)，是由于突變細(xì)胞在組織 中處于次要位置造成的，但仍然很有用的。許多無(wú)性繁殖的植物如菊、康乃馨等的嵌合體足夠穩(wěn)定，可以直接用于生產(chǎn)。而大多數(shù)的嵌合體不夠穩(wěn)定，受周?chē)＜?xì)胞和 復(fù)系統(tǒng)的影響和作用，常發(fā)生反向突變（“ 而恢復(fù)正常的表達(dá)狀態(tài)。要使嵌合體純化，以得到穩(wěn)定可用的突變，對(duì)于可以進(jìn)行種子繁殖的植物，長(zhǎng)期的田間觀(guān)察和選擇是必要的，也是可行的。對(duì)于可以快速大量繁殖的試管繁殖材料，使每一個(gè)芽都大量繁殖并觀(guān)察其后代有利于發(fā)現(xiàn)和純化嵌合體。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 6 1 2 植物誘變?cè)隈R鈴薯育種上的應(yīng)用 馬鈴薯（ 2n=4X=48），茄科茄屬中能形成塊莖的栽培種植物。是世界第四大糧食作物 ,是我國(guó)產(chǎn)業(yè)調(diào)整的重要發(fā)展對(duì)象。 馬鈴薯原產(chǎn)南美洲安第斯山 (隨著哥倫布探險(xiǎn)美洲大陸而傳播到世界各國(guó)。由于資源引入來(lái)源狹窄，加之 19 世紀(jì)中期爆發(fā)的大面積顛覆性歐洲馬鈴薯晚疫病 (影響，造成了現(xiàn)有品種及其育種材料基因狹窄 (1974)的特點(diǎn)。常規(guī)雜交育種是目前使用最多的形成品種最多的育種方法，我國(guó)最近 50 多年來(lái)通過(guò)引進(jìn)資源和雜交育種方法育成 100 多個(gè) 品種，其中的 30 個(gè)品種占全國(guó)每年種植面積的 90%。 1974 年作的共祖率分析表明，美國(guó)現(xiàn)有馬鈴薯栽培種間普遍存在親緣關(guān)系。由于我國(guó)馬鈴薯系近代由歐美引進(jìn)，存在更為嚴(yán)重的類(lèi)似問(wèn)題，因此狹窄的基因背景，已使得雜交育種的優(yōu)勢(shì)難以體現(xiàn)。 人工誘變用于植物由來(lái)已久，目前仍以代謝生理、發(fā)育生理、抗性、疫苗等研究性的工作為主。直接用于誘變育種方面較少，但也有成功運(yùn)用，如在棉花、小麥、油菜、和一些花卉上都形成了品種。限制人工誘變方法直接用于育種的因子主要是基因型純化、固定上的困難、后代篩選周期過(guò) 長(zhǎng)（穩(wěn)定的種子繁殖突變體需經(jīng) 7 代選擇）和分子檢測(cè)中不能確定突變方向以及品種專(zhuān)利等問(wèn)題。而無(wú)性繁殖植物無(wú)需經(jīng)歷減數(shù)分裂繁殖后代，具有突變相對(duì)易穩(wěn)定易保存的特點(diǎn)，篩選和觀(guān)察可以從無(wú)性二代開(kāi)始，因而用于誘變具有特有的優(yōu)越性。以無(wú)性繁殖方式栽培的荷蘭鮮花，其栽培品種中約有 70%是突變體后代繁殖。此外，無(wú)性繁殖植物分子鑒定時(shí)，由于建立的是純的近等基因系，分子作圖沒(méi)有假陽(yáng)性標(biāo)記，得到的標(biāo)記能真實(shí)反應(yīng)突變的單基因或控制同一性狀的多基因的多態(tài)性。這一點(diǎn)也有利于突變篩選或進(jìn)一步的機(jī)理研究。因此在以無(wú)性繁殖為主要繁殖方式的馬鈴 薯育種中使用人工誘變方式可能取得高于種子繁殖作物的育種效率。 體細(xì)胞的自然突變選種國(guó)內(nèi)外都有較為典型的例子。自然突變中利用得最多的是芽變。芽變是一種對(duì)已育成品種的不良性狀自發(fā)進(jìn)行修飾產(chǎn)生穩(wěn)定的可遺傳的突變。芽突變具有較好的穩(wěn)定性。如美國(guó)的馬鈴薯品種“麻皮布爾斑克”就是自然芽突變選出的品種，在美國(guó)已育成 100 多年，至今仍在生產(chǎn)上廣泛使用。我國(guó)的“壩豐收”等馬鈴薯品種也來(lái)源于自然芽突變并運(yùn)用多年。但自然芽變率是非常低的，在高等植物中僅為 100且得到的突變體性狀不可預(yù)測(cè)，這就大大制約了天然芽變的有 效利用。