微生物實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書

1、 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)一 顯微鏡的使用、細(xì)菌革蘭氏染色法及細(xì)菌特殊結(jié)構(gòu)的觀察（一） 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 了解普通光學(xué)顯微鏡的基本構(gòu)造和工作原理2. 學(xué)習(xí)并掌握油鏡的原理和使用方法。 3. 在油鏡下觀察細(xì)菌幾種基本形態(tài)4掌握細(xì)菌革蘭氏染色法（二） 實(shí)驗(yàn)原理1顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)及油鏡的工作原理 現(xiàn)代普通光學(xué)顯微鏡利用目鏡和物鏡兩組透鏡系統(tǒng)來放大成像，故又常被稱為復(fù)式顯微鏡。它們由機(jī)械裝置和光學(xué)系統(tǒng)兩大部分組成。在顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)中，物鏡的性能最為關(guān)鍵，它直接影響著顯微鏡的分辨率。而在普通光學(xué)顯微鏡通常配置的幾種物鏡中，油鏡的放大倍數(shù)最大，對(duì)微生物學(xué)研究最為重要。與其他物鏡相比，油鏡的使用比較特殊，需在載玻片

2、與鏡頭之間加滴鏡油，這主要有如下二方面的原因： 1. 增加照明亮度 油鏡的放大倍數(shù)可達(dá) 100 ，放大倍數(shù)這樣大的鏡頭，焦距很短，直徑很小，但所需要的光照強(qiáng)度卻最大。從承載標(biāo)本的玻片透過來的光線，因介質(zhì)密度不同（從玻片進(jìn)入空氣，再進(jìn)入鏡頭），有些光線會(huì)因折射或全反射，不能進(jìn)入鏡頭，致使在使用油鏡時(shí)會(huì)因射入的光線較少，物像顯現(xiàn)不清。所以為了不使通過的光線有所損失，在使用油鏡時(shí)須在油鏡與玻片之間加入與玻璃的折射率（ n=1.55 ）相仿的油鏡（通常用香柏油，其折射率 n=1.52）。 2. 增加顯微鏡的分辨率 顯微鏡的分辨率或分辨力 (resolution or resolving power)

3、是指顯微鏡能辨別兩點(diǎn)之間的最小距離的能力。從物理學(xué)角度看，光學(xué)顯微鏡的分辨率受光的干涉現(xiàn)象及所用物鏡性能的限制，分辨力D可表示為：D=/2N.A，式中= 光波波長(zhǎng)； NA= 物鏡的數(shù)值孔徑值。 光學(xué)顯微鏡的光源不可能超出可見光的波長(zhǎng)范圍（ 0.4-0.7 m ），而數(shù)值孔徑值則取決于物鏡的鏡口角和玻片與鏡頭間介質(zhì)的折射率，可表示為：NA=n sin 式中為光線最大入射角的半數(shù)。它取決于物鏡的直徑和焦距，一般來說在實(shí)際應(yīng)用中最大只能達(dá)到 120 O ，而 n 為介質(zhì)折射率。由于香柏油的折射率（ 1.52 ）比空氣及水的折射率（分別為 1.0 和 1.33 ）要高，因此以香柏油作為鏡頭于玻片之間介

4、質(zhì)的油鏡所能達(dá)到的數(shù)值孔徑值（NA 一般在1.2-1.4）要高于低倍鏡、高倍鏡等干鏡（ NA 都低于 1.0）。若以可見光的平均波長(zhǎng) 0.55 m來計(jì)算，數(shù)值孔徑通常在0.65左右的高倍鏡只能分辨出距離不小于0.4m的物體，而油鏡的分辨率卻可達(dá)到 0.2 m 左右。2革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學(xué)家ChristainGram氏創(chuàng)立的，革蘭氏染色法可將所有的細(xì)菌區(qū)分為革蘭氏陽性菌（G+）和革蘭氏陰性菌（G-）兩大類。革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中最重要的鑒別染色法。革蘭氏染色法所以能將細(xì)菌分為革蘭氏陽性和革蘭氏陰性，是由這兩類細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成不同決定的。實(shí)際上，當(dāng)用結(jié)晶紫初染后，像簡(jiǎn)單染色法

