果糖及低聚果糖的分離 純化

1、果糖及低聚果糖的分離、純化目錄一、除雜2二、脫色21.活性炭脫色22.新生態(tài)碳酸鈣法脫色23.樹脂脫色23.1 LSA-8吸附樹脂23.2 D318樹脂24.離子交換2三、提純31分子量不同的糖的分離31.1 納濾分離31.2 分級納濾分離31.3 柱層析凝膠分離42.相同分子量的糖的分離42.1 葡萄糖和果糖的分離42.1.1化學試劑法42.1.2吸附分離42.1.3 GOD-CAT雙酶法氧化52.1.4復鹽法52.1.5連續(xù)色譜分離（CSEP）53.手性拆分63.1分子印跡聚合物分離手性分子63.1.1功能單體的選擇63.1.2 M I P s的制備63.2手性膜拆分法73.3優(yōu)先結晶方法

2、73.4 化學拆分法83.4.1生成非對應異構體拆分法83.4.2生物化學拆分法8參考文獻9一、除雜1.通過低溫下冷凍和用乙醇-正己烷除去油脂和脂類物質；2.加入磷酸和氫氧化鈣，絮凝沉淀出果膠；3.用鹽析法、等電點法、溶劑沉淀法（sevage法）除去蛋白質；4.加淀粉酶除去淀粉；5.用陽離子聚丙烯酞胺吸附溶液中帶負電荷的部分如蛋白質、多糖、蹂質、樹膠、淀粉和單寧等，最佳條件52，pH=6，CPAM添加量為0.08%，絮凝時間3h.二、脫色1.活性炭脫色通過極差最優(yōu)化分析，確定出最佳影響因素pH脫色溫度脫色時間活性炭用量，最優(yōu)化工藝條件為:活性炭用量1.4%，脫色溫度70，pH值3.8，脫色時間

3、50min.【1】經(jīng)試驗驗證的透光率為99.7%，同時在實驗過程中用高效液相色譜方法檢測活性炭脫色后的低聚果糖溶液中低聚果糖含量，結果顯示低聚果糖在脫色前后并無損失.2.新生態(tài)碳酸鈣法脫色在低聚果糖液中加入Ca(OH)2混合均勻后，再緩慢通入CO2來反應生成碳酸鈣，這時新生態(tài)碳酸鈣便與低聚果糖液中的色素發(fā)生吸附作用，從而達到脫色的效果.在原樣液錘度:190Bx透光率:92.31%，pH值:6.4電導率:26mV的條件下，測試結果不如活性炭. 【1】3.樹脂脫色3.1 LSA-8吸附樹脂在溫度為70，pH為6的條件下用脫色2h，實驗結果色素的吸附率高達92.35%；【14】3.2 D318樹脂樹

4、脂用量為低聚果糖樣品溶液的3.7%，pH=5.2，脫色時間3h，脫色溫度為52.4.離子交換鐘振聲等選擇了D392大孔陰離子交換樹脂對大豆低聚糖進行脫色，在與低聚糖比為1:11的條件下，常溫脫色3-4小時，色素的吸附率達86%.【14】三、提純低聚果糖溶液中非有效成分葡萄糖、果糖、蔗糖，其相對分子質量分別為180，180，342；有效成分蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖的相對分子量分別為504，666，828.1分子量不同的糖的分離1.1 納濾分離最佳條件：跨膜壓差為1.1 MPa，料液濃度為10 g/100 g，溫度40，循環(huán)流量6 L/min， pH=6. 【13】物料初始濃度30g/L、操作

5、壓力0.2Mpa、純化15倍.【12】1.2 分級納濾分離先將樣品通過0.3微米的微濾膜，將其透過液作為分級納濾的母液.【1】采用全回流方式，對樣品共進行兩級納濾膜分離處理和一次反滲透膜回收處理.第一級納濾膜分離，在0.3MPa，25，初始料液濃度為10倍稀釋下，選用JN 1812-34納濾膜，對原始料液進行分離，之后三倍洗脫，截留蔗果五糖；第二級納濾膜分離，在0.4MPa，25下，選用DK1812C-47D納濾膜，對一級納濾的透過液進行分離，截留蔗果三糖與蔗果四糖；經(jīng)過兩級納濾和反滲透分離，可以將低聚果糖溶液按其所含溶質的不同分為三部分，分別800部分為蔗果五糖、200800部分為低聚果糖和

