微生物代謝工程答案

1、1. 微生物代謝工程定義、研究內容和研究手段。定義：通過某些特定生化反應的修飾來定向改善細胞的特性功能，運用重組DNA技術來創(chuàng)造新的化合物。研究內容：生物合成相關代謝調控和代謝網絡理論；代謝流的定量分析；代謝網絡的重新設計；中心代謝作用機理及相關代謝分析；基因操作。研究手段：代謝工程綜合了基因工程、微生物學、生化工程等領域的最新成果。因此，在研究方法和技術方面主要有下列三大常用手段：(1)檢測技術：常規(guī)的化學和生物化學檢測手段都可用于代謝工程的研究，如物料平衡、同位素標記示蹤法、酶促反應動力學分析法、光譜學法、生物傳感器技術。(2)分析技術：采用化學計量學、分子反應動力學和化學工程學的研究方法

2、并結計算機技術，闡明細胞代謝網絡的動態(tài)特征與控制機理，如穩(wěn)態(tài)法、擾動法、組合法和代謝網絡優(yōu)化等。(3) 基因操作技術：在代謝工程中，代謝網絡的操作實質上可以歸結為基因水平上的操作：涉及幾乎所有的分子生物學和分子遺傳學實驗技術，如基因和基因簇的克隆、表達、調控，DNA 的雜交檢測與序列分析，外源DNA的轉化，基因的體內同源重組與敲除，整合型重組DNA 在細胞內的穩(wěn)定維持等。2. 代謝改造思路和代謝設計原理。代謝改造思路：根據微生物的不同代謝特性，常采用改變代謝流、擴展代謝途徑和構建新的代謝途徑三種方法。(1)改變代謝途徑的方法：加速限速反應，增加限速酶的表達量，來提高產物產率。改變分支代謝途徑流

3、向，提高代謝分支點某一分支代謝途徑酶活力，使其在與其它的分支代謝途徑的競爭中占據優(yōu)勢，從而提高目的代謝產物的產量。(2)擴展代謝途徑的方法：在宿主菌中克隆和表達特定外源基因，從而延伸代謝途徑，以生產新的代謝產物和提高產率。擴展代謝途徑還可使宿主菌能夠利用自身的酶或酶系消耗原來不消耗的底物。(3)轉移或構建新的代謝途徑：通過轉移代謝途徑、構建新的代謝途徑等方法來實現。代謝設計原理：現存代謝途徑中改變增加目的產物代謝流：增加限速酶編碼基因的拷貝數；強化關鍵基因的表達系統；提高目標途徑激活因子的合成速率；滅活目標途徑抑制因子的編碼基因；阻斷與目標途徑相竟爭的代謝途徑；改變分支代謝途徑流向；構建代謝旁

4、路；改變能量代謝途徑；在現存途徑中改變物流的性質：利用酶對前體庫分子結構的寬容性；通過修飾酶分子以拓展底物識別范圍；在現存途徑基礎上擴展代謝途徑：在宿主菌中克隆、表達特定外源基因可以延伸代謝途徑，從而生產新的代謝產物、提高產率。3. 微生物的基因操作技術有哪些？（舉兩例說明） 微生物的基因操作技術有：核酸的凝膠電泳、核酸的分子雜交技術、DNA序列分析、基因的定點誘變、細菌的轉化、利用DNA與蛋白質的相互作用進行核酸研究、PCR技術等?；蚨c突變(site-directed mutagenesis)：通過改變基因特定位點核苷酸序列來改變所編碼的氨基酸序列，用于研究氨基酸殘基對蛋白質的結構、催化

5、活性以及結合配體能力的影響，也可用于改造DNA調控元件特征序列、修飾表達載體、引入新的酶切位點等。主要采用兩種PCR方法，包括重疊延伸技術和大引物誘變法。在硫化細菌核苷水解酶對底物專一性的研究中，采用定點突變技術，對編碼221位和228位氨基酸的DNA序列進行突變，改變兩個位點的氨基酸，從而研究氨基酸殘基對底物結合的影響?；蚯贸?gene knock-out)：又稱基因打靶，通過外源DNA與染色體DNA之間的同源重組，進行精確的定點修飾和基因改造，具有專一性強、染色體DNA可與目的片段共同穩(wěn)定遺傳等特點，可分為完全基因敲除和條件型基因敲除。在谷氨酸棒桿菌生產纈氨酸的研究中，采用基因敲除的方法