5、一樣，所有細(xì)菌都被染成初染劑的藍(lán)紫色。碘作為媒染劑，它能與結(jié)晶紫結(jié)合成結(jié)晶紫一碘的復(fù)合物，從而增強(qiáng)了染料與細(xì)菌的結(jié)合力。當(dāng)用脫色劑處理時(shí)，兩類細(xì)菌的脫色效果是不同的。革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁主要由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成，壁厚、類脂質(zhì)含量低，用乙醇(或丙酮)脫色時(shí)細(xì)胞壁脫水、使肽聚糖層的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔徑縮小，透性降低，從而使結(jié)晶紫-碘的復(fù)合物不易被洗脫而保留在細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)脫色和復(fù)染后仍保留初染劑的藍(lán)紫色。革蘭氏陰性菌則不同，由于其細(xì)胞壁肽聚糖層較薄、類脂含量高，所以當(dāng)脫色處理時(shí)，類脂質(zhì)被乙醇(或丙酮)溶解，細(xì)胞壁透性增大，使結(jié)晶紫-碘的復(fù)合物比較容易被洗脫出來，用復(fù)染劑復(fù)染后，細(xì)胞被染上復(fù)染劑的紅色。

6、 （二） 實(shí)驗(yàn)器材1 菌種枯草芽孢桿菌1218h營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物、金黃色葡萄球菌約24h營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物、大腸桿菌24h營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物2 溶液或試劑香柏油，二甲苯，結(jié)晶紫染色液、盧哥氏碘液、95%乙醇、番紅染色液，蒸餾水3 儀器及相關(guān)用品 顯微鏡、擦鏡紙、接種環(huán)、載玻片、酒精燈、鑷子（三） 實(shí)驗(yàn)方法1 顯微觀察 顯微觀察時(shí)應(yīng)遵守從低倍鏡到高倍鏡再到油鏡的觀察程序。 油鏡觀察 高倍鏡或低倍鏡下找到要觀察的樣品區(qū)域后，用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒升高，然后將油鏡轉(zhuǎn)到工作位置。在待觀察的樣品區(qū)域加滴香柏油，從側(cè)面注視，用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒小心地降下，使油鏡浸在鏡油中并幾乎與標(biāo)本相接。將聚光器升至最高位置并開

7、足光圈，若所用聚光器的數(shù)值孔徑值超過 1.0 ，還應(yīng)在聚光鏡與載玻片之間也加滴香柏油，保證其達(dá)到最大的效能。調(diào)節(jié)照明使視野亮度合適，用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒徐徐上升，直至視野中出現(xiàn)物像并用細(xì)調(diào)節(jié)器使其清晰準(zhǔn)焦為止。 2革蘭氏染色（1）涂片 常規(guī)涂片法 取一潔凈的載玻片，用特種筆在載玻片的左右兩側(cè)標(biāo)上菌號(hào)，并在兩端各滴一小滴蒸餾水，以無菌接種環(huán)分別挑取少量菌體涂片，干燥、固定。玻片要潔凈無油，否則菌液涂不開。 （2）初染 滴加結(jié)晶紫(以剛好將菌膜覆蓋為宜)于兩個(gè)玻片的涂面上，染色12min，傾去染色液，細(xì)水沖洗至洗出液為無色，將載玻片上水甩凈。 （3）媒染用盧戈氏碘液媒染約1min，水洗。 （4）脫色

8、用濾紙吸去玻片上的殘水，將玻片傾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脫色，直至流出的乙醇無紫色時(shí)，立即水洗，終止脫色，將載玻片上水甩凈。 革蘭氏染色結(jié)果是否正確，乙醇脫色是革蘭氏染色操作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。脫色不足，陰性菌被誤染成陽性菌，脫色過度，陽性菌被誤染成陰性菌。脫色時(shí)間一般約2030s。 （5）復(fù)染 在涂片上滴加番紅液復(fù)染約23min，水洗，然后用吸水紙吸干。在染色的過程中，不可使染液干涸。 （6）鏡檢 干燥后，用油鏡觀察。判斷兩種菌體染色反應(yīng)性。菌體被染成藍(lán)紫色的是革蘭氏陽性菌（G+），被染成紅色的為革蘭氏陰性菌（G-）。4用畢后的處理 （1）上升鏡筒，取下載玻片。 （2） 用擦鏡紙拭去

9、鏡頭上的鏡油，然后用擦鏡紙蘸少許二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去鏡頭上殘留的油跡，最后再用干凈的擦鏡紙擦去殘留的二甲苯。 （3）用擦鏡紙清潔其他物鏡及目鏡；用綢布清潔顯微鏡的金屬部件。 （4）分還原，反光鏡垂直于鏡座，將物鏡轉(zhuǎn)成“八”字形，再向下旋。同時(shí)把聚光鏡降下，以免接物鏡與聚光鏡發(fā)生碰撞危險(xiǎn)。染色玻片用洗衣粉水煮沸、清洗，涼干后備用。（四） 實(shí)驗(yàn)結(jié)果1 繪出你在油鏡下觀察到的三種菌的形態(tài)2 列表簡(jiǎn)述兩株細(xì)菌的染色結(jié)果(菌的形狀、顏色和革蘭氏染色反應(yīng))。（五） 思考題1、用油鏡觀察時(shí)應(yīng)注意哪些問題？在載玻片和鏡頭之間加滴什么油？起什么作用？ 2、影響顯微鏡分辨率的因素有哪些？ 3、進(jìn)行革蘭氏

