染色體核型分析

1、 .【實驗?zāi)康摹?. 了解小白鼠睪丸細(xì)胞染色體的形態(tài)及數(shù)目。2. 初步掌握小白鼠睪丸細(xì)胞染色體的玻片標(biāo)本制作方法。3. 觀察動物細(xì)胞染色體的數(shù)目和形態(tài)。【實驗原理】染色體的制備在原則上可以從所有發(fā)生有絲分裂的組織和細(xì)胞懸浮液中得到。最常用的途徑是從骨髓細(xì)胞、血淋巴細(xì)胞和組織培養(yǎng)的細(xì)胞中制備染色體。小型動物的染色體制片最好最有效的材料就是骨髓組織。骨髓細(xì)胞中，有絲分裂指數(shù)相當(dāng)高，因此可以直接得到中期細(xì)胞而不必象淋巴細(xì)胞或其它組織那樣要經(jīng)過體外培養(yǎng)；對大型動物通常采用對骨骼、脊或胸骨穿刺術(shù)吸取紅骨髓，小型動物多采用剝離術(shù)取股骨以獲得骨髓細(xì)胞。制作染色體標(biāo)本的先決條件1. 細(xì)胞具有旺盛的分裂能力選擇

2、活躍的組織：胸腺，骨髓，睪丸，小腸施加藥物使細(xì)胞分裂：PHA2. 設(shè)法得到大量的中期細(xì)胞：秋水仙素(1) PHA：粗細(xì)胞分裂，使淋巴細(xì)胞返幼，變?yōu)榱馨湍讣?xì)胞(2) 秋水仙素：破壞微管裝配，使紡錘體不能形成，使大量細(xì)胞停止在分裂中期。(3) 低滲作用：水進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)容空間變大，染色體間的距離拉大，易于染色體展開(4) 空氣干燥：使細(xì)胞和染色體展開(5) 固定：用甲醇：冰醋酸=3:1作用使蛋白質(zhì)變性，對染色體內(nèi)的組蛋白講，變性后硬度增加，保持了染色體的“及時形態(tài)”，對細(xì)胞膜蛋白講，變性使細(xì)胞膜硬度增強，形成屏障作用，防止了細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外溢和丟失。對于小鼠精巢染色體標(biāo)本的制作，一般包括以下幾個要

3、點: 1. 用一定劑量的秋水仙素破壞紡錘絲的形成，使細(xì)胞分裂停滯在中期, 使中期染色體停留在赤道面處; 2. 用低滲法使將細(xì)胞膨脹, 以至于在滴片時細(xì)胞被脹破, 使細(xì)胞的染色體鋪展到載玻片上; 3. 空氣干燥法可使使細(xì)胞的染色體在載片上展平, 經(jīng)Giemsa染色后便可觀察到染色體的顯微圖象。【實驗材料】1. 材料：小白鼠。2. 試劑：秋水仙素、0.3%KCl溶液、甲醇、冰醋酸、磷酸緩沖液（pH=6.8）吉姆薩原液。3. 器械：手術(shù)刀、手術(shù)剪、鑷子、試管架、解剖盤、注射器、針頭、吸管、離心管、離心機、玻片(冰片)、天平、試鏡紙、二甲苯、吸水紙、香柏油、燒杯、水浴鍋。【實驗步驟】4. 取雄性小鼠以

4、每克體重4ug注射秋水仙素，經(jīng)14-16小時后，斷頭法殺死小鼠，取出睪丸，用生理鹽水（0.9%的NaCl）吸去血污。5. 放入裝有1ml 0.3% KCl 液的小燒杯中剪碎（呈乳白色）。6. 用銅網(wǎng)過濾到刻度離心管中，再加0.3% KCl 液至4ml。7. 37 靜置30分鐘，進(jìn)行低滲處理。8. 以800-1000轉(zhuǎn)/分 離心8分鐘。9. 棄上清液，加入2ml甲醇、冰醋酸固定液（3:1），并用吸管吹氣，輕輕打散細(xì)胞，固定8min。10. 再以800-1000轉(zhuǎn)/分，離心8min。11. 棄上清液，加1ml固定液，制成細(xì)胞懸液，固定5min。12. 取潔凈的低溫預(yù)冷載玻片，距10-15cm高度滴