6、200部分為葡萄糖、果糖及部分蔗糖混合物.最后對二級透過液進行反滲透膜過濾，回收其中的葡萄糖、果糖等成分和大量的水.工藝流程圖如下：為了避免因膜污染而造成的實驗誤差，每處理完一次樣品后，均用蒸餾水對納濾裝置和納濾膜進行3次清洗，每次清洗時間約為8min.如果長時間(大于一周)應該先用濃度為2%的表面活性劑進行清洗，最后用蒸餾水沖洗至無泡沫為止.將清洗干凈的膜管保存在0.5%的甲醛溶液或1%的亞硫酸氫鈉溶液中，以防止長霉長菌，損壞膜表面層.實驗證明，沖洗時間和浸泡時間分別為60 min和90 min時二者都可使膜的純水透過通量恢復系數(shù)達到100%左右.【13】1.3 柱層析凝膠分離 吸取一定量低

7、聚果糖(過0.45微米的膜)均勻滴加在層析柱聚丙烯酞胺凝膠表面，打開底部閥門，待低聚果糖剛好滲入凝膠時關閉閥門，用少量的脫氣超純水洗下殘留在柱壁上的糖液，打開閥門讓洗脫液剛好滲入凝膠表面后關閉.接上泵開始洗脫，同時將柱下端接在蒸發(fā)光散射檢測器(N2流速為2.5L/min，溫度為100)上直接進行檢測分析.【1】 在1.6cm*100cm的玻璃柱上最佳的層析條件:洗脫速度0 2 mL/min上樣量0. 5 mI_(樣液質量濃度0.4g/ml)、柱溫40，以Megazaae公司的標準品為對照，經(jīng)HPLC和MS分析，證明層析分離所得組分峰4峰、3和峰2分別是蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖。而且經(jīng)HPL

8、C面積歸一化法定量分析，證明分離產(chǎn)品蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖蔗和果六糖的含量分別為99.9%、 99.94%、99.33%和97.89%?！?7】2.相同分子量的糖的分離2.1 葡萄糖和果糖的分離2.1.1化學試劑法取混合物少許于潔凈的試管中，然后滴入澄清的石灰水，振蕩，不久有沉淀出現(xiàn).化學反應式如下：C6H12O6(葡萄糖) + Ca(OH)2 C6H12O6Ca(OH)2(葡萄糖化鈣)C6H12O6（果糖) + Ca(OH)2+H20 C6H12O6Ca(OH)2H20(果糖化鈣)把上述濁液進行過濾，取沉淀于盛有少量水的試管中，然后通入CO2，又有沉淀出現(xiàn).CO2 + C6H12O6C

9、a(OH)2H20 CaC03+ C6H12O6 + 2H20過濾后將濾液蒸發(fā)、結晶，即得果糖晶體.在上面濾出的葡萄糖化鈣溶液中通入CO2，同樣有沉淀出現(xiàn).CO2 + C6H12O6Ca(OH)2 CaC03+ C6H12O6 + 2H20過濾后將濾液蒸發(fā)、結晶，即得葡萄糖晶體.【3】2.1.2吸附分離2.1.2.1聚苯乙烯型強酸性陽離子交換樹脂吸附分離柱為一根直徑為8 mm，長為400 mm帶有恒溫夾套的玻璃柱.柱內(nèi)填充經(jīng)Ca2+離子交換后的聚苯乙烯型強酸性陽離子交換樹脂，先吸取一定量的糖液，從吸附柱上方以一定的速度滴入，待糖液加完后，繼續(xù)用同樣的速度加蒸餾水將糖份洗脫，整個加入液體的速度控

10、制在與吸附柱流出液的速度近乎相等為宜，以保持液面位置及柱內(nèi)液體流速恒定.在加完糖樣同時開始在吸附柱下端收集流出液.【15】溫度控制為(34.8-35.2)，洗脫液為去離子水最佳分離條件為：進樣質量分數(shù)10.5%、進樣體積5 m1，洗脫速率0. 282 mL/min，在分離時間達到100 min左右時，流出液中果糖含量可達90%(干基). 【5】2.1.2.2 模擬移動床(SMB)技術SMB是一種利用色譜吸附分離原理進行液體操作的設備.它以逆流連續(xù)操作方式，通過變換固定床吸附設備的物料進出口位置，產(chǎn)生相當于吸附劑連續(xù)向下移動，而物料連續(xù)向上移動的效果.吸附塔內(nèi)的吸附劑對果糖的滯留作用遠大于葡萄糖