10、染色時(shí)，為什么特別強(qiáng)調(diào)菌齡不能太老，用老齡細(xì)菌染色會(huì)出現(xiàn)什么問題? 4、你認(rèn)為制備細(xì)菌染色標(biāo)本時(shí)，應(yīng)該注意哪些環(huán)節(jié)? 實(shí)驗(yàn)二 沉降法檢測(cè)空氣中微生物數(shù)量（一） 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)并掌握用沉降法檢測(cè)空氣中的微生物2了解空氣中微生物的分布狀況（二）實(shí)驗(yàn)原理在我們周圍的環(huán)境中存在著種類繁多、數(shù)量龐大的微生物?？諝庵幸膊焕狻ｋm然空氣不是微生物棲息的良好環(huán)境。但由于氣流、灰塵和水沫的流動(dòng)，人和動(dòng)物的活動(dòng)等原因，仍有相當(dāng)數(shù)量的微生物存在。當(dāng)空氣中個(gè)體微小的微生物落到適合于它們生長(zhǎng)繁殖的固體培養(yǎng)基的表面時(shí)，在適溫下培養(yǎng)一段時(shí)間后，每一個(gè)分散的菌體或孢子就會(huì)形成一個(gè)個(gè)肉眼可見的細(xì)胞群體即菌落。觀察大小、形態(tài)各異

11、的菌落，就可大致鑒別空氣個(gè)存在的微生物的種類。（三)實(shí)驗(yàn)器材1 試劑牛肉蛋白胨培養(yǎng)基配方：牛肉膏 5.0g, 蛋白胨 10.0g，NaCl 5g, 水1000ml，pH 7.27.4馬鈴薯培養(yǎng)基配方：馬鈴薯 200g, 蔗糖 20g, 水1000ml， pH 7.2高氏一號(hào)培養(yǎng)基配方：淀粉 20g, 硝酸鉀 1.0g, 磷酸氫二鉀 0.5g, 硫酸鎂0.5g, 氯化鈉0.5g, 硫酸亞鐵0.01g, 水1000ml, pH 7.27.42. 儀器及其他用品高壓滅菌鍋，操作工作臺(tái)，三角瓶，培養(yǎng)皿，酒精燈，培養(yǎng)箱等（四）實(shí)驗(yàn)方法1倒平板：按常法配置上述培養(yǎng)基，分裝于三角瓶中，高壓滅菌備用。臨用前將

12、培養(yǎng)基熔化，冷卻至50左右，各倒16個(gè)平板備用。2暴露取樣在指定的地點(diǎn)草地，一層樓，三層樓，七層樓各放4皿，將平板皿蓋打開，在空氣中暴露5min和10min,時(shí)間一到，立即合上皿蓋。3 培養(yǎng)觀察： 細(xì)菌置于37培養(yǎng)，放線菌培養(yǎng)基平板和真菌培養(yǎng)基平板置于28培養(yǎng)。細(xì)菌培養(yǎng)48h，真菌和放線菌培養(yǎng)4-6天。計(jì)數(shù)平板上的菌落，觀察各種菌落的形態(tài)、大小、顏色等特征。4.計(jì)算1m3空氣中微生物的數(shù)目奧梅染斯基（）曾建議：如面積為1002的平板培養(yǎng)基，暴露在空氣中5分鐘，置于37培養(yǎng)24小時(shí)后所生長(zhǎng)的菌落數(shù)，相當(dāng)于10L空氣中的細(xì)菌數(shù)。N1001002X=X：每m3空氣中的細(xì)菌數(shù)N：平板暴露5分鐘，置37

13、培養(yǎng)24小時(shí)后生長(zhǎng)的菌落數(shù)r：平皿底半徑（）（五）實(shí)驗(yàn)結(jié)果1列表比較不同放置地點(diǎn)空氣菌落種類以及數(shù)量的差異？ 菌落平均數(shù)環(huán)境細(xì)菌霉菌放線菌室外5min10min室內(nèi)5min10min2用沉降法計(jì)算1m3空氣環(huán)境中所含菌數(shù)。（六）思考題1對(duì)沉降測(cè)定法的結(jié)果，進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)三 多管發(fā)酵法檢測(cè)水中的大腸菌群（一） 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 了解飲用水和水源水大腸菌群的原理和意義2學(xué)習(xí)檢測(cè)水中大腸菌群的方法 （二）實(shí)驗(yàn)原理 大腸菌群是評(píng)價(jià)水質(zhì)好壞的一個(gè)重要的衛(wèi)生指標(biāo)，也是反映水體被生活污水污染的一項(xiàng)重要監(jiān)測(cè)項(xiàng)目。大腸菌群是一群以大腸埃希氏菌（Escherichiacoli）為主的需氧及兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿

