同步熒光光譜法ppt課件

.,4-3同步熒光光譜法(SynchronousFluorescence),.,一、同步熒光分析原理,同步熒光技術是同時掃描激發(fā)單色器和發(fā)射單色器波長的情況下來測繪熒光光譜圖。由測得的熒光強度信號對發(fā)射或激發(fā)波長作圖，稱為同步熒光光譜。,.,SYNCHR.EX.SCAN,NOR.EM.SCAN,NOR.EX.SAN,NOFLUORE,SCATTERLINE,/nm,nm,.,1、固定波長的同步熒光光譜(Constantwavelengthsynchronousluminescence,CWSL),(1)在同步掃描中，使激發(fā)波長與發(fā)射波長保持固定的波長間距，即常數(shù)。將同步熒光信號對發(fā)射或激發(fā)波長測繪熒光光譜圖，則為固定波長的同步熒光光譜。,.,（2）定量依據(jù),激發(fā)光譜強度分布,發(fā)射光譜強度分布,（2）同步掃描激發(fā)波長時的發(fā)射光譜,（3）同步掃描發(fā)射波長時的激發(fā)光譜,（2）,（3）,（1）,.,（3）同步熒光光譜的特點,a.同步光譜與激發(fā)光譜及發(fā)射光譜都有關系。它同時利用了化合物的吸收特性和發(fā)射特性，因而使光譜分析的選擇性得到改善。b.有利于多組分混合物的分析。同步熒光光譜可以把強帶增強而減小弱帶的干擾。c.可消除Raylei干擾，使Roman強度降低且拉寬。,.,（4）的選擇,只有當恰好相當于某吸收帶和其發(fā)射帶之間波長間距時，才能觀察到同步信號。,=斯托克斯位移（發(fā)射波長與激發(fā)波長之差),與狹縫寬度d的大致原則：,只受瑞利：,當同時受瑞利和拉曼散射干擾,測定波,拉曼散射光的波長,.,2、固定能量的同步熒光光譜constantenergysynchronousluminescence(CESL),固定能量的同步熒光光譜，是指在同步掃描過程中，使激發(fā)波長與發(fā)射波長之間保持著固定的能量差。,Ray,Roman,.,常數(shù),表示波數(shù)差,與成正比,拉曼光與入射光之間的頻率差稱為拉曼位移,.,當,或,時,固定能量的同步熒光光譜可消除瑞利散射和拉曼散射，而固定波長的同步熒光光譜只能消除瑞利散射，使拉曼散射拉寬。二者皆能降低光譜的復雜性，提高選擇性。,F,.,二、同步掃描儀器設備,1、固定波長的熒光光譜的獲得,對于以光柵為單色器的熒光分光光度計，只要分別設置激發(fā)和發(fā)射兩個單色器所需的起始波長，并使它們以同樣的速率進行掃描，便可進行固定波長同步掃描熒光測定。,2、固定能量同步掃描是非線性的可變角同步掃描，需通過微處理機控制而加以實現(xiàn)。,.,三、應用,1、在多環(huán)芳烴分析中的應用減小光譜的重疊,（1）固定波長同步熒光法用于煤中多環(huán)芳烴的測定苊(Ace)，2,3-苯并芴(BF)，蒽(Ant)，苯并芘(Bap)，苝(Per)用標準加入法計算2,3-苯并芴,（2）低溫固定能量同步熒光法,.,煤液化樣品中各種有機物的同步熒光光譜,煤液化樣品的固定波長同步熒光光譜,.,2、同步熒光法在醫(yī)藥檢驗方面的應用,（1）違禁藥品中苯丙胺和嗎啡加奎寧麥角酸二乙酰胺的測定（2）二苯并呋喃中痕量咔唑和蒽,.,（3）酪氨酸和色氨酸嚴重重疊,CWSL,的同步熒光色氨酸的光譜特征,的同步熒光酪氨酸的光譜特征,or70nm的二階導數(shù)同步熒光可對Trp和Tyr分辨,同步熒光可對Trp、Tyr、Phe分辨,.,（4）維生素B1、B2混合物中維生素B1的測定用鐵氰化鉀將B1氧化硫胺熒（5）尿液中腎上腺素和去甲腎上腺素的同時測定,.,總結：,.,4-4時間分辨熒光法（TimeDomainFluorometry）(TimeResolvedFluorometry）,.,一、時間分辨法原理用短脈沖光源激發(fā)的熒光體群體，隨時間而衰變，其衰變率為,受激分子的壽命,.,用F(t)或N(t)對t作圖,1/e,F(t)orN(t),t,or,t,熒光壽命為熒光強度衰變到初始值的1/e所需要的時間。