生物技術(shù)制藥：硫酸軟骨素裂解酶的研究進(jìn)展

1、硫酸軟骨素裂解酶的研究進(jìn)展,Chondroitin sulfate,圖1 硫酸軟骨素基本單元,糖胺多糖作為蛋白聚糖的組成成分，主要分布在細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞表面，用來指導(dǎo)很多生物過程，如細(xì)胞增殖、信號(hào)傳輸和炎癥介導(dǎo)等。,硫酸軟骨素 (Chondroitin sulfate，CS) 是糖胺多糖的一種，是以D-葡萄糖醛酸和2-乙酰氨基-2-脫氧硫酸-D-半乳糖通過-1,3 糖苷鍵相結(jié)合的雙糖為基本單位，聚合而成的一類大分子多糖，雙糖單位數(shù)目一般在5070 個(gè)，分子量約在550 kDa 之間 (圖1)。,CS是一種酸性黏多糖類生物大分子，具有較強(qiáng)的降血脂作用和緩沖抗凝血作用， 臨床上主要用于防治冠心病和

2、動(dòng)脈粥樣硬化。最新的研究發(fā)現(xiàn)， 當(dāng)將硫酸軟骨素的分子量降低至2 10 kDa時(shí)， 其藥效更為明顯，對(duì)防治動(dòng)脈粥樣硬化、風(fēng)濕性炎癥和傷口愈合有更好的療效。另外，低分子量CS也可作為載體與某些藥物結(jié)合以增強(qiáng)這些藥物的藥效。,Chondroitin sulfate,硫酸軟骨素裂解酶 (Chondroitinase，ChSase) 是一類能將CS、軟骨素、透明質(zhì)酸等糖胺聚糖降解為不飽和二糖及寡糖的裂解 酶。最早在細(xì)菌的抽提物中發(fā)現(xiàn)其對(duì)CS的降解作用，迄今為止已發(fā)現(xiàn)微生物可產(chǎn)生4種具有不同降解功能的ChSase。,ChSase 根據(jù)其作用底物的不同分為ChSase ABC、ChSase AC、ChSas

3、e B 及ChSase C 等類型,Chondroitin sulfate,溶解椎間盤內(nèi)髓核或破裂的纖維環(huán) 降解囊性纖維變性部位的黏液物 阻止玻璃體與視網(wǎng)膜的粘連 促進(jìn)神經(jīng)軸的再生 抗腫瘤作用 增強(qiáng)軟骨細(xì)胞與軟骨的黏附力,Chondroitin sulfate,1.發(fā)酵生產(chǎn),2.ChSase的重組表達(dá),第一步：硫酸軟骨素酶粗酶粉的制備,第二步：硫酸軟骨素酶的純化,A.菌株的發(fā)酵培養(yǎng),B.硫酸軟骨素酶粗品的制備,A. DEAE-Sepharose 陰離子交換層析,B. Sephadex G-100 凝膠過濾層析,Chondroitin sulfate,ChSase的重組表達(dá),ChSase AC

4、和ChSase B,對(duì)肝素黃桿菌中的ChSase AC 基因進(jìn)行克隆，得到ChSase AC 的基因cslA，通過與麥芽糖結(jié)合蛋白 (Maltose-binding protein，MBP) 構(gòu)建融合表達(dá)載體，在大腸桿菌中表達(dá)。,通過PCR技術(shù)由普通變形桿菌全基因組DNA中擴(kuò)增硫酸軟骨素酶ABC I的全長(zhǎng)cDNA,在PGEM-Teasy載體中對(duì)其進(jìn)行測(cè)序和擴(kuò)增,后將其插入真核表達(dá)載體PcDNA3.1/V5/His,構(gòu)建成真核分泌型蛋白表達(dá)載體pcDNA3.1/CABCI/V5/His。用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系TJ905,并利用SDS一PAGE考馬斯亮藍(lán)染色和免疫印漬檢測(cè)培養(yǎng)物上清中的分泌型融

5、合蛋白硫酸軟骨素酶ABC I的表達(dá)情況,ChSase ABC,Chondroitin sulfate,（1）明膠海藻酸鈉協(xié)同包埋法,（2）樹脂吸附法,（3）磁性高分子微球法,（4）纖維素共價(jià)結(jié)合法,方法：采用明膠與海藻酸鈉為載體,通過CaCI:硬化、戊二醛交聯(lián),對(duì)Chsase進(jìn)行協(xié)同包埋固定化,方法：利用大孔弱堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂D380為載體,戊二醛為交聯(lián)劑,進(jìn)行固定化Chsase,方法：將PF凝膠（主要特點(diǎn)是它對(duì)底物(如多糖)有很好的吸附作用,而對(duì)產(chǎn)物(如低分子糖)沒有親和性,本身就可以用于多糖與低聚糖、單糖的分離）與磁性粒子結(jié)合,制備出磁性PF微球,再利用磁性PF微球固定化Chsa

6、se,方法：將一定量Chsase酶液在pH為磷酸緩沖液中與胺化纖維素載體共價(jià)結(jié)合。,Chondroitin sulfate,問題： 重組酶表達(dá)量不高，活性較低 分離純化成本高,改進(jìn)： 尋找新型菌株、表達(dá)策略及代謝途徑實(shí)現(xiàn)酶的高效表達(dá)； 構(gòu)建含有不同標(biāo)簽的融合表達(dá)載體實(shí)現(xiàn)酶快速和高效分離純化； 研究新方法增強(qiáng)酶的熱穩(wěn)定性。,作為工具酶和藥用酶, Chsase在科研及醫(yī)藥領(lǐng)域擁有廣闊的發(fā)展前景。 制備低分子量的CS，糖胺聚糖的核心蛋白，抗蛋白聚糖的單克隆抗體 用于皮革制造業(yè)，提高皮制品的質(zhì)量 鑒定魚翅制品真假的輔助手段 利用Chsase制備低分子量的CS，不僅具有科研意義，更有其實(shí)用意義。世界上一

7、些發(fā)達(dá)國(guó)家正積極致力于利用酶解法開發(fā)LMCS的研究而國(guó)內(nèi)卻鮮有研究,1 蔡蘇蘭，閻浩林，何漢洲. 微生物硫酸軟骨素裂解酶的研究進(jìn)展J. 沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào). 2004(01): 76-80. 2 蘇昕，周麗娜，梁麗莉. 發(fā)酵法制備硫酸軟骨素裂解酶及其酶分離純化的研究J. 微生物學(xué)雜志. 2005(04): 64-67. 3 蔡蘇蘭. 硫酸軟骨素裂解酶的研究D. 沈陽藥科大學(xué), 2004. 4 李曄，陳振婭，袁其朋. 硫酸軟骨素裂解酶 ABC 的研究進(jìn)展 J. 生物工程學(xué)報(bào).2015. 5于淼, 硫酸軟骨素酶的發(fā)酵制備與分離純化. 2013, 中國(guó)海洋大學(xué). p. 60. 6牛海濱, 硫酸軟骨素裂解酶產(chǎn)生菌的篩選、鑒定及其酶固定化方法的研究. 2009, 沈陽藥科大學(xué). p. 76. 7蔡蘇蘭, 硫酸軟骨素裂解酶的研究. 2004, 沈陽藥科大學(xué). p. 84. 8陳秀菊, 硫酸軟骨素酶ABC型分泌型真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建. 2007, 天津醫(yī)科大學(xué). p. 45. 9付靜蕓, 產(chǎn)硫酸軟骨素酶菌株的篩