14、菌，在37生長(zhǎng)時(shí)，能在48小時(shí)內(nèi)發(fā)酵乳糖并產(chǎn)酸產(chǎn)氣。我國(guó)生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定一升水樣中總大腸菌群數(shù)不超過三個(gè)。多管發(fā)酵法包括初發(fā)酵試驗(yàn)、平板分離和復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)三個(gè)部分。發(fā)酵管內(nèi)裝有乳糖蛋白胨液體培養(yǎng)基，并倒置一德漢氏小套管。乳糖能起選擇作用，因?yàn)楹芏嗉?xì)菌不能發(fā)酵乳糖，而大腸菌群能發(fā)酵乳糖而產(chǎn)酸產(chǎn)氣。1初發(fā)酵試驗(yàn)水樣接種于發(fā)酵管內(nèi)，37下培養(yǎng)，24小時(shí)內(nèi)小套管中有氣體形成，并且培養(yǎng)基混濁，顏色改變，說明水中存在大腸菌群，為陽性結(jié)果。48小時(shí)后仍不產(chǎn)氣的為陰性結(jié)果。2平板分離初發(fā)酵管24至48小時(shí)內(nèi)產(chǎn)酸產(chǎn)氣的均需在復(fù)紅亞硫酸鈉瓊脂（遠(yuǎn)藤氏培養(yǎng)基，Endos medium）或伊紅美藍(lán)瓊脂（eosi

15、n methylene blue agar,EMB agar）平板上劃線分離菌落。3復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)以上大腸菌群陽性菌落，經(jīng)涂片染色為革蘭氏陰性無芽孢桿菌者，通過此試驗(yàn)再進(jìn)一步證實(shí)。原理與初發(fā)酵試驗(yàn)相同，經(jīng)24小時(shí)培養(yǎng)產(chǎn)酸產(chǎn)氣的，最后確定為大腸菌群陽性結(jié)果。（二） 實(shí)驗(yàn)器材1. 水樣自來水2試劑乳糖蛋白胨發(fā)酵管（內(nèi)有倒置小套管），三倍濃縮乳糖蛋白胨發(fā)酵管（瓶）（內(nèi)有倒置小套管），伊紅美藍(lán)或復(fù)紅亞硫酸鈉瓊脂平板，革蘭氏染液。3 儀器及其它用品 載玻片，滅菌帶玻璃塞空瓶，滅菌吸管，滅菌試管，革蘭氏染液，顯微鏡，香柏油，二甲苯，擦鏡紙，吸水紙，滅菌三角瓶等。（四） 實(shí)驗(yàn)方法1 水樣的采取水源水2初發(fā)酵試驗(yàn)

16、 取16支發(fā)酵管，其中10支用移液管加入10ml一倍的乳酸蛋白胨培養(yǎng)液，5支加入5ml三倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)液，1支加入9ml自然水。完成后包裝好，于121高壓滅菌鍋中滅菌30min左右。冷卻后，在無菌操作條件下，向裝有三倍的乳酸蛋白胨培養(yǎng)液的5支試管加入10ml水樣，向裝有一倍的乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的5支試管中加入1ml水樣，向裝有一倍的乳酸蛋白胨培養(yǎng)液的另5支試管中加入1ml 10-1水樣。 將各試管充分混均，置于37恒溫箱中培養(yǎng)24h。（2）平板分離 經(jīng)24小時(shí)培養(yǎng)后，將產(chǎn)酸產(chǎn)氣及48小時(shí)產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管（瓶）液體，分別劃線接種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，再置于37下培養(yǎng)1824小時(shí)，將符合下列特征的

