《酶工程9核酶》PPT課件.ppt

1、第九章 核 酶,從人類認識到酶的存在開始到20世紀80年代初，人們一直認為酶的化學本質(zhì)是蛋白質(zhì)，這一概念根深蒂固，近似乎成為定論。 然而美國科羅拉多大學博爾分校的Thomas Cech和耶魯大學的Sidney Altman各自獨立發(fā)現(xiàn)具有生物催化功能的RNA卻從根本上改變了人們的這一認識觀念,1981年Cech等發(fā)現(xiàn)四膜蟲的核糖體前體RNA可以在沒有蛋白質(zhì)存在的情況下自身催化切除內(nèi)含子，完成加工過程,具體事件: 1981年Thomas Cech等在研究rRNA前體加工成熟時就發(fā)現(xiàn)四膜蟲的26rRNA前體中含有插入序列（IVS），在rRNA前體成熟過程中，IVS通過剪接反應被除去，并證實這一剪接

2、反應不需要任何蛋白質(zhì)的參與，是四膜蟲的基因內(nèi)區(qū)自行拼接的,1981年,耶魯大學的Sidney Altman等在從事RNaseP的研究中也發(fā)現(xiàn)了這一現(xiàn)象，RNaseP是細菌和高等生物細胞里都有的一種tRNA加工酶，它能在特定的位點上切開tRNA前體,1983年，就在Thomas Cech等發(fā)現(xiàn)RNA能自行拼接后的兩年后，Sidney Altman等就證明：在較高的Mg2+濃度下，RNaseP中的RNA（M1RNA）就單獨具有催化tRNA前體成熟的功能，而其蛋白質(zhì)組分卻不具備此種催化功能,根據(jù)當時催化劑不僅能加快反應速率，而且在反應前后催化劑本身不發(fā)生改變的準確定義，在Thomas Cech等發(fā)現(xiàn)

3、四膜蟲26SrRNA前體IVS的自身拼接后，科學家們還排斥它作為生物催化劑的資格，認為那是一種自體催化反應，拼接后的成熟rRNA與前體不同，尚不能被看成是嚴格意義上的催化劑,Sidney Altman等的發(fā)現(xiàn)就從實驗上消除了這一異議，原因是RNaseP所催化的反應是一種異體分子間的反應，而該反應正是在RNA的催化下完成的,此后， 1984年R. Lewin在Science發(fā)表的題為“First True RNA Catalyst Found”的報道標志著RNA催化劑的正式誕生。R. Lewin, First True RNA Catalyst Found , Science, 1984, 20

4、:266-267,Thomas Cech等把這類具有催化裂解活性的RNA分子取名為Ribozyme，在我國1994年科學出版社出版的英漢分子生物學與生物工程詞匯將Ribozyme譯為核酶，這是最普遍的譯法，也可被叫做核糖擬酶,結(jié)果: 這些具有催化活性的RNA的發(fā)現(xiàn)改變了傳統(tǒng)上“酶是蛋白質(zhì)” 的觀念，從此對具有催化活性的RNA，即核酶(ribozyme)的結(jié)構(gòu)、催化機制以及應用的研究日益深入,核酸分子在總體的催化潛力上和蛋白質(zhì)相差甚遠，但由于可以遺傳和變異而被自然界保留下來催化一些特殊的反應,核酶由于具有許多優(yōu)點而受到重視，例如用于治療的核酶注射入體內(nèi)不會產(chǎn)生免疫原性，對具有切割活力的核酶可以更

5、加自由的設計其切割RNA的位點,分子進化工程的誕生，使核酶的研究迅速發(fā)展，人工進化出自然界中不存在的多種功能的核酶（包括單鏈DNA酶），這些研究成果在理論和實際應用中都有著巨大的意義,傳統(tǒng)觀念,酶的化學本質(zhì)是蛋白質(zhì),只有蛋白質(zhì)才能有催化功能,核酶,RNA,只有蛋白質(zhì)才能 有催化功能,酶蛋白質(zhì),生物催化功能,上世紀80年代初Cech和Altman各自獨立地發(fā)現(xiàn),核酶,核酶,RNA,DNA,多糖,氨基酸酯,進一步的研究發(fā)現(xiàn)，這是一種多功能的生物催化劑可以作用于,核酶的作用底物,核酶按其大小不同，大致可以分為兩類，大分子核酶，如RNaseP、I組內(nèi)含子和II組 內(nèi)含子；其分子大小為幾百到幾千個核苷

6、酸；小分子核酶，如錘頭型核酶、發(fā)卡型核酶、 丁型肝炎病毒核酶等，其大小一般為35155 個核苷酸,根據(jù)核酶的催化反應不同，可以將核酶分成兩大類:剪切型核酶，這類核酶催化的是自身或者異 體RNA的切割，相當于核酸內(nèi)切酶，主要包 括錘頭型核酶、發(fā)夾型核酶、丁型肝炎病毒 (HDV)核酶以及有蛋白質(zhì)參與協(xié)助完成催化 的RNaseP；剪接型核酶，這類核酶主要包括I組內(nèi)含子和 II組內(nèi)含子，實現(xiàn)mRNA前體自我拼接，具 有核酸內(nèi)切酶和連接酶兩種活性,1. 核酶的催化類型 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了幾十種核酶，按反應類別可分為催化分子內(nèi)反應和催化分子間反應等兩大類，而催化分子內(nèi)反應的核酶又可分為自我剪接型核酶和自我剪切型核

