分子生物學(xué)的基本竟能和策略1.ppt

1、周 俊 宜,分子生物學(xué)基本技能和策略,生化技術(shù) 電泳 層析 離心 分光光度 基因操作 其它,基因工程 分 切 接 轉(zhuǎn) 篩 表,電泳 層析 離心 分光光度 基因操作 其它 分（離目的基因） 切（割目的基因和載體） 接（連目的基因和載體） 轉(zhuǎn)（化宿主細(xì)胞） 篩（選陽(yáng)性克隆） 表（達(dá)目的基因）,基 本 模 式,“縱向”體系,“橫向”體系,1 理論部分,基因工程原理,生化技術(shù)原理,新技術(shù)講座,2 實(shí)驗(yàn)部分,分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 生化技術(shù)實(shí)驗(yàn),3 示教和錄像部分,實(shí)驗(yàn)原理 實(shí)驗(yàn)技術(shù),基因工程原理,基因重組：不同的DNA分子間發(fā)生共價(jià)連接形成重組DNA 分子。,1972年,P.Berg: 構(gòu)建第一個(gè)DNA重組分

2、子,1997年,動(dòng)物克隆: 克隆羊多莉,1977年，基因工程產(chǎn)品的出現(xiàn) H.W.Boyer,第一個(gè)基因工程產(chǎn)品(SS),1973年,S.S.Cohen:第一個(gè)基因克隆實(shí)驗(yàn),2001年，人類(lèi)基因組計(jì)劃,Boyer 和Cohen的實(shí)驗(yàn),Boyer 和Cohen的實(shí)驗(yàn),培養(yǎng)平皿,大腸桿菌,抗四環(huán)素,抗卡那霉素,抗四環(huán)素抗卡那霉素,人體生長(zhǎng)激素釋放激素(SS),抑制和調(diào)節(jié)多種激素的作用,目的基因,基因載體,重組體,分,切,接,轉(zhuǎn),篩,表,總體技術(shù)路線(xiàn),目的基因及載體的分離,1 目的基因的獲取,需要克隆的DNA片段：,化學(xué)合成法,cDNA文庫(kù) 基因組DNA文庫(kù),聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),分,分,分,1）化學(xué)合成法

3、：,較短的基因（60-80bp） 用途：PCR引物 測(cè)序引物 定點(diǎn)突變 核酸雜交探針,2）基因文庫(kù),限制性?xún)?nèi)切酶,克隆、轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)、鑒定,基因組DNA,基因文庫(kù),基因組DNA文庫(kù),限制性?xún)?nèi)切酶,基因組DNA,基因重組,轉(zhuǎn)化細(xì)菌,體外包裝,cDNA文庫(kù)的組建：,基因重組,反轉(zhuǎn)錄酶,mRNA,cDNA,引物,引物,3,5,5,5,3）PCR技術(shù),基因組,PCR技術(shù)的基本過(guò)程,模板DNA dNTP 引物 Buffer,預(yù)變性,模板DNA dNTP 引物 Buffer,TaqDNA聚合酶,循環(huán)儀,94oC5,94 55 72 ,2 載體DNA的選擇,功能： 為目的基因提供進(jìn)入受體細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。 為目

4、的基因提供在受體細(xì)胞中的復(fù)制能力或整合能力。 為目的基因提供在受體細(xì)胞中的擴(kuò)增和表達(dá)能力。,目的基因,整合在宿主細(xì)胞染色體DNA中,獨(dú)立于宿主細(xì)胞染色體DNA外,（獨(dú)立的復(fù)制子功能）,基因載體,理想載體的基本條件：,可轉(zhuǎn)移性 合適的復(fù)制位點(diǎn) 多克隆位點(diǎn)：廣泛、特異 選擇標(biāo)志，便于篩選和鑒定 分子較小，可容納較大的外源DNA,質(zhì)粒 噬菌體 腺病毒載體 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 ,種類(lèi)：,存在于細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀DNA分子。 具有自我復(fù)制功能。 帶有抗性基因及表型識(shí)別等遺傳性標(biāo)記物。 經(jīng)改造后具有多克隆位點(diǎn)。 舉例：pBR322質(zhì)粒,質(zhì)粒,宿主細(xì)胞,ori,抗Amp,宿主細(xì)菌,含Amp培養(yǎng)基,多克隆位點(diǎn)

5、,ori,復(fù)制起始點(diǎn),遺傳標(biāo)記,Amp,polylinker,基因載體, 噬菌體載體,50kb,+,LA,RA,LA,RA,EcoR ,EcoR ,lacZ,cI,限制性?xún)?nèi)切酶酶切,切,酶切,限制性?xún)?nèi)切核酸酶 在特異位點(diǎn)上切割DNA分子 分三類(lèi)，常用為類(lèi)酶 識(shí)別序列呈回文對(duì)稱(chēng) 命名：酶來(lái)源的生物名稱(chēng)縮寫(xiě) 屬名-種名-株名-發(fā)現(xiàn)次序,5- GAATTC-3 3- CTTAAG -5,5- GTTAAC-3 3- CAATTG -5,EcoR的識(shí)別序列,Hae的識(shí)別序列,5NNNNNNNGAATTCNNNNNNNN3 3NNNNNNNCTTAAGNNNNNNNN5,5NNNNNG 3NNNNNCT