6、進行高產菌株構建。如ilvA基因敲除，使蘇氨酸脫氨酶的合成減少，降低異亮氨酸合成的前體，從而減少異亮氨酸的合成，增加纈氨酸的生成。4. 什么是酶的反饋抑制，以纈氨酸代謝途徑來舉例說明。酶的反饋抑制：指最終產物抑制作用，即在合成過程中有生物合成途徑的終點產物對該途徑的酶的活性調節(jié)，所引起的抑制作用，包括順序反饋抑制、同工酶的反饋抑制、協同反饋抑制、累積反饋抑制、增效反饋抑制。以纈氨酸為例：纈氨酸由丙酮酸合成，涉及四個反應，分別由四個酶催化，依次為乙酰羥酸合酶(AHAS)、乙酰羥酸同分異構酶(AHAIR)、二羥酸脫水酶(DHAD)和支鏈氨基酸轉氨酶(TA)。首先，由AHAS將兩分子丙酮酸縮合成2-

7、乙酰乳酸；其次，AHAIR將2-乙酰乳酸轉化為雙羥基異戊酸；再次，由DHAD將雙羥基異戊酸脫水形成2-酮異戊酸；最后，TA將2-酮異戊酸轉化為L-纈氨酸。L-纈氨酸和L-異亮氨酸的合成共享AHAS 、AHAIR、DHAD和TA等4種酶。如AHAS以丙酮酸為底物則合成L-纈氨酸，而用丙酮酸和2-酮丁酸為底物則合成L-異亮氨酸。纈氨酸合成反饋抑制的主要對象是其合成途徑上的第一個關鍵酶乙酰羥酸合酶（AHAS），同時纈氨酸和異亮氨酸的合成酶系受三個末端產物纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的多價阻遏。因此，如果解除AHAS的反饋抑制和纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物酶系的阻遏，必將大大提高纈氨酸的積累。為此可選育纈

8、氨酸結構類似物抗性突變株來解除纈氨酸的反饋調節(jié)。如抗纈氨酸突變株的獲得，或者利用分子手段對關鍵酶基因進行定點突變。5. 微生物酶的自動調節(jié)方式（舉兩例說明）。微生物并不是在所有空間、時間內合成它所能合成的全部酶，在一定生理條件下只合成它當時所需要的酶，且酶的活力受到控制。微生物主要在轉錄水平、翻譯水平、蛋白質水平、不同空間分布和細胞水平上進行酶的調節(jié)，此外對信號傳導的響應也起到調節(jié)作用。（1）以轉錄水平上營養(yǎng)阻遏機制為例來說明酶的調節(jié)： 轉錄水平上的調節(jié)是通過調節(jié)酶量進行的。在細胞培養(yǎng)過程中，當培養(yǎng)基中含有能被細胞迅速利用的碳源（如葡萄糖）時，其在降解過程中的某代謝產物阻遏了其余降解酶系的合成

9、，這種現象被稱為“降解物阻遏”。 環(huán)腺苷酸受體蛋白（CRP）能與環(huán)腺苷酸（cAMP）結合形成cAMP-CRP復合物。當cAMP-CRP結合于DNA時，能促進RNA聚合酶與啟動子結合，從而促進轉錄。葡萄糖分解代謝物能抑制腺苷酸環(huán)化酶活性并活化磷酸二酯酶，從而降低cAMP濃度，不能形成cAMP-CRP復合物，降低了各種酶蛋白基因的轉錄，起到調節(jié)相關代謝酶的作用。（2）以蛋白質水平上酶的共價修飾為例來說明酶的調節(jié)：酶的共價修飾時調節(jié)酶活性的重要方式，通過其他酶對多肽鏈上某些基團進行可逆的共價修飾，使處于活性與非活性的互變狀態(tài)，從而調節(jié)酶的活性，如磷酸化、腺苷酰化、甲基化等。磷酸化酶激酶催化的反應既可