7、酶,1.1 I型內(nèi)含子的自我剪接 Cech等在研究工作中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(RNA前體)很不穩(wěn)定，在沒有任何蛋白質(zhì)或酶存在的情況下，可自動切除413nt的內(nèi)含子片段(IVS)，并產(chǎn)生成熟的rRNA分子。nt:nucleotide,例如，L-19 IVS 就具有多種蛋白酶的催化功能，rRNA前體的自我剪接機制中的一系列反應都是由IVS的特殊結(jié)構(gòu)引起的,L-19 IVS(395nt)和394nt RNA的形成,四膜蟲r-RNA前體自我剪接反應,特點,產(chǎn)生特殊的二級和三級結(jié)構(gòu) 需要鳥苷,1.2 異體催化剪切型 RNase P是一個常見的酶，1978年Altman等證明了該酶是由RNA和蛋白質(zhì)兩部分組成，

8、具有來自前tRNA的5端引導序列，能有效地切割小RNA底物,RNase P的組成,原則上，只要具有CCA的反義RNA并能結(jié)合到靶RNA，任何RNA都可以作為RNase P的底物。RNase P是一種5端內(nèi)切酶，負責tRNA前體5端的成熟，對切點左側(cè)寡聚核苷酸順序和長度無嚴格要求，產(chǎn)物帶3-OH及5-磷酸末端,RNase P對tRNA前體的剪切,1.3 自體催化剪切型 自我剪切與自我剪接不同，自我剪接包括了剪切和連接等兩個步驟，已知能進行自我剪切的RNA分子有多個，如丁型肝炎病毒RNA、鏈孢霉線粒體RNA等,幾種自我剪切的RNA結(jié)構(gòu)，其中箭頭指出處為自我剪切部位,一、天然核酶,目前為止，在自然界

9、中發(fā)現(xiàn)的核酶根據(jù)其催化的反應可以分成兩大類： 剪切型核酶 核酶 剪接型核酶,核酶,剪切型 核酶,剪接型 核酶,異體催化剪切型或 分子間催化剪切型 核酶,自身催化剪切型或 分子內(nèi)催化剪切型 核酶,核酶的分類,似乎最有應用前景，因為人們對它的剪切機制和分子結(jié)構(gòu)要求已經(jīng)有所了解，可以針對病毒核酸、不良基因或惡性基因進行人工設計、合成相應的各種RNA或DNA片段作為核酸酶基因，定向地剪切病毒核酸或不良基因以及它們的轉(zhuǎn)錄中間產(chǎn)物，抑制它們的表達，進行疾病治療,1、剪切型核酶催化自身或者異體RNA的切割，相當于核酸內(nèi)切酶。主要包括錘頭型核酶，發(fā)夾型核酶，丁型肝炎病毒(HDV)核酶，以及有蛋白質(zhì)參與協(xié)助完成

10、催化的RNaseP,核酶的結(jié)構(gòu),核酶 的結(jié)構(gòu),錘頭狀模型,發(fā)夾模型,自身剪切的核酸酶的二級結(jié)構(gòu),2、剪接型核酶實現(xiàn)mRNA前體自我拼接，具有核酸內(nèi)切酶和連接酶兩種活性。主要包括組I內(nèi)含子和組II內(nèi)含子,一 錘頭型核酶,R. Symons等在比較了一些植物類病毒、抗病毒和衛(wèi)星病毒RNA自身剪切規(guī)律后提出錘頭結(jié)構(gòu)（hammerhead structure）狀二級結(jié)構(gòu)模型,由13個保守核苷酸殘基和三個螺旋結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的。（后來Koizumi等證明只需要11個特定保守核苷酸,錘頭型核酶的二級結(jié)構(gòu)和空間立體結(jié)構(gòu)示意圖 a中N,N代表任意核苷酸；X 可以是A、U或者C,但不能是G；I、II和 III是錘頭結(jié)

11、構(gòu)中的雙螺旋區(qū)；箭頭指向切割位點。 b 是錘頭型核酶與底物RNA分子結(jié)合的立體結(jié)構(gòu)模型，在磷酸骨架上結(jié)合有鎂離子,Symons等認為，只要具備錘頭狀二級結(jié)構(gòu)和13個保守核苷酸，剪切反應就會在錘頭結(jié)構(gòu)的右上方GUX序列的3端自動發(fā)生。無論是天然的還是人工合成的錘頭結(jié)構(gòu)都由兩部分構(gòu)成：催化結(jié)構(gòu)域（R）和底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域（S,William B. Lott等提出了錘頭型核酶催化反應的兩種可能的化學機制：“單金屬氫氧化物離子模型” “雙金屬離子模型,錘頭型核酶的兩種可能的催化機制以及HDV核酶的催化機制 單金屬氫氧化物離子模型，(b)雙金屬離子模型，(c)HDV 核酶中胞嘧啶充當一般堿進行催化的反應機理