5、下2-3滴細(xì)胞懸液，從一邊輕輕吹氣，并隨時輕輕敲打，以使細(xì)胞均勻分布和促使染色體展開。13. 用濾紙擦去載玻片上多余液體，空氣干燥或文火干燥，染色。14. 用Giesma染色20-30分鐘，細(xì)水吸取多余染液，氣干。15. 鏡檢：低倍鏡下尋找分散良好、染色適中的分裂相，高倍鏡或油鏡下觀察染色體形態(tài)并計數(shù)。附：倒置染色法在玻璃板上用廢舊載玻片作支架，使標(biāo)本載玻片的標(biāo)本面向下放置到支架上，在玻璃板和標(biāo)本載玻片之間滴加Giemsa染液，目的一可以節(jié)省染料，二可以避免染液快速揮發(fā)，三可以防止染色顆粒沉淀，影響觀察，在操作時應(yīng)注意，多個樣品同時染色應(yīng)擺放緊密，不要有間隙；滴染液時應(yīng)盡量滿，不要有氣泡，以免

6、部分染色體不能著色?！緦嶒灲Y(jié)果】 圖一 染色體中期（10*40） 圖二 染色體中期未摔開（10*40）圖三 染色體間期（10*40）【實驗結(jié)果分析】圖一：此圖接近染色體分裂期的中期，染色體較粗，已發(fā)生固著，但是程度還不夠。在40*10的鏡下看到的染色體應(yīng)為顆粒狀，隱約能看到顆粒中的分叉。圖二：此圖明顯為染色體的中期，可以清楚地看到從兩級發(fā)出的紡錘絲牽拉染色體到細(xì)胞的赤道板。但是細(xì)胞膜沒有摔破，無法確認(rèn)染色體的個數(shù)。圖三：此圖為染色體的分裂間期或分裂期前期，染色體還較細(xì)，呈絲狀。 【反思與總結(jié)】 本次實驗我們一共做了三只小鼠，但最終的結(jié)果還是不夠理想。第一只小鼠的注射時間為21個小時左右，實驗操

7、作時在第一次進(jìn)行低滲時，我們實際加入的是等滲溶液，發(fā)現(xiàn)后立即加入水降低溶液的滲透壓，而且又補了一些低滲液，等離心，沉降等過程完成后，我們低滲已經(jīng)超過了規(guī)定時間。經(jīng)過觀察，發(fā)現(xiàn)中期的細(xì)胞較少，而且很多細(xì)胞堆疊在一起，沒有摔開。 第二只小鼠全過程都是按照實驗步驟規(guī)范地操作，由于第一次的許多細(xì)胞沒有摔開，我們就將滴片的高度增加到1.8m。經(jīng)過觀察，我們和第一次的結(jié)果做比較發(fā)現(xiàn)：雖然本次細(xì)胞摔得較散，但是摔開的細(xì)胞形態(tài)并沒有第一的效果好，初次之外，中期的細(xì)胞較少，絕大部分的細(xì)胞處于分裂間期。 經(jīng)過比較兩次的實驗結(jié)果與實驗步驟，我們歸納出了一下幾個需要注意的地方：1. 兩次制得的片中中期的細(xì)胞都比較少，