10、以是通過磷酸化作用使無活性的磷酸化酶b轉化為有活性的磷酸化酶a ，也可以是通過磷酸化酶磷酸酶的水解作用使磷酸化酶a脫去磷酸而轉化為無活性的磷酸化酶b。6. 微生物基因水平的調控策略，請舉例說明 基因調控是生物體內控制基因表達的機制?；虮磉_的主要過程是基因的轉錄和信使核糖核酸(mRNA)的翻譯?；蛘{控主要發(fā)生在三個水平上,即DNA水平上的調控、轉錄控制和翻譯控制；微生物通過基因調控可以改變代謝方式以適應環(huán)境的變化，這類基因調控一般是短暫的和可逆的；多細胞生物的基因調控是細胞分化、形態(tài)發(fā)生和個體發(fā)育的基礎,這類調控一般是長期的,而且往往是不可逆的?；蛘{控的研究有廣泛的生物學意義，是發(fā)生遺傳學

11、和分子遺傳學的重要研究領域。原核生物的基因調控主要發(fā)生在轉錄水平上。根據調控機制的不同可分為負轉錄調控和正轉錄調控。真核生物的基因調控比原核生物復雜得多。(1)負控誘導系統：大腸桿菌的lac i基因與乳糖操縱子（lactose operon）的作用是典型的負控誘導系統。在這個系統中，i基因是調節(jié)基因，當它的產物阻遏蛋白與操縱區(qū)（lac O）結合時，RNA聚合酶便不能轉錄結構基因，因此，在環(huán)境中缺乏誘導物（乳糖或IPTG）時，乳糖操縱子是受阻的。而當環(huán)境中有乳糖時，進入細胞的乳糖在細胞內尚存在的極少量的-半乳糖苷酶的作用下而發(fā)生分子重排，由乳糖變成異乳糖，異乳糖作為誘導物與阻遏蛋白緊密結合，使后

12、者的構型發(fā)生改變而不能識別lac O，也不能與之結合，因而RNA聚合酶能順利轉錄結構基因，形成大分子的多順反子mRNA，繼而在翻手水平上合成三種不同的蛋白質：-半乳糖苷酶、透性酶以及乙酰基轉移酶。（2）負控阻遏系統：大腸桿菌色氨酸操縱子（tryptophan operon）含有5個結構基因，編碼色氨酸生物合成途徑中的 5種酶。這些基因從一個啟動子起始轉錄出一條多順反子的mRNA，與lac操縱子一樣，這個啟動子受毗鄰的操縱區(qū)順序控制。轉錄是通過操縱區(qū)和阻遏蛋白控制的，它的效應物分子是色氨酸，也就是由tr操縱子的基因所編碼的生物合成途徑中的末端產物。當色氨酸很豐富時，它結合到游離的阻遏物上誘發(fā)變構

13、轉換，從而使阻遏物緊緊結合在操縱區(qū)。另一方面，當色氨酸供應不足時，阻遏物失去了所結合的色氨酸，從操縱區(qū)上解離下來，tr操縱子的轉錄就此開始。色氨酸起著tr操縱子的輔阻遏物功能。（3）染色質丟失：在發(fā)育過程中一些體細胞失去了某些基因，這些基因便永不表達，這是一種極端形式的不可逆的基因調控。在某些線蟲、原生動物、甲殼動物發(fā)育過程中的體細胞有遺傳物質丟失現象。在這些生物中，只有生殖細胞才保留著該種生物基因組的全套基因。例如在馬副蛔蟲(Ascaris megacephala)卵裂的早期就發(fā)現有染色體的丟失現象。蜜蜂的工蜂和蜂后是二倍體，而單倍體則發(fā)育成為雄蜂。這也可以認為是一種通過染色體丟失的基因調控

14、。7. 如何采用代謝工程進行纈氨酸育種？答案一纈氨酸生物合成過程分別由四個酶催化，分別為乙酰羥酸合酶(AHAS，ilvBN基因產物)、 乙酰羥酸同分異構酶(AHAIR，ilvC基因產物)、二羥酸脫水酶(DHAD，ilvD 基因產物)和支鏈氨基酸轉氨酶(TA，ilvE基因產物)。1)纈氨酸生物合成的調節(jié)，通常采取的方法是用多拷貝質粒表達ilvBNC、ilvD和ilvE基因。2)運用啟動子的強弱來控制基因的表達。這個策略避免了兩個極端，避免了太強的基因過表達會對給菌體本身帶來壓力，也避免了通過基因敲除會徹底切斷支路或者相互競爭的路徑帶來的麻煩。運用不同強度的啟動子，能夠保證涉及生物合成的所有基因都