17、菌落的一小部分，進(jìn)行涂片，革蘭氏染色，鏡檢。（a）深紫黑色、有金屬光澤。（b）紫黑色、不帶或略帶金屬光澤。（c）淡紫紅色、中心顏色較深。（3）復(fù)發(fā)酵試驗(yàn) 經(jīng)涂片、染色、鏡檢，如為革蘭氏陰性無芽孢桿菌，則挑取該菌落的另一部分，重新接種于普通濃度的乳糖蛋白胨發(fā)酵管中，每管可接種來自同一初發(fā)酵管的同類型菌落13個(gè)，37培養(yǎng)24小時(shí)，結(jié)果若產(chǎn)酸又產(chǎn)氣，即證實(shí)有大腸菌群存在。證實(shí)有大腸菌群存在后，再根據(jù)初發(fā)酵試驗(yàn)的陽性管（瓶）數(shù)查表，即得大腸菌群數(shù)。表1 大腸桿菌群的最可能數(shù)（MPN單位：個(gè)（100ml）-1出現(xiàn)陽性份數(shù)每100ml水樣中細(xì)菌的最可能數(shù)95%可信限度值出現(xiàn)陽性份數(shù)每100ml水樣中細(xì)菌的

18、最可能數(shù)95%可信限度值10ml 管1ml管0.1ml管下限上限10ml 管1ml管0.1ml管下限上限00024212697800120.574302798001020.5743133119302040.51144034129310020.575002377010140.51150134118911040.511502431511011160.51551033119312060.515511461612020050.51351263211502017117520491713021071175217023170211922152294282202209221530792519023012328

19、53111031250300811953214037310301112255331804450031011225540130353003111443454117043190320144345422205770032117546543280908503301754654435012010004001333155024068750401175465513501201000410175465525401801400出現(xiàn)陽性份數(shù)每100ml水樣中細(xì)菌的最可能數(shù)95%可信限度值出現(xiàn)陽性份數(shù)每100ml水樣中細(xì)菌的最可能數(shù)95%可信限度值10ml 管1ml管0.1ml管下限上限10ml 管1ml管0.1m

20、l管下限上限4112176355392030032004122697855416006405800420227675552400水樣總量：55.5ml(5管10ml水樣，5管0.1ml水樣，5管0.1 1:10稀釋水樣時(shí)，不同陽性和陰性情況下100ml水樣中細(xì)菌的最可能數(shù)和95%可信限度值)（五）實(shí)驗(yàn)結(jié)果1查表1得每升水源水樣中大腸菌群數(shù)是多少？ 出現(xiàn)陽性份數(shù)10ml 管1ml管0.1ml管（六） 思考題 1為什么要選擇大腸菌群作為水源被腸道病原菌污染的指示菌？實(shí)驗(yàn)四 活性污泥中生物相與放線菌、霉菌、酵母菌的形態(tài)觀察（一） 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)觀察活性污泥中生物相的方法。2初步分析生物處理系統(tǒng)工作狀

21、態(tài)是否正常。3. 學(xué)習(xí)并掌握放線菌、霉菌、酵母菌形態(tài)結(jié)構(gòu)的方法。4加深理解放線菌、霉菌、酵母菌形態(tài)結(jié)構(gòu)特征（二）實(shí)驗(yàn)原理1活性污泥中生物相比較復(fù)雜，以細(xì)菌、原生動(dòng)物為主，還有真菌、后生動(dòng)物等。某些細(xì)菌能分泌膠粘物質(zhì)形成菌膠團(tuán)，進(jìn)而組成污泥絮絨體（絨粒）。在正常的成熟污泥中，細(xì)菌大多集于菌膠團(tuán)絮絨體中，游離細(xì)菌較少，此時(shí)，污泥絮絨體可具有一定形狀、結(jié)構(gòu)稠密、擴(kuò)光率強(qiáng)、沉降性能好。原生動(dòng)物常作為污水凈化指標(biāo)；當(dāng)固著型纖毛蟲優(yōu)勢(shì)時(shí)，一般認(rèn)為污水處理池運(yùn)轉(zhuǎn)失常。當(dāng)后生動(dòng)物輪蟲等大量出現(xiàn)時(shí)，意味著污泥極度衰老。2放線菌在固體培養(yǎng)基上呈輻射狀生長(zhǎng)而得名。放線菌是由不同長(zhǎng)短的纖細(xì)的菌絲所形成的單細(xì)胞菌絲體。

22、菌絲體分為兩部分，即潛入培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)菌絲（或稱基內(nèi)菌絲）和生長(zhǎng)在培養(yǎng)基表面的氣生菌絲。有些氣生菌絲分化成各種孢子絲，呈螺旋形、波浪形或分枝狀等。孢子常呈圓形、橢圓形或桿形。氣生菌絲及孢子的形狀和顏色常作為分類的重要依據(jù)。3. 霉菌菌絲較粗大，細(xì)胞易收縮變形，而且孢子很容易飛散，所以制標(biāo)本時(shí)常用乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液。此染色液制成的霉菌標(biāo)本片其特點(diǎn)是（a）細(xì)胞不變形；(b)具有殺菌防腐作用，且不易干燥，能保持較長(zhǎng)時(shí)間；（c）溶液本身呈藍(lán)色，有一定染色效果。霉菌的菌絲、分生孢子梗和分生孢子的形態(tài)常作為分類的重要依據(jù)。4. 酵母菌是多形的、不運(yùn)動(dòng)的單細(xì)胞微生物，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)已有明顯的分化，菌體比細(xì)