利用組織培養(yǎng)方式，可以在較小的空間內(nèi)得到較大的群體，并能在一個(gè)生長(zhǎng)季多次對(duì)易感組織或細(xì)胞進(jìn)行誘變，從而大大增加誘變的次數(shù)和獲得變異的概率；組織培養(yǎng)誘變比純理化誘變的突變率大約高一倍，因此可以大大增加誘變的效率。對(duì)無(wú)性繁殖作物而言，一旦獲得突變材料，可以立即快繁擴(kuò)大群體或加以保存，最大限度地穩(wěn)定住好的突變材料。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 7 項(xiàng)研究的意義和目的 作者所在的貴州省馬鈴薯種植面積自 1999 年以來(lái)以較快的速度逐年增加，目前已近 800 萬(wàn)畝，國(guó)內(nèi)排名第二。但育種工作起步較晚，缺乏相應(yīng)的資源和研究背景，自主育成的 品種極少。 據(jù) 供數(shù)據(jù)表明：現(xiàn)存馬鈴薯資源中，茄屬有 235 個(gè)結(jié)塊莖的種，但只有為數(shù)不多的幾個(gè)可與馬鈴薯栽培種（ 親緣關(guān)系、互交可育?，F(xiàn)有栽培種多為四倍體，野生種多為二倍體，野生資源中的抗逆性等優(yōu)異性狀因倍性原因不能直接利用，需要分解育種方法，如 2N 配子途徑才能引入新的基因型對(duì)現(xiàn)有栽培種進(jìn)行改良。盡管 2N 配子為野生種的利用開(kāi)辟了新的途徑，但貴州省缺乏相應(yīng)的研究基礎(chǔ)，短期較難上馬；轉(zhuǎn)基因育種方式在貴州省還處在起步階段，不能較快直接運(yùn)用。而從國(guó)內(nèi)外的研究現(xiàn)狀來(lái)看，由于高等植物的基因載 體裝載能力限制著許多基因的轉(zhuǎn)移效率，高等植物轉(zhuǎn)基因的穩(wěn)定性和基因沉默等問(wèn)題一直困擾著轉(zhuǎn)基因研究的迅速發(fā)展，轉(zhuǎn)基因目前未必是解決問(wèn)題的理想途徑。 基于貴州省馬鈴薯育種的現(xiàn)狀，接合貴州省農(nóng)業(yè)科研的現(xiàn)有條件，針對(duì)生產(chǎn)中存在品種問(wèn)題，我們選擇在無(wú)性繁殖的四倍體馬鈴薯上進(jìn)行體細(xì)胞誘變，通過(guò)研究作用于 構(gòu)的誘變劑 四倍體馬鈴薯莖段等組織的有效性，證實(shí) 索對(duì)誘變后繼代 4 次并經(jīng) 2 次棚栽的個(gè)體或群體進(jìn)行株系選擇的可行性，確定可用于篩選突變的性狀，提高人工誘變的效率、建 立相對(duì)完整的誘變體系，為貴州省馬鈴薯產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供優(yōu)良品種進(jìn)行育種途徑的探索。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第二章 研究材料與方法 8 第二章 研究材料與方法 愈傷組織誘導(dǎo)試驗(yàn)： 選用貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)所建立的“米拉”、“克新 4 號(hào)”和“夏坡蒂” 3 個(gè)馬鈴薯品種的脫毒試管苗，及中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所提供的 “中薯 2 號(hào)”馬鈴薯脫毒試管苗。取無(wú)腋芽的試管苗莖段，于 5+2,+食用白糖 2 +瓊脂 養(yǎng)基上誘導(dǎo)，待莖段略微膨脹，兩端愈傷化時(shí)用于誘變處理。 變?cè)囼?yàn)： 選用中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所提供的“中薯 2 號(hào)”和“夏坡蒂”馬鈴薯脫毒試管苗。將試管苗切成約 1、帶有 1 2 個(gè)腋芽的莖段，在150角瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)擴(kuò)繁，繼代 3 次，待試管苗擴(kuò)繁至約 400 株，苗長(zhǎng)至 6 8 片葉時(shí)切取莖段用于誘變處理及對(duì)照設(shè)置。