15、會表達在最適宜的代謝流量。3)切斷或改變平行代謝途徑：纈氨酸和異亮氨酸的生物合成途徑是平行進行的，纈氨酸、亮氨酸與異亮氨酸的生物合成 途徑中公用了三種酶：即乙酰乳酸合成酶、乙酰乳酸異構還原酶和二羥基脫水酶。選育亮氨酸、異亮氨酸營養(yǎng)缺陷型突變株可以使用于合成三種氨基酸的公用酶系完全用于纈氨酸的生物合成，進而提高纈氨酸的產量。4)解除菌體自身的反饋抑制：纈氨酸合成中的第一個限速酶乙酰乳酸合成酶受纈氨酸的反饋抑制，同時纈氨酸和異亮氨酸的合成酶系受三個末端：即纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸的多價阻遏。因此，如果解除乙酰乳酸合成酶的反饋抑制和纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸生物酶系的阻遏，必將大大提高纈氨酸的積累。為

16、此可選育纈氨酸結構類似物抗性突變株來解除纈氨酸的反饋調節(jié)。5)增加前體物質的合成：生物合成的前體物質是丙酮酸，為了積累更多的纈氨酸，必須提高丙酮酸的產量。通過篩選丙酮酸脫氫酶（PDHC）缺陷菌株或者抑制醌氧化還原酶（PQO）和丙酮酸羧化酶（PCx）的活性都可以來增加丙酮酸的積累。答案二目前，世界利用發(fā)酵生產纈氨酸的出發(fā)菌株有北京棒桿菌（Corynebacterium pekineise）,谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutacium）,乳糖發(fā)酵短桿 (Brevibacterium lactofermentum),大腸桿菌屬（Escherichia coli）, 黃色短桿菌（

17、Brevibacterium flavum）, 粘質賽氏桿菌（Serratia marcescens）等，這些菌株均可以作為出發(fā)菌株選育出L-纈氨酸生產菌。工業(yè)發(fā)酵若想獲得較高產量的目的產物，必須突破（或解除）微生物細胞自我調節(jié)控制機制，最常用且最有效的方法就是從遺傳的角度選育解除微生物正常代謝調節(jié)機制的突變株。L-纈氨酸發(fā)酵生產的代謝調控育種的基本途徑有：切斷或改變平行代謝途徑（選育營養(yǎng)缺陷型突變株），解除菌體自身的反饋抑制（選育抗反饋調節(jié)突變株），選育營養(yǎng)缺陷型恢復突變株，增加前體物質的合成，切斷進一步代謝途徑和利用基因工程技術構建纈氨酸工程菌。 (1)切斷或改變平行代謝途徑由圖，纈氨酸和

18、異亮氨酸的生物合成途徑是平行進行的，纈氨酸、亮氨酸與異亮氨酸的生物合成途徑中公用了三種酶：即乙酰乳酸合成酶、乙酰乳酸異構還原酶和二羥基脫水酶。選育亮氨酸、異亮氨酸營養(yǎng)缺陷型突變株可以使用于合成三種氨基酸的公用酶系完全用于纈氨酸的生物合成，進而提高纈氨酸的產量。同時-乙酰異戊酸是合成纈氨酸和亮氨酸的共同前體物。切斷亮氨酸的合成途徑不僅可以節(jié)省碳源而且解除了菌體生成纈氨酸酶系的反饋抑制和多價阻遏，使-異丙基蘋果酸合成酶脫敏顯著提高纈氨酸的產量。通過抑制醌氧化還原酶（PQO）和丙酮酸羧化酶（PCx）的活性來切斷與纈氨酸合成無關的代謝流分支對碳源的消耗。使碳架物質相對集中地流向纈氨酸。2)解除菌體自身