8、說明秋水仙素的作用效果不明顯，我們懷疑：秋水仙素在小鼠體內(nèi)一定時間后，可能會被機體代謝，停滯在中期的細(xì)胞可能會在細(xì)胞信號分子的誘導(dǎo)下發(fā)生凋亡或著將細(xì)胞中的秋水仙素代謝出去，恢復(fù)正常狀態(tài)，所以我們認(rèn)為注射秋水仙素的時間不是越長越好。我們通過查文獻(xiàn)，看到注射實驗為4-6個小時，決定將第三只老鼠的注射時間控制在這個范圍內(nèi)。2. 第一次的細(xì)胞雖然摔得沒有第二次的細(xì)胞好，但是第一次細(xì)胞的形態(tài)要比第二次好許多。我們認(rèn)為這與低滲這一步有很大的關(guān)系。第一次我們做的低滲時間較長，使細(xì)胞已經(jīng)膨脹到了一定程度，效果較好。第二次的時間較短，低滲不充分，因此應(yīng)該適當(dāng)?shù)匮娱L低滲時間。不過，據(jù)其他的實驗組所說，低滲時間過長

9、可能導(dǎo)致細(xì)胞在滴片之前裂解，在觀察的時候視野中都是雜亂、散落的染色體。除此之外，低滲的溫度也很重要，之前低滲的時候，所取的低滲液，用滴管吹細(xì)胞時均沒有進(jìn)行恒溫，在第三次實驗時我們要做到全方位的恒溫，在低滲和用固定之前，先把低滲液和固定液放入恒溫水中。3. 用銅網(wǎng)過濾的時候我們發(fā)現(xiàn)，若只是將銅網(wǎng)平鋪在試管上，則傾倒液體時，液體很容易沿著試管壁流出。改進(jìn)的辦法是：將銅網(wǎng)覆蓋在試管上時，用拇指壓一下銅網(wǎng)，使其形成一個凹槽，將液體倒人凹槽中，讓其慢慢地過濾，液面不要超過試管的高度，防止外溢。4. 用剪刀剪小鼠的睪丸，吸管吹氣打散細(xì)胞的時候要盡可能地仔細(xì)，使組織或細(xì)胞盡可能分散，體積盡可能小。這樣過濾得

10、到的液體就比較充裕，離心后，最終制得的細(xì)胞懸液也比較多，細(xì)胞的密度也較大。5. 第二次摔細(xì)胞的高度明顯比第一次的高度高，所得的細(xì)胞較分散，這點應(yīng)該堅持。6. 設(shè)備也很重要，我們在觀察之前需要找一個好的顯微鏡。經(jīng)過一番總結(jié)后我們制定出一套新的實驗方案準(zhǔn)備在第三只老鼠身上進(jìn)行實踐，其中有一下幾個要點：（1）秋水仙素：注射量，處理時間，自己配置秋水仙素（事先）（2）解剖小鼠取睪丸減少附帶組織，并用生理鹽水沖洗干凈，附帶血污影響觀察。剪刀切碎是要徹底，增多分離出來的細(xì)胞（3）低滲液的量可以稍多一些。低滲時間應(yīng)掌握準(zhǔn)確，低滲液預(yù)熱 全程恒溫處理 （隨時滴片觀察細(xì)胞形態(tài)，確定低滲終點。）低滲后的細(xì)胞吹打時

11、動作要輕（4）恒溫水浴箱的溫度計不太靈敏，用自己的溫度計（5）固定液的量以及固定的時間（6）離心速度不能高于 1000 r/min，離心之后用氣泡法吹散細(xì)胞時要適當(dāng)延長時間（7）摔細(xì)胞的高度（8）用質(zhì)量好的顯微鏡“Z”字型仔細(xì)觀察我們在做第三只小鼠的時候，先注射了1.5ml的秋水仙素，但是經(jīng)過了84個小時后，小鼠仍沒有死亡，估計秋水仙素的作用已經(jīng)消失。我們再一次注射前，自己配置了秋水仙素。從冰柜里取出了250mg的秋水仙素，進(jìn)過一個植物實驗室學(xué)姐的指導(dǎo)，我們來到了三樓用電子天平精確稱出了秋水仙素10.0mg加入到烘干的試劑瓶中，配置0.1mg/ml的秋水仙素溶液。我們于中午1：30給小鼠注射了配置的秋水仙素，到下午7：00的時候我們來到實驗室，準(zhǔn)備殺死小