11、.當精制后的糖液進入裝有吸附劑的吸附塔后，果糖被吸附，而葡萄糖不被吸附，在解吸劑的作用下葡萄糖與解吸劑先從吸附塔一端流出，而果糖與解吸劑最后流出，除去解吸劑，得到果糖和葡萄糖，達到分離的目的.為了連續(xù)高效地分離，若干吸附塔串聯(lián)，各部分進、出料口接上管線通過分配系統(tǒng)，經(jīng)多通旋轉分配閥定時同時向前逐一切換，以實現(xiàn)連續(xù)分離.經(jīng)過SMB的分離操作后所得產(chǎn)物的果糖含量高達90%.【7】2.1.3 GOD-CAT雙酶法氧化在葡萄糖氧化酶的催化作用下把葡萄糖氧化生成葡萄糖酸和過氧化氫，形成的過氧化氫被過氧化氫酶作用放出1/2 O2，供反應體系的需要.反應過程中，加入氫氧化鈣調整反應pH值，使產(chǎn)生的葡萄糖酸與

12、鈣離子結合生成葡萄糖酸鈣，再結晶，經(jīng)過分離純化即可制得葡萄糖酸鈣.這樣就可將水解液中的葡萄糖和果糖分離.反應方程式如下：最佳工藝條件:反應溫度35，pH5.5，酶用量GOD 85u/g葡萄糖，CAT 1235u/g葡萄糖，底物濃度20%（w/v），反應20h.【9】2.1.4復鹽法混合糖液與氯化鈣作用，生成果糖一CaCl2的復鹽，或與NaCl作用生成葡萄糖-NaCl的復鹽，然后使其自母液中分離.【7】2.1.5連續(xù)色譜分離（CSEP）用泵向樹脂柱進料，進料液濃度為50.54 g/100g，pH值4.0，體積68m1，進料結束立即泵入去離子水，操作溫度60 ，進料、洗脫流速為7m1/min.收集

13、流出液.駐留時間為20min，在20min內(nèi)進料340m1，洗脫水量735m1，洗脫回填量535m1，再吸附區(qū)回填量495m1.由檢測結果知，洗脫液(果糖產(chǎn)品)的純度為98.64%，果糖濃度39.29%，葡萄糖產(chǎn)品中的葡萄糖純度為98.58%，果糖提取收率98.35% .圖中慢流出產(chǎn)品為果糖產(chǎn)品，快流出產(chǎn)品為葡萄糖產(chǎn)品，洗脫劑為去離子水，吸附劑為樹脂.【7】3.手性拆分3.1分子印跡聚合物分離手性分子分子印跡技術主要在聚合過程中引入模板分子(包括原子、離子、分子、復合物或分子、離子、大分子的聚集體)，通過模板分子與功能單體結合形成結合位點，交聯(lián)后將模板分子固定在聚合物中，隨后除去部分或者全部模

14、板分子，形成孔穴，通過識別位點與分子印跡孔穴的共同作用來識別模板分子.采用該技術制備的聚合物通常稱為分子印跡聚合物（MIPs) .【8】3.1.1功能單體的選擇果糖中含有醇羥基，為弱酸性基團，易于與堿性功能單體形成氫鍵作用.因此選擇弱堿性的丙烯酞胺(AM)和2一乙烯毗嚨(2-VP)兩種功能單體來制備MIPs.利用1H NMR研究功能單體與模板分子通過氫鍵作用后醇羥基質子化學位移的變化，確定分子上的醇羥基能夠與功能單體發(fā)生氫鍵作用.3.1.2 M I P s的制備在5OmL的兩口燒瓶中加入一定量的模板分子，再加入適量乙腈作為致孔劑.加入一定比例的功能單體，超聲通氮排氧，于冰水浴中預聚合8h.再加