,.,特點：采用適當?shù)募ぐl(fā)光源和檢測體系，可以得到在固定波長的熒光強度時間曲線和在固定時間的熒光發(fā)射光譜。（1）可以對混合物中光譜重疊但壽命差異的組分進行分辨；（2）可消除雜質與背景熒光；（3）可測量溶劑松弛的時間。,.,二、時間分辨儀器設備,激發(fā)光源、時間延遲設備、激發(fā)單色器、樣品池、熒光單色器及設有門控的檢測器,1、激發(fā)光源短脈沖的激發(fā)光源,閃光燈,氮閃光燈幾條高強度射線,氫閃光燈,氘閃光燈,連續(xù)線強度低,.,激光器,氮分子激光器337.1nm,氬離子激光器351nm,染料激光器所需波長,光子通量大、峰值功率高、單色性好、發(fā)生的光脈沖持續(xù)時間短，激光熒光法具有較高的靈敏度和選擇性。,.,2、檢測器如光電倍增管帶有門控的,.,三、時間分辨熒光的分析應用,熒光體的熒光壽命的測定時間分辨熒光光譜熒光發(fā)射的衰變曲線,.,1、熒光體混合物中兩組分的同時測定,例用8-羥基喹啉-5-磺酸(R)同時測定Al和Ga15.20ml樣品+1ml0.045%R+2ml20%NH4Ac(or20%NH4Cl)調pH至4.5，稀釋至25ml氘燈激發(fā)測定熒光強度時間曲線,.,（1）測定熒光衰變曲線,AlRGaR,可利用上述兩個熒光化合物的差異對它們進行同時測定。,.,（2）計算含量,鋁配合物和鎵配合物的衰變曲線,鋁配合物和鎵配合物的對數(shù)衰變曲線,比較（1）和（4）的熒光強度得Al的含量比較（2）和（5）的熒光強度得Ga的含量,.,2、芳基的測定例用ps雙色熒光法對鹵素芳族化合物光離解作用所產生的芳基進行檢測（1）用25ps，266nm激光脈沖使1-(氯甲基)萘，1-(溴甲基)萘，2-(氯甲基)萘，2-(溴甲基)萘等化合物離解產生芳基。（2）在延遲60ps后，用25ps，355nm激光脈沖激發(fā)芳基的熒光，產生橙色熒光，600nm，10ns，如圖所示。,（a）和（c）一致，是1-萘甲基所致（b）和（d）一致，是2-萘甲基所致,.,3、溶劑松弛時間的分辨測量,許多分子在基態(tài)時具有從中等到大的偶極矩，在激發(fā)態(tài)時偶極矩發(fā)生變化，從而引起周圍溶劑分子中電子的重排和溶劑分子圍繞激發(fā)態(tài)溶質分子偶極的重新定向，這個過程稱為溶劑松弛，這個過程所需的時間叫溶劑松弛時間。在松弛過程中，能量有所降低，因而發(fā)射向長波位移。時間分辨熒光法可記錄不同時間的發(fā)射光譜，因而可測量松弛時間。,.,例14-氨基苯鄰二酰亞胺（4-AP）的丙醇溶液在不同的溫度下的時間分辨的熒光光譜圖,室溫下，-132熒光光譜與時間t無關在-77K，熒光光譜與t有關在4ns，溶劑還未重新取向在23ns，溶劑取向已完成,.,例22-對-苯甲基萘-6-磺酸鹽染料,溶劑甘油溫度A圖41.8ns,8.0ns,12.2nsB圖571.8ns,8.0ns,12.2ns,.,4-5相分辨熒光法（Frequency-DomainFluorometry/Phase-ModulationFluorometry),.,Theobjectiveofbothtime-domainandfrequency-domainfluorometryistorecovertheparameterdescribingthetime-resolveddecay.,.,一、相分辨法原理1、單指數(shù)衰變的熒光當樣品被激發(fā)光激發(fā)而發(fā)射熒光時，如激發(fā)光的光強度被正弦調制，其角調制頻率為，則發(fā)射光也同樣被調制。