19、的反饋抑制纈氨酸合成中的第一個限速酶乙酰乳酸合成酶受纈氨酸的反饋抑制，同時纈氨酸和異亮氨酸的合成酶系受三個末端：即纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸的多價阻遏。因此，如果解除乙酰乳酸合成酶的反饋抑制和纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸生物酶系的阻遏，必將大大提高纈氨酸的積累。為此可選育纈氨酸結構類似物抗性突變株來解除纈氨酸的反饋調節(jié)。常用的纈氨酸結構類似物有2-噻唑丙氨酸（2-TA）、-氨基丁酸（-AB）、氟亮氨酸、纈氨酸等。(3)增加前體物質的合成 由圖可以看出生物合成的前體物質是丙酮酸，為了積累更多的纈氨酸，必須提高丙酮酸的產量。通過篩選丙酮酸脫氫酶（PDHC）缺陷菌株或者抑制醌氧化還原酶（PQO）和丙酮酸羧

20、化酶（PCx）的活性都可以來增加丙酮酸的積累。 根據上述選育突變株的幾條途徑可選育組合型突變株，如營養(yǎng)缺陷型突變株和抗性結構類似物雙重突變株，以提高目的產物的產量。8. 簡述工業(yè)發(fā)酵的五字策略。（結合研究實例說明） 工業(yè)發(fā)酵的五字策略為“進、通、節(jié)、堵、出”，含義分別為：進，促進細胞對碳源等營養(yǎng)物質的吸收；通，使來自代謝流上游和各個“注入分支”的碳架物質能暢通地流向目的產物；節(jié)，阻塞與目的產物的形成無關或關系不大的代謝支流，使碳架物質相對集中地流向目的產物；堵，消除或削弱目的產物進一步代謝的途徑；出，促進目的產物向胞外空間分泌。 通：纈氨酸、亮氨酸與異亮氨酸的生物合成途徑中公用了三種酶，即乙酰

21、乳酸合成酶、乙酰乳酸異構還原酶和二羥基脫水酶。選育亮氨酸、異亮氨酸營養(yǎng)缺陷型突變株可以使用于合成三種氨基酸的公用酶系完全用于纈氨酸的生物合成，進而提高纈氨酸的產量。 節(jié)：通過篩選丙酮酸脫氫酶（PDHC）缺陷菌株來增加纈氨酸前提物質丙酮酸的積累。通過敲出編碼蘇氨酸脫氫酶的ilvA基因，可以阻斷亮氨酸和泛酸的合成，他們與纈氨酸競爭前體物質酮異戊酸。通過抑制醌氧化還原酶（PQO）和丙酮酸羧化酶（PCx）的活性來阻斷與纈氨酸合成無關的碳硫分支對碳源的消耗。阻塞與纈氨酸形成無關或關系不大的代謝支流，使碳架物質相對集中地流向纈氨酸堵：纈氨酸生產菌谷氨酸棒桿菌的育種過程中，篩選終產物分解抑制菌株，達到提高產

22、物的目的。出：通過抑制相應運輸載體蛋白基因的表達，從而抑制纈氨酸向胞內運輸載體蛋白的表達，促進目的產物向胞外空間分泌。9 簡述微生物基因克隆的方法與流程答案一：1. 鳥槍法：將某種微生物的全部基因組切成大小適宜的DNA片段，分別連接到載體DNA上，轉化受體細胞，形成一套重組克隆，從而篩選出含有目的基因的期望重組子。基本程序1）目的基因DNA片段的制備，有機械法和限制性內切酶切割法2）外源DNA片段全克隆3）期望重組子的篩選4）目的基因的定位2. cDNA法：將供體生物細胞的mRNA分離出來，利用逆轉錄酶在體外合成cDNA，并將之克隆在受體細胞內，通過篩選獲得含有目的基因編碼序列的重組克隆?；?/p>

23、程序：1）mRNA的分離純化雙鏈cDNA的克隆3）cDNA重組克隆的篩選3. PCR擴增法：在DNA單鏈模板、引物、DNA聚合酶以及緩沖體系中，根據生物DNA復制原理在體外合成DNA。操作步驟：1）將待擴增雙鏈DNA加熱變性，形成單鏈模板2）加入兩種不同的單鏈DNA引物，并分別與兩條單鏈DNA模板退火3）DNA聚合酶從兩個引物的3羥基端按照模板要求合成新生DNA鏈，構成一輪復制反應重復上述操作n次，即可從1分子的雙鏈DNA擴增到2n個分子。4. 化學合成法：對于幾十個堿基的小片段目的基因序列，可以分別直接合成氣兩條互補鏈，然后退火即可。而大片段雙鏈DNA或目的基因合成通常采用單鏈小片段DNA模