6、TAAp,EcoR的識(shí)別序列和酶切切口（粘端）,pAATTCNNNNNN3 GNNNNNN5,5NNNNNNGTTAACNNNNN3 3NNNNNNCAATTGNNNNN5,5NNNNNGTT pAACNNNNN3 3NNNNNCAAp TTGNNNNN5,Hae的識(shí)別序列和酶切切口（平端）,磷酸二酯鍵的形成,DNA連接酶,DNA連接酶,DNA連接酶,目的基因與載體的連接,接,T4-DNA連接酶： T4-噬菌體 連接溫度：不高于粘性末端熔點(diǎn)溫度（Tm） 15： 15/6h； 12/8h； 8/12h；,連接方式： 相同粘性末端的連接 平頭末端的連接 不同粘性末端的連接 人工粘性末端的連接,粘端

7、連接,CCGG CCGG,GGCC GGCC,CGG C,C GGC,CGG C,C GGC,CCGG,GGCC,Hap,T4-DNA連接酶,平端連接,AGCT,TCGA,Alu,DNA連接酶,AGCT AGCT,TCGA TCGA,重組體的轉(zhuǎn)化,受體細(xì)胞,轉(zhuǎn),JM109感受態(tài),含氨芐平板,Am,重組質(zhì)粒,感受態(tài),原核細(xì)胞的轉(zhuǎn)化（細(xì)菌轉(zhuǎn)化）,1)受體細(xì)胞的選擇,限制缺陷型: 避免修飾和降解 重組缺陷型：避免重組整合 轉(zhuǎn)化親和型：較高的可轉(zhuǎn)化性 遺傳互補(bǔ)型：利于篩選 感染缺陷型：防止感染,2）轉(zhuǎn)化方法,CaCl2誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化 電穿孔 PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化 人工體外包裝,特殊處理,受體細(xì)胞,細(xì)胞膜特性改變,

8、CaCl2處理,受體細(xì)菌,50-100mmol/L,CaCl2,感受態(tài)細(xì)菌,重組體轉(zhuǎn)入細(xì)菌,基因重組,轉(zhuǎn)染,體外包裝,噬菌體,噬菌體體外包裝,3）轉(zhuǎn)化率：轉(zhuǎn)化細(xì)胞/細(xì)胞總數(shù) 影響因素： 載體：載體性質(zhì)、空間結(jié)構(gòu)、分子大小等 受體細(xì)胞 轉(zhuǎn)化過(guò)程,重組體克隆的篩選與鑒定,篩,宿主細(xì)胞,轉(zhuǎn)化后的克隆群體：,1遺傳檢測(cè)法,1）抗藥性標(biāo)志的選擇,pBR322,Amp,Tet,插入片段,Amp平板,Tet平板,2）標(biāo)志補(bǔ)救（-半乳糖苷酶法）,（LacZ基因 N端序列）,插入片段,（LacZ基因失活）,LacZ基因 N端序列,LacZ酶,2 電泳檢測(cè)法,凝膠電泳檢測(cè),加樣孔,DNA Marker,空質(zhì)粒,重

9、組質(zhì)粒,重組質(zhì)粒酶切,重組質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增片段,原位雜交,3 菌落雜交篩選法,4 免疫化學(xué)檢測(cè)法,放射性抗體檢測(cè)法,濾膜（固定抗體）,+,5 DNA序列檢測(cè),外源基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá),重組子,目的基因的mRNA,表達(dá)蛋白質(zhì),大腸桿菌（ E.coli）受體細(xì)胞,表,1 E.coli表達(dá)體系 優(yōu)勢(shì)： 一種成熟的基因克隆表達(dá)的受體細(xì)胞 繁殖迅速，培養(yǎng)代謝易于控制 易于進(jìn)行遺傳操作和高效表達(dá),不足之處： 1）缺乏適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄后和翻譯后加工機(jī)制。 2）缺乏表達(dá)蛋白質(zhì)復(fù)性系統(tǒng)，表達(dá)蛋白無(wú)特異性空間結(jié)構(gòu)。 3）表達(dá)產(chǎn)物不穩(wěn)定，易被細(xì)菌蛋白酶降解。,2目的基因在E.coli中的高效表達(dá),三個(gè)因素： 強(qiáng)化蛋白質(zhì)的生物合成 抑制蛋白質(zhì)的降解 恢復(fù)蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象,3目的基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè),1）蛋白質(zhì)的PAGE,對(duì)照 樣品 Marker,2）表達(dá)蛋白生物學(xué)功能檢測(cè),淀粉酶基因表達(dá),4目的蛋白的分離純化,分子篩 親和柱 離子交換 抗原抗體,目的蛋白,基因載體,目的基因,質(zhì)粒 噬菌體 病毒,PCR cDNA 人工合成 基因文庫(kù),限制性?xún)?nèi)切酶,有切口的載體,有切口的目的基因,DNA連接酶,重組體,轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)染 體外