由于吸收和發(fā)射之間的時間延遲，調制的發(fā)射光比起激發(fā)光在相上延遲了角。但發(fā)射光的調制比起激發(fā)光的調制小一些，也即是發(fā)射光的改變部分的相對幅度比起激發(fā)光要小些。,.,去調制因素,激發(fā)光和發(fā)射光的光強正弦調制,.,在測量相角（）或去調制因素（m）之后，可以計算該熒光體的熒光壽命。相分辨法是熒光壽命的測量方法之一。,.,m,10MHz,30MHz,10MHz,30MHz,、m與的關系如下：,.,m隨的增大而下降m=1發(fā)射光與激發(fā)光的調制幅度相同m越小發(fā)射光被調制的幅度越小,隨的增大而增大，壽命越長，延遲的越大。當熒光分子的壽命越長，發(fā)射相對于激發(fā)延遲的時間就越長。,.,2、多指數(shù)衰變的熒光如果樣品中含有兩種熒光體，或者單一熒光體而進行進一步激發(fā)態(tài)反應，則熒光是雙指數(shù)衰變。如果進行多步反應，則熒光是多指數(shù)衰變。,由和m所計算的是表觀熒光壽命。如采用相靈敏檢測器的相熒光計，,激發(fā)光的調制度（或振幅）,去調制因素,單一熒光體,.,對于相靈敏檢測器,穩(wěn)態(tài)熒光光譜,檢測角度,在不同相角測定熒光光譜，稱為相靈敏熒光光譜，即為在固定時間的熒光光譜。,.,若樣品溶液中含有A、B兩種熒光體，它們的熒光壽命分別為A和B。,如,，則該組分的發(fā)射被抑制,.,要得到混合物中組分A的穩(wěn)態(tài)光譜，須把檢測器相角調節(jié)至和組分B正交。這是很費時的，最好得到另外的信息:先得到任何一組分的穩(wěn)態(tài)熒光光譜，然后調節(jié)檢測器相角至該熒光光譜和混合物的熒光光譜重疊，則可得到與另一組分正交的相角。使用任何一組分的純溶液以確定檢測器的相角。,.,當用相靈敏檢測器在各種不同檢測器相角測繪樣品的相靈敏熒光光譜。對于單一化合物，其熒光峰波長基本上保持不變而與檢測器相角無關。如果不是均勻的發(fā)射，則熒光峰隨著檢測器相角而改變，在不同檢測器相角得到的相靈敏光譜是鑒別不均勻發(fā)射的有力工具。,.,3、相分辨熒光法與時間分辨熒光法比較用于熒光參數(shù)測量的儀器可分為兩大類,穩(wěn)態(tài)測量steady-state時間依賴的測量timedependent,相分辨熒光法與時間分辨熒光法本質上都是時間依賴或時間分辨的測量。,.,（1）儀器時間分辨熒光法的局限性a.儀器常常非常復雜，常局限于有關專家使用；b.靈敏度常低于穩(wěn)態(tài)測量。相分辨法的優(yōu)點a.儀器類似于穩(wěn)態(tài)測量的儀器，使用簡單；b.靈敏度高；c.數(shù)據(jù)處理快。,.,（2）測量參數(shù)a.F(t)-t曲線時間分辨b.m.相分辨,.,（3）從實驗的觀點，相分辨有下列優(yōu)點：在時間分辨的方法中，測量的延遲信號的去卷積對于計算測量系統(tǒng)的限定時間的響應是必要的，而相分辨法不受此限制；相分辨法允許不同方向的直接測量。如在各向異性的延遲測量中，平行和垂直偏振成份的和m的測定；相分辨法為基于熒光壽命差異的光譜成份之直接分辨提供了一種簡單、有效的方法。,.,二、相分辨儀器設備,與一般熒光分光光度計大致相似，但增加了光調制器及測量相角和去調制因素的設備。