24、塊拼接的方法，有三種基本形式，小片段粘接法、補丁延長法和大片段酶促法。5. 基因文庫法：將微生物的全部基因分成若干DNA片段，分別與載體DNA在體外拼接成重組分子，然后導入受體細胞中，形成一套含有微生物全基因組的DNA片段克隆，即基因文庫。這樣就可以從基因文庫中點出其中任何的DNA片段或目的基因。答案二 方法：基因克隆是指應用酶學的方法，在體外將目的基因與載體DNA結合成一具有自我復制能力的DNA分子（重組體），繼而通過轉化或轉染宿主細胞、篩選出含有目的基因的轉化子細胞，再進行擴增、提取獲得大量相同的DNA分子拷貝。流程：1) 目的基因的制備：1 基因文庫 ；2 cDNA文庫。2) 載體的選擇

25、和制備 ：基本要求：.復制單位;. 克隆位點(多個單克隆位點);. 篩選標記;. 分子量盡可能小; . 分子量盡可能小;. 外源DNA插入后不影響載體本身的復制能力.3) 載體與目的基因的連接-構建重組體 ：粘性末端連接法（連接效率高）、去5磷酸連接法、人工接頭法、同聚物接尾法4) 將重組DNA導入宿主細胞 ：1 轉化 ：通過自動獲取或人為地供給外源DNA，使細胞或培養(yǎng)的受體細胞獲得新的遺傳表型的過程。2 感染(infaction)：由噬菌體和細胞病毒介導的遺傳信息轉移過程3 轉染(transfection)：真核細胞主動攝取或被動導入外源DNA片段而獲得新的表型的過程。5) 目的基因的篩選和

26、鑒定 ：免疫學方法；分子雜交 （探針）；原位雜交； PCR；限制性酶切圖譜；遺傳學方法插入滅活法(insertion inactivation):抗藥性標志選擇（藍白斑篩選）。10.工業(yè)生物技術中亟待解決的技術問題有哪些，請舉例說明答案一工業(yè)生物技術是指在工業(yè)規(guī)模生產過程中以微生物或酶為催化劑進行物質轉化，大規(guī)模地生產人類所需的化學品、醫(yī)藥、能源、材料等產品的生物技術，它是人類由化石經濟向生物經濟過渡的必要工具，是解決人類目前面臨的資源、能源及環(huán)境危機的有效手段。工業(yè)生物技術存在著一些關鍵技術問題亟待解決，目標是大大提高工業(yè)生物技術的效能。1.微生物資源庫和微生物功能基因組學技術：微生物菌種或

27、酶是工業(yè)生物技術的基礎。從自然界中篩選所需要的菌種是目前工業(yè)生物技術的主要特點，大部分成功的高產工業(yè)化菌株是從自然界篩選得到的野生型菌株。但是目前人類篩選的范圍十分有限，僅占微生物總數的0.1%1%，需要拓展篩選的范圍。新型生物催化劑的來源是工業(yè)生物技術發(fā)展的基礎。正如耐高溫的DNA聚合酶的發(fā)現，才導致了PCR技術的誕生，從而才會有今天分子生物學的巨大成就，并且改變了人類的生活面貌。2.生物催化劑快速定向改造新技術：定向進化目前主要研究方向是：提高熱穩(wěn)定性、提高有機溶劑中酶的活性和穩(wěn)定性，擴大底物的選擇性，改變光學異構體的選擇性等。定向進化的核心技術為易錯PCR技術、DNA shuffling技術及高通量篩選技術。各類工業(yè)微生物的基因組學和蛋白質組學研究的飛速發(fā)展，產生了海量信息，隨著高性能計算機和數據管理分析方法的進步，大大促進了工業(yè)微生物的生物信息學的發(fā)展，從而使得人們對酶的認識加深，使得應用傳統的理性分子設計方法制造新的酶更加容易。這些技術在增加酶的反應多樣性、改變酶的各種性能等方面已有應用。3. 重要工業(yè)微生物的代謝工程：隨著對微生物代謝網