23、菌大。繁殖方式也較復(fù)雜，無性繁殖主要是出芽生殖，僅裂殖酵母屬是以分裂方式繁殖；有性繁殖是通過接合產(chǎn)生子囊孢子。本實(shí)驗(yàn)通過用美藍(lán)染色浸片來觀察生活的酵母形態(tài)和出芽生殖方式。美藍(lán)是一種無毒性染料，它的氧化型是藍(lán)色的，而還原型是無色的，用它來對(duì)酵母的活細(xì)胞進(jìn)行染色，由于細(xì)胞中新陳代謝的作用。使細(xì)胞內(nèi)具有較強(qiáng)的還原能力，能使美藍(lán)從藍(lán)色的氧化型變?yōu)闊o色的還原型，所以酵母的活細(xì)胞無色，而對(duì)于死細(xì)胞或代謝緩慢的老細(xì)胞，則因它們無此還原能力或還原能力極弱，而被美藍(lán)染成藍(lán)色或淡藍(lán)色。因此，用美藍(lán)水浸片不僅可觀察酵母的形態(tài)，還可以區(qū)分死、活細(xì)胞。（三）實(shí)驗(yàn)器材1活性污泥樣品2菌種放線菌、 霉菌、酵母菌3. 試劑0

24、.1%呂氏堿性美藍(lán)染液4儀器以及其它用品顯微鏡，目鏡測(cè)微尺，200ml量筒、載玻片、蓋玻片、玻璃小吸管、橡皮吸頭、鑷子。吸水紙， 香柏油，二甲苯（四）實(shí)驗(yàn)方法1活性污泥生物相的觀察（1）肉眼觀察：取曝氣池的混合液置于100ml量筒內(nèi)，直觀活性污泥在量筒中呈現(xiàn)的絮絨體外觀及沉降性能（30分鐘沉降后的污泥體積）。（2）制片鏡檢：滴混合液12滴于載玻片上，加蓋玻片制成水浸標(biāo)本片，在顯微鏡中倍或高倍鏡下觀察生物相。絲狀微生物：伸出絮絨體外的多寡，以哪一類為優(yōu)勢(shì)？見本實(shí)驗(yàn)附注1。微型動(dòng)物：原生動(dòng)物的識(shí)別。常見后生動(dòng)物特征描述見本實(shí)驗(yàn)附注2。2. 放線菌的觀察直接觀察法用鑷子連同培養(yǎng)基挑取放線菌菌苔置載玻

25、片中央。放在潔凈的載玻片上，選擇菌苔邊緣部位，在顯微鏡下依次用低倍鏡、中倍鏡、高倍鏡直接觀察，觀察時(shí)需不斷調(diào)節(jié)微調(diào)，仔細(xì)觀察氣生菌絲，基內(nèi)菌絲和孢子絲的形狀。 插片觀察法 將高氏1號(hào)培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿，制成4左右的培養(yǎng)基平板，經(jīng)培養(yǎng)檢驗(yàn)后無菌，備用。然后將孢子懸液涂皿（濃度以稀釋10-210-3為好）。用火焰滅菌的鑷子將無菌蓋玻片以45度傾斜角插入平皿培養(yǎng)基瓊脂內(nèi)， 倒置，于28培養(yǎng)45天后，小心地將蓋玻片取出，把有菌的一面朝上，放在載玻片上，置顯微鏡下進(jìn)行觀察。一般情況是氣生菌絲顏色較深，并比營(yíng)養(yǎng)菌絲粗二倍左右。3霉菌的觀察用鑷子連同培養(yǎng)基挑取放線菌菌苔置載玻片中央。放在潔凈的載玻片上，選