試管苗擴(kuò)繁條件：培養(yǎng)基為 2食用白糖 脂， 養(yǎng)溫度 25，光照 13h/d，光強(qiáng) 2000代時(shí)間約 46 周。 再生苗移栽、大棚觀(guān)察選用“中薯 2 號(hào)”誘變后代無(wú)性系。大棚栽培條件：廂面寬 質(zhì)壤土，實(shí)行霧化噴灌補(bǔ)充水 、適量肥及少量藥。 試驗(yàn)時(shí)間地點(diǎn) 試驗(yàn)于 2004 年 7 月至 2006 年 2 月分別在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉蔬菜研究所和貴州省生物技術(shù)研究所完成。試驗(yàn)材料準(zhǔn)備和 變工作在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉蔬菜研究所茄科實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行；誘變后代的試管觀(guān)察及棚栽觀(guān)察試實(shí)驗(yàn)在貴州省生物技術(shù)研究所進(jìn)行。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第二章 研究材料與方法 9 無(wú)性系建立 取 健 康 試 管 薯 的 飽 滿(mǎn) 芽 ， 經(jīng) 消 毒 處 理 后 在 解 剖 鏡 下 剝 去 外 層 葉 片 ， 切 完整芽原基，置于 L L 3蔗糖 脂培 養(yǎng)基上，約 50d 后形成新的植株，繼代 35 次，取莖段形成愈傷組織的試驗(yàn)，盡量使用單株后代以消除基因型和營(yíng)養(yǎng)狀況不同對(duì)愈傷形成的影響。 莖段愈傷組織誘導(dǎo) 取莖頂部到基部不帶芽莖段，切成 1，區(qū)分為莖上部、莖中部和莖下部三個(gè)部位，分別接種到含 L 2， 4L 3蔗糖 脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，觀(guān)察生長(zhǎng)狀況。每個(gè)品種每次用于試驗(yàn)的莖切段數(shù)量多于 100段，重復(fù) 7 次，在莖切段培養(yǎng) 35d 時(shí)進(jìn)行生長(zhǎng)狀況統(tǒng)計(jì)。 繼代次數(shù)對(duì)愈傷誘導(dǎo)及再生植株變異率的影響 切取愈傷再生植株單芽莖段扦插至不含激素的 養(yǎng)基，正常轉(zhuǎn)接兩次后，以莖段同源的單芽莖扦插植株作對(duì)照，對(duì)分別由新建材料和多次繼代材料誘導(dǎo)的愈傷再生植株進(jìn)行生長(zhǎng)速度、葉片形狀、分枝狀況、生根情況的統(tǒng)計(jì)，比對(duì)差異計(jì)算再生植株的試管苗變異率。 用 1%（ v： v）的 液處理愈傷化莖段、帶頂芽莖段、帶側(cè)隱芽莖段和側(cè)腋芽（芽已萌發(fā)）莖段各 100 個(gè)。以未處理莖段（ 助溶劑水溶液（ 對(duì)照。 愈 傷 化 莖 段 處 理 ： 處 理 液 滴 加 在 已 略 微 膨 脹 的 脫 分 化 的 莖 段 上 ， 轉(zhuǎn) 入,T 1用白糖 2 +瓊脂 養(yǎng)基上誘導(dǎo)植株再生，觀(guān)察再生植株變化。 帶芽莖段處理： 將帶頂芽、側(cè)隱芽和側(cè)腋芽莖段浸泡于處理液 4 h，用無(wú)菌水清洗 3 4 次 ,轉(zhuǎn)入 2食用白糖 脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)觀(guān)察。 再生苗擴(kuò)繁移栽 理后的再生試管苗，在 2食用白糖 脂培養(yǎng)基上擴(kuò)繁 4代，經(jīng)煉苗后移栽于 40 目防蟲(chóng)網(wǎng)棚內(nèi)，繼續(xù)觀(guān)察 2 代。 棚栽試驗(yàn)： 大棚內(nèi)苗床，將基質(zhì)整平、澆透水，將長(zhǎng)度約 5 帶根試管苗，洗凈培養(yǎng)基，移栽至苗床上，株行距為 5 10 取小薯后，將小薯按大中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第二章 研究材料與方法 10 小分級(jí)后再次播種在大棚苗床上，株行距為 10 12 棚內(nèi)廂面寬 、肥、農(nóng)藥等按常規(guī)方法管理。 