15、入EDMA交聯(lián)劑和引發(fā)劑.之后超聲1-2min，通氮氣10min除氧，置于60水浴中聚合12h.聚合反應后得到的白色固體經(jīng)粉碎、研磨、過篩，取粒徑為20一60微米之間的顆粒，用丙酮沉降三次，除去過小的顆粒，于60下真空干燥后備用.將真空干燥后的MIPs以干法添加到HPLC色譜柱中.裝入MIPs的總量約為0.8g.以MIPs作為高效液相色譜固定相，拆分果糖的外消旋體.3.2手性膜拆分法 用于手性拆分的支撐液膜是將膜液(溶劑和手性選擇劑)通過毛細管力吸附在多孔固體膜(液體的支撐膜)的孔道中，這種液膜也可稱為浸漬式液膜。 在支撐液膜(SLM)中，具有手性選擇能力的載體溶解于一定的液體溶劑之中，通過與

16、某個對映異構體特異性的結合，將其從上相運輸?shù)较孪啵瑥亩鴮崿F(xiàn)手性分離.分離果糖的D,L構型，可嘗試酒石酸等手性選擇劑。Hadik等用基于多孔聚丙烯中空纖維膜的支撐液膜研究了D，L乳酸的拆分.作為手性選擇劑的N-3，5一二硝基苯甲?；?L-丙氨酸-辛酯溶解在疏水的液膜(甲苯)中，整個溶液固定在多孔聚丙烯中空纖維膜的孔中，最終將D,L-乳酸分開.【11】3.3優(yōu)先結晶方法也叫接種結晶拆分法，在飽和或過飽和的外消旋體溶液中加入一個對映異構體的晶種，使該對映異構體稍稍過量因而造成不對稱環(huán)境，這樣旋光性與該晶種相同的異構體就會從溶液中結晶出來.【10】對于不生成外消旋混合物的化合物，將其轉化成鹽，接種結晶

17、拆分法工藝簡單，成本較低目，效果較好;但通常只能間歇生產(chǎn)，一次收率較低。【18】3.4 化學拆分法3.4.1生成非對應異構體拆分法 該法利用手性試劑與外消旋體反應，生成兩個非對映異構體，再利用它們物理性質(如溶解度、蒸汽壓、吸收系統(tǒng)等)的不同，將其拆分，最后再把這兩個非對映異構體分別復原為原來的對映體。通常拆分堿性物質用酸性拆分劑，拆分酸性物質用堿性拆分劑?！?8】常用的拆分劑有嗅化樟腦磺酸、-苯基乙胺、酒石酸等。Yamada S.等用嗅化樟腦磺酸作為拆分劑，對DL一P一HPG進行拆分，多次循環(huán)D一HPG的最終收率可達92%。此法反應步驟長、收率低，通常拆分劑價格昂貴，關鍵是選擇好拆分劑，使其

18、達到使用周期長、回收容易的目的。 3.4.2生物化學拆分法 某些微生物和霉菌在外消旋體的稀溶液中生長時，破壞其中一種對映體的速度比另一種快。例如酵母在DL -氨基酸中，易與L一對映體反應而剩下D一對映體，從而達到拆分的目的。生物化學拆分法可用完整的微生物細胞或從微生物中提取酶作為生物催化劑。生物催化劑的區(qū)域立體選擇性強、反應條件溫和、操作簡便、成本較低、公害少，且能夠完成一些化學方法難以完成的反應。但是生物拆分法也有菌種篩選困難、酶制劑不易保存、產(chǎn)物后處理工作量大以及通常只能得到一種對映體等缺點。 Yokozeki等以醛為原料，經(jīng)Bucherer:反應合成DL一5一對羥基苯乙內(nèi)酞脲，然后用惡臭假單胞菌的二氫嘧啶酶催化選擇性水解為N一氨甲酞一D一HPG，再經(jīng)化學或酶法脫氨甲?；肈-HPC，收率達92 %?！?8】參考文獻【1】武金良. 高純低聚果糖分離純化技術的研究D. 廣西大學, 2008.【2】張濤,江波. 發(fā)酵法生成高純度低聚糖J. 無錫輕工大學學報, 2002, 21(3).【3】孫洪登. 分離葡萄糖和果糖 混合物的實驗J. 化學教學, 1995(4).【4】李秀琴,楊星惠,安素欣. 低聚果糖的純化方法J.河北化工,2003(1)【5】劉佐才,侯平然. 果糖與葡萄糖的分離 J. 北京理工