26、擇菌苔邊緣部位，在顯微鏡下依次用低倍鏡、中倍鏡、高倍鏡直接觀察，觀察時(shí)需不斷調(diào)節(jié)微調(diào)，仔細(xì)觀察菌絲，分生孢子梗和分生孢子。4. 酵母菌的觀察（1）在載玻片中央加一滴0.1%呂氏堿性美藍(lán)染液，液滴不可過多或過少，以免蓋上蓋玻片時(shí)，溢出或留有氣泡。然后按無菌操作法取在瓊脂斜面上培養(yǎng)48小時(shí)的酵母菌少許，放在呂氏堿性美藍(lán)染液中，使菌體與染液均勻混合。（2）用鑷子夾蓋玻片一塊，小心地蓋在液滴上。蓋蓋玻片時(shí)應(yīng)注意，不能將蓋玻片平放下去，應(yīng)先將蓋玻片的一邊與液滴接觸，然后將整個(gè)蓋玻片慢慢放下，這樣可以避免產(chǎn)生氣泡。（3）將制好的水浸片放置3分鐘后鏡檢。先用低倍鏡觀察，然后換用高倍鏡觀察酵母菌的形態(tài)和出芽情

27、況，同時(shí)可以根據(jù)是否染上顏色來區(qū)別死、活細(xì)胞。（4）染色半小時(shí)后，再觀察一下死細(xì)胞數(shù)是否增加。（5）用0.05%呂氏堿性美藍(lán)染液重復(fù)上述的操作。（五）實(shí)驗(yàn)結(jié)果1將鏡檢結(jié)果填于下表中，并列出所見主要生物。活性污泥來源，采樣日期絲狀微生物原生動(dòng)物后生動(dòng)物3繪圖說明你所觀察到的放線菌、酶菌以及酵母菌的形態(tài)特征。（六）思考題 1根據(jù)實(shí)驗(yàn)觀察情況，試對(duì)活性污泥質(zhì)量及運(yùn)行情況作初步評(píng)價(jià)。2.在自然界和實(shí)際應(yīng)用中放線菌有什么作用？（七）附錄1活性污泥中常見的絲狀微生物（1）球衣菌（Sphaerotilus）：由許多圓柱形細(xì)胞排列成鏈，外面包圍一層衣鞘，形成絲狀體。具有假分枝。單個(gè)菌體可自衣鞘游出，活潑運(yùn)動(dòng)或

28、粘附于鞘外。（2）貝氏硫菌（Beggiatoa）：無色而寬度均勻的絲狀體，與球衣菌不同的是外面無衣鞘，各絲狀體分散不相連接。絲狀體由圓柱形細(xì)胞緊密排列而成，有時(shí)可見硫粒。絲狀體不固著于基質(zhì)上，可呈匍匐狀滑行，菌體扭曲、穿插匍匐滑行于污泥之中。（3）發(fā)硫菌（Thiothrix）：亦由細(xì)胞排列成絲狀體，具薄鞘但一般鏡檢時(shí)不可見。其絲狀體基部有吸盤，可使菌體固著于基質(zhì)上生長(zhǎng)。在附著生長(zhǎng)時(shí)，有時(shí)菌絲體左右平等伸長(zhǎng)成羽毛狀，有時(shí)以放射狀從活性污泥絮絨體內(nèi)向四周伸展，有時(shí)菌絲體交織在一起自成中心向四周伸展。（4）霉菌（mould）：活性污泥中常見到菌絲體遠(yuǎn)較上述細(xì)菌為粗大的霉菌菌絲體和霉菌孢子。菌絲體有的

29、有隔，并具有真分枝。2活性污泥中常見的后生動(dòng)物（1）線蟲（Nematoda）：身體細(xì)長(zhǎng)呈線形，其橫切面呈圓形。常見卷曲不能自由伸縮，而是靠身體作蛇形扭曲而運(yùn)動(dòng)。（2）輪蟲（Rotifera）：形體很小，身體的前端或靠近前端有輪盤（頭冠），其上的纖毛經(jīng)常擺動(dòng)，有游泳和攝食的功能。在口腔或口管下面的咽喉部分膨大而形成咀嚼囊，內(nèi)有一套較復(fù)雜的咀嚼器，可以多少地伸出口外以攫取食物。（3）顫體蟲（Aeolosoma）：在活性污泥中最大、分化最高級(jí)的一種多細(xì)胞動(dòng)物，身體分節(jié)，節(jié)間有剛毛伸出，體表具有帶色澤的油點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)五 土壤中微生物的分離與純化（綜合性實(shí)驗(yàn)）（一） 實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 明確培養(yǎng)基的配制原理，并通過