對(duì)經(jīng)誘變處理的材料進(jìn)行四代試管擴(kuò)繁、觀(guān)察和兩代大棚栽培觀(guān)察。 誘變后觀(guān)察 試管苗觀(guān)察：各處理分別于處理后 5、 20、 50 d，觀(guān)察記載試管苗生長(zhǎng)速度、株型、莖、葉等發(fā)育的變化特征。 網(wǎng)室栽培苗及薯塊觀(guān)察：進(jìn)行株高、莖粗、莖形、莖色、葉形、葉色、薯色、塊莖中淀粉含量、還原糖含量及塊莖干物重的觀(guān)察和測(cè)定。 薯塊主要成分測(cè)定 將鮮薯切薄片稱(chēng)重、置于 45溫箱內(nèi)烘干。轉(zhuǎn)至玻璃干燥器中靜置 12，再次稱(chēng)重，差減得到干物質(zhì)重量，用于計(jì)算干物質(zhì)含量。之后將干燥的薯片放入 粉末溶解于酒精后，分別用酒精浸提 砷鉬酸比色法和酸水解酮還原碘量法滴定測(cè)定塊莖干物質(zhì)中的還原糖和淀粉含量。 誘變第 6 代（ 栽試驗(yàn)設(shè)計(jì) 為明確 變第 6 代（ 系的生長(zhǎng)發(fā)育及塊莖主要成分變異情況，試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，針對(duì)不同變量分別用變異系數(shù)、百分?jǐn)?shù)、平均值 和方差分析等方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。 對(duì)株高、莖粗、結(jié)薯數(shù)、塊莖干物重、塊莖淀粉含量、還原糖含量等不連續(xù)變量，進(jìn)行平均值、變異系數(shù)和變異范圍的計(jì)算；對(duì)莖形、莖色、分枝數(shù)、葉色、花蕾等不連續(xù)變量分別作分級(jí)處理，進(jìn)行百分?jǐn)?shù)計(jì)算比較其變異程度；采用方差分析的方法對(duì)遺傳因素和栽培中主要影響因子的生長(zhǎng)性狀變異程度作估測(cè)。 數(shù)據(jù)調(diào)查時(shí)期 株棚內(nèi)生長(zhǎng) 60查株高、莖粗、莖形、莖色、分枝數(shù)、葉色、花蕾有無(wú)及結(jié)薯數(shù)； 65降溫引起的紅色壞死斑點(diǎn)進(jìn)行分級(jí)統(tǒng)計(jì)；塊莖收獲后 30d 用于主要成 分測(cè)定。 生長(zhǎng)量和塊莖主要成分變異觀(guān)察 試驗(yàn)設(shè)兩組對(duì)照，一組與誘變的無(wú)性系源自同一株試管苗，在同樣的培養(yǎng)環(huán)境下，經(jīng)相同繼代次數(shù)繁殖而來(lái)，用于消除環(huán)境和培養(yǎng)條件的影響；另一組來(lái)源相同的對(duì)照，由另一實(shí)驗(yàn)室在相同培養(yǎng)環(huán)境下繁殖而來(lái)，用于增加對(duì)照的變異系數(shù)和范圍，消除由于人為操作造成的影響。隨機(jī)抽取 200 個(gè)植株，記錄其株高、莖粗、結(jié)薯數(shù)，測(cè)定塊莖的主要成分干物重、淀粉和還原糖在干物質(zhì)中的含量，用于計(jì)算平均值、變異系數(shù)和變異范圍。 在全部誘變后代中，完全隨機(jī)抽取 604 個(gè)植株，記錄其株高、莖粗、結(jié) 薯數(shù)，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第二章 研究材料與方法 11 測(cè)定塊莖的主要成分干物重、淀粉和還原糖在干物質(zhì)中的含量，用于計(jì)算平均值、變異系數(shù)和變異范圍。 植株外觀(guān)及生物學(xué)性狀變異狀況觀(guān)察 設(shè)三組對(duì)照 別對(duì)應(yīng)貴州省田間種植的中薯 栽后代；與誘變的無(wú)性系源自同一株試管苗，在同樣的培養(yǎng)環(huán)境下，經(jīng)相同繼代次數(shù)繁殖的棚栽后代；另一實(shí)驗(yàn)室