,.,1、光調制器（1）Kerr調制器不能透射UV（2）Pockels調制器需要較低電壓，能透過紫外光，可在連續(xù)可變的頻率下操作，但要求高度準直的光，適用于以激光器為光源的相分辨熒光計。（3）Dedye-Sears超聲波調制器能透過紫外光，對光準直的要求不太高，可用于各種光源。,.,2、檢測系統(tǒng)由單色器，光電倍增管，鎖定放大器組成。鎖定放大器只檢測與參比信號相同頻率且具有一定位相關系的信號成份，從而大大提高了信噪比。,.,三、相分辨熒光的分析應用,1、熒光體兩組分混和物中個別組分的熒光光譜的直接記錄和熒光壽命的測定2對甲苯氨基6萘磺酸（TNS）和6丙酰2（二甲基氨基）萘（PRODAN）混合物在乙醇溶液中,穩(wěn)態(tài)熒光光譜相靈敏熒光光譜調整D,PRODAN被抑制TNS的熒光光譜，=3.6ns,TNS被抑制PRODAN的熒光光譜，=11.6ns,當,當,.,TNS和PRODAN的穩(wěn)態(tài)熒光光譜,.,TNS-PRODAN混合物的相靈敏熒光光譜,.,從混合物直接記錄下的TNS和PRODAN的熒光光譜,.,2、溶劑松弛的相分辨在溶劑松弛過程中，一般情況能量有些降低，松弛態(tài)發(fā)射光譜紅移。但降低溫度會使光譜藍移。,N-乙酰基-L-色氨酸胺（NATA）solvent:丙稀甘油（1）不同T下的熒光光譜（2）相靈敏熒光光譜在固定D即t下所得到的熒光光譜,.,NATA在丙烯甘油中的熒光光譜,.,NATA在丙烯甘油中的相靈敏熒光光譜,.,4-6熒光動力學分析法（FluorescentKineticAnalysis),.,一、動力學法原理由于化學反應的速率與反應物的濃度有關，在某些情況下與催化劑的濃度有關，因此可以通過測量反應的速率以確定待側物的含量。,光度法電位法熒光法,測速率,以熒光法監(jiān)測反應速率，這種方法則稱為熒光動力學分析法。,.,aA+bBnC+mD=kAaBba=1b=1=kAB,.,1、熒光動力學分析的特點（1）優(yōu)點a.只觀測反應初期的速率，可用于某些反應速率慢、平衡常數(shù)小或可能發(fā)生副反應的化學反應；b.動力學分析是一種相對測量,動力學分析法有可能比平衡法具有更好的選擇性;c.靈敏度高、操作較快、易于實現(xiàn)自動化。,.,（2）局限性a.所使用反應的半衰期應在5ms到1h之間;b.必須嚴格地控制溫度、pH、試劑濃度、離子強度等反應條件和其它可能影響反應速率的因素；c.動力學測量的信噪比在本質上要比平衡法小,只有反應的一小部分用于測定；d.試樣基質的干擾問題仍可能發(fā)生,如降低有效濃度,與分析物結合。,.,2、熒光動力學分析法,非催化法催化法酶催化法,（1）非催化法通過測量非催化反應的速率而測定某種反應物的濃度。,.,（2）催化法以催化反應為基礎來測定物質含量的方法。催化反應速率與催化劑的濃度成正比，因此可測定催化劑的濃度，也可用于測定某些對催化反應起助催作用或抑制作用的物質。例:8-羥基喹啉-5-磺酸+過硫酸銨,Ag+,.,(3)酶催化法基于酶催化的反應，這類反應的突出優(yōu)點是它的特效性和高靈敏度,不僅可用來測定酶的活性,也可用來測定底物、活化劑和抑制劑.,.,3、反應速率的熒光法監(jiān)測假如化學反應的某種反應物或產物是熒光物質,便可利用熒光法來監(jiān)測反應的速率。記F-t曲線可通過正切法(斜率法)或固定時間法或固定熒光強度法獲得校正曲線。,.,（1）正切法從F-t曲線求反應速率,然后用作圖,c,.,(2)固定時間法使反應準確地進行到某一固定的時刻t，立即測定F,得到F-c曲線,c,F,.,(