30、對(duì)微生物培養(yǎng)基的配制，掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟2.掌握按照研究需要選取不同的環(huán)境以找到自己需要的目標(biāo)菌株的基本方法，學(xué)習(xí)分離純化微生物的基本操作技術(shù)。進(jìn)一步熟練和掌握微生物無菌操作技術(shù)；掌握微生物培養(yǎng)方法以及接種技術(shù)。（二）實(shí)驗(yàn)原理培養(yǎng)基是人工地將多種物質(zhì)按各種微生物生長(zhǎng)的需要配制而成的一種混合營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，用以培養(yǎng)或分離各種微生物。因此，營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)應(yīng)當(dāng)有微生物所能利用的營(yíng)養(yǎng)成分（包括碳源、氮源、能源、無機(jī)鹽、生長(zhǎng)因素）和水。根據(jù)微生物的種類和實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌囵B(yǎng)基也有不同的種類和配制。在土壤、水、空氣或及動(dòng)、植物體中，不同種類的微生物絕大多數(shù)都是混雜生活在一起，當(dāng)我們希望獲得某一種微生物時(shí)，就

31、必須從混雜的微生物類群中分離它，以得到只含有這一種微生物的純培養(yǎng)，這種獲得純培養(yǎng)的方法稱為微生物的分離與純化。為了獲得某種微生物的純培養(yǎng)，一般是根據(jù)該微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)、酸堿度、氧等條件要求不同，而供給它適宜的培養(yǎng)條件，或加入某種抑制劑造成只利于此菌生長(zhǎng)，而抑制其他菌生長(zhǎng)的環(huán)境，從而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀釋涂布平板法或稀釋混合平板法或平板劃線分離法等分離、純化微生物，直至得到純菌株。（三） 實(shí)驗(yàn)器材1 培養(yǎng)基與試劑牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏5g，蛋白胨 10g， NaCl 5g，瓊脂 1520g ，H2O 1000ml，pH 7.2-7.4高氏一號(hào)培養(yǎng)基：可溶性淀粉20g，K2HPO40

32、.5g， NaCl 0.5g，MgSO4.7H2O 0.5g，KNO3 1g， FeSO4 0.01g，瓊脂 1520g ，H2O1000ml，pH 7.2-7.4馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200g,蔗糖20g，瓊脂1520g，H2O 1000ml, pH自然。1%鏈霉素，0.5%重鉻酸鉀，結(jié)晶紫染液，盧戈氏碘液，95%乙醇，番紅2 儀器以及其他用品高壓滅菌鍋，超凈工作臺(tái)，普通光學(xué)顯微鏡，培養(yǎng)皿， 移液器， 天平，滅菌的袋子，小鏟，250ml三角錐形瓶，250ml燒杯，藥勺，無菌培養(yǎng)皿，盛9m1無菌水的試管6支、盛45m1無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶、無菌玻璃珠、接種環(huán)、酒精燈、顯微鏡、稱量

33、紙等。（四） 實(shí)驗(yàn)方法1土壤取樣根據(jù)實(shí)驗(yàn)的目的選取采樣地點(diǎn)，把采到的土壤裝進(jìn)取樣袋后直接帶回微生物實(shí)驗(yàn)室立即使用或放入4的冰箱備用，但放置時(shí)間不要超過一天。2 培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)基的類別培養(yǎng)基配制原料配置方法用于培養(yǎng)的菌種馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基馬鈴薯200g，葡萄糖20g, 瓊脂20g，水1000ml。將馬鈴薯去皮切塊，加1000mL蒸餾水，煮沸1020min。用紗布過濾，補(bǔ)加蒸餾水至1000mL。加入瓊脂，加熱溶化，分裝，121高壓滅菌20min。霉菌酵母菌高氏1號(hào)培養(yǎng)基可溶性淀粉20g,KNO3 1g,NaCl 0.5g,K2HPO43H2O 0.5g,MgSO47H2O 0.5g,FeSO47H

34、2O 0.01g,瓊脂20g,水 1000mL，pH 試紙。先將淀粉溶入燒杯中加熱攪拌至完全溶解，再加入其他成分依次溶解，最后加水至1000mL。調(diào)pH7.27.4，加入瓊脂，加熱溶化，分裝，121高壓滅菌20min。放線菌牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g,瓊脂20g，水1000ml，pH 試紙 。先將牛肉膏、蛋白胨溶入燒杯中加熱攪拌至完全溶解，再加入其他成分依次溶解，最后加水至1000mL。調(diào)pH7.27.4，加入瓊脂，加熱溶化，分裝，121高壓滅菌20min。細(xì)菌3.儀器滅菌將配置好的培養(yǎng)基，用報(bào)紙包扎好的培養(yǎng)皿、用橡膠塞封好的盛有9mL的試管、槍頭和裝有45mL蒸餾水與玻璃珠的三角錐瓶，玻璃珠放到高壓滅菌鍋進(jìn)行高溫蒸汽滅菌。4微生物的分離（1）倒平板 將肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏1號(hào)瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基溶化，待冷至5560時(shí)，在高氏1號(hào)