考馬斯亮藍結(jié)合法測定蛋白質(zhì)含量

1、本次實驗項目：考馬斯亮藍結(jié)合法測定蛋白質(zhì)濃度本次實驗課時：驗證性4學時教學要求： 1掌握考馬斯亮藍法定量測定蛋白質(zhì)含量的原理和方法。2學會使用721或7220型分光光度計并了解儀器的基本結(jié)構(gòu)。3能夠?qū)嶒灲Y(jié)果做出正確判斷重 點：考馬斯亮藍法定量測定蛋白質(zhì)含量的原理和方法教學手段及教具：課堂講授，學生實驗操作。講授內(nèi)容及時間分配：課堂講授1蛋白質(zhì)含量測定的相關(guān)知識 0.3 學時2實驗目的 0.1 學時3實驗原理 0.2 學時4儀器、材料和試劑 0.1 學時5操作步驟及注意事項 0.3 學時實驗教學考馬斯亮藍結(jié)合法測定蛋白質(zhì)含量的操作過程 2 學時參考資料生物化學實驗指導書 實驗教學教案首頁考馬斯

2、亮藍結(jié)合法測定蛋白質(zhì)濃度相關(guān)知識蛋白質(zhì)含量測定法在選擇方法時應考慮以下幾點：（1）實驗對測定所要求的靈敏度和精確度；（）蛋白質(zhì)的性質(zhì)；（）溶液中存在的干擾物質(zhì)；（）測定所要花費的時間。.比色分析法溶液的顏色和光的選擇吸取光的吸收定律：T%與A或EAKCL比色分析的基本原理考馬斯亮藍：當它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榈鞍踪|(zhì)-色素結(jié)合物。Coomassie brilliant blue G-250考馬斯亮藍R250：R250中的R代表Red，偏紅，R250屬于慢染，脫色脫的完全，主要用于電泳染色，max=560590nm.染色靈敏度比氨基黑高5倍.尤其適用于SDS電泳微量蛋白質(zhì)染色.但蛋白質(zhì)濃度超出一定范圍

3、時,對高濃度蛋白的染色不符合Beer定律,用作定量分析時要注意. 考馬斯亮藍G250：G250中的G就是Green，偏綠，G250屬于快染，脫色脫的不徹底，主要用于蛋白測定比考馬斯亮藍R250多二個甲基.;max=590610nm.染色靈敏度不如R250,但比氨基黑高3倍.優(yōu)點在于它在三氯乙酸中不溶而成膠體,能選擇地染色蛋白而幾乎無本底色.所以常用于需要重復性好和穩(wěn)定的染色,適于作定量分析.一、實驗目的1掌握考馬斯亮藍法定量測定蛋白質(zhì)含量的原理和方法。2學會使用721或7220型分光光度計并了解儀器的基本結(jié)構(gòu)。二、實驗原理考馬斯亮藍能與蛋白質(zhì)的疏水微區(qū)相結(jié)合，這種結(jié)合具有高敏感性?？捡R斯亮藍G

4、250的磷酸溶液呈棕紅色，最大吸收峰在465nm。當它與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復合物時呈藍色，其最大吸收峰改變?yōu)?95nm，考馬斯亮藍G250蛋白質(zhì)復合物的高消光效應導致了蛋白質(zhì)定量測定的高敏度。在一定范圍內(nèi)，考馬斯亮藍G250蛋白質(zhì)復合物呈色后，在595nm下，吸光度與蛋白質(zhì)含量呈線性關(guān)系，其顏色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比，而與蛋白質(zhì)的分子量及氨基酸成分無關(guān)，因此被廣泛地應用。在一定的實驗條件下，未知樣品的溶液與標準蛋白質(zhì)溶液同時反應，并于595nm下比色，可以通過標準蛋白質(zhì)的標準曲線求出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度。三、實驗儀器、材料和試劑（一）儀器吸量管（1毫升，2毫升，5毫升）、試管及試管架、721或

5、7220型分光光度計。（二）材料和試劑1 標準蛋白溶液：牛血清白蛋白(0.1mg/ml)，準確稱取牛血清白蛋白0.2g，用0.9NaCl溶液并稀釋至2000ml。2 末知濃度的蛋白液：3染液：考馬斯亮藍G250(0.01%)，稱取0.1g考馬斯亮藍G250溶于50ml95%乙醇中，再加入100ml濃磷酸，然后加蒸餾水定容到1000ml。4. 0.9%NaCl溶液四、實驗操作步驟（一）標準曲線的制備管號試劑1（空白）234567標準蛋白液0.9%NaCl/ml考馬斯亮藍液/ml蛋白質(zhì)濃度/（g）A595nm1.04.000.10.94.0100.20.84.0200.30.74.0300.40.

6、64.0400.50.54.0500.60.44.060混勻室溫靜置，15分鐘內(nèi)比色，讀取吸光度，以吸光度為縱坐標，各標準管蛋白含量為橫坐標作圖得標準曲線。（可將值代入線性回歸方程軟件，求出直線方程和r值）（二）未知樣品蛋白質(zhì)濃度的測定1 取4支分兩組，各加入一定量的不同稀釋濃度的待測液（兩兩相同）。2 分別加0.9NaCl溶液補足到1毫升。3 分別加入4毫升考馬斯亮藍G250試劑，在室溫下放置,15分鐘以內(nèi)595nm進行比色。問題：標準蛋白液的量填入表格？移液管使用注意事項？分光光度計的使用及比色過程注意事項？如何操作才能保證標準曲線的可靠性？4 在595毫微米波長下7220型分光光度計比色、讀數(shù)，記錄各管A值。其值要在標準管吸光度范圍內(nèi)，每組求平均值。問題：待測液中選擇吸光值在標準曲線范圍內(nèi)的作為計算基礎？如何選擇未知樣品的用量？五、實驗結(jié)果與討論1.確定出要用于