12、,二 發(fā)夾型核酶,發(fā)夾型核酶的二級結(jié)構(gòu)模型,50個堿基的核酶和14個堿基的底物形成了發(fā)夾狀的二級結(jié)構(gòu)，包括4個螺旋和5個突環(huán)。螺旋3和4在核酶內(nèi)部形成，螺旋1(6堿基對)和2(4堿基對)由核酶與底物共同形成，實現(xiàn)了酶與底物的結(jié)合。核酶的識別順序是(G/C/U)NGUC，其中N代表任何一種核苷酸，這個順序位于螺旋1和2之間的底物RNA鏈上，切割反應發(fā)生在N和G之間,三 蛋白質(zhì)-RNA復合酶(RNaseP,蛋白質(zhì)-RNA復合酶主要催化tRNA前體成熟過程。例如S. Altman和N. Pace兩個研究組合作發(fā)現(xiàn)的大腸桿菌tRNA5成熟酶,蛋白質(zhì)-RNA復合酶由蛋白質(zhì)和M1RNA兩個組分構(gòu)成蛋白質(zhì)的

13、分子量為20kDa，M1RNA含有377個核苷酸。M1RNA單獨具有全酶活性，蛋白質(zhì)只是維護M1RNA的構(gòu)象,實驗證明來自不同原核細胞RNaseP中的M1RNA具有相似的三維結(jié)構(gòu)。與前面幾種剪切型核酶不同的是，RNaseP催化得到的產(chǎn)物的3端是羥基，5端是磷酸,四 組I內(nèi)含子和組II內(nèi)含子,組I內(nèi)含子(group I intron)和組II內(nèi)含子(group II intron)這類核酶比較復雜，通常包括200個以上核苷酸，主要催化mRNA前體的拼接反應,像蛋白質(zhì)酶一樣，內(nèi)含子形成高級結(jié)構(gòu)的折疊結(jié)果使關鍵殘基形成活性部位，在輔助因子的參與下實現(xiàn)自身剪接,組I內(nèi)含子能夠自身剪接的是與它們保守的二

14、級和三級結(jié)構(gòu)有關,Group Iintron,除了剪接之外，組內(nèi)含子還可催化各種分子間反應，包括剪切RNA和DNA、RNA聚合、核苷酰轉(zhuǎn)移、模板RNA連接、氨?；ソ獾?在體外，組內(nèi)含子的剪接是經(jīng)過兩個轉(zhuǎn)酯化反應來實現(xiàn)的，無蛋白質(zhì)參與,組和組內(nèi)含子的主要差別是第一步反應的化學機制,在組內(nèi)含子中，外部的鳥苷的3-羥基作為進攻基團，而在組內(nèi)含子中是內(nèi)部腺苷的2-羥基起作用,Group II intron,這個反應的結(jié)果形成一個帶突環(huán)的內(nèi)含子-3外顯子分子，其中第一個核苷酸經(jīng)由2，5-磷酸二酯鍵與內(nèi)含子的A相連。在第二步反應中，5外顯子的3-羥基進攻內(nèi)含子-3外顯子連接點，結(jié)果是兩個外顯子相連，并釋

15、放出帶有突環(huán)的內(nèi)含子,脫氧核酶 人們一般認為DNA是一種很不活潑的分子，在生物體內(nèi)通常以雙鏈形式存在，僅適合編碼和攜帶遺傳信息,單鏈DNA是否可以象RNA通過自身卷曲形成不同的三維結(jié)構(gòu)而行使特定的功能呢？ 答案是肯定的,在一些特殊條件下，以單鏈形式存在的DNA分子在理論上應該可能出現(xiàn)與人工合成的脫氧核酶相似的結(jié)構(gòu)。 但遺憾的是迄今為止尚未發(fā)現(xiàn)天然存在的脫氧核酶,目前報道的脫氧核酶都是通過體外選擇、篩選得到的,1994年，Breaker等利用體外選擇技術首次發(fā)現(xiàn)了切割RNA 的DNA分子，并將其命名為脫氧核酶，之后也被人稱為催化DNA,此后，脫氧核酶由于其具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定(生理條件下DNA比RNA穩(wěn)

16、定106倍，DNA的磷酸二酯鍵比蛋白質(zhì)的肽鍵抗水解能力要高100倍)、成本低廉、易于合成和修飾等特點，很快成為了人們研究的關注點,通常脫氧核酶的分子較小，與蛋白質(zhì)酶相比分子的多樣性也較差。已有的研究已經(jīng)表明，脫氧核酶都是單鏈DNA分子通過自身卷曲、折疊形成的三維結(jié)構(gòu)，在某些特殊的輔助因子作用下與底物結(jié)合并發(fā)揮催化功能,到目前為止，人們通過體外選擇的方法已相繼獲得具有切割RNA或DNA的水解酶功能、連接酶功能、多核苷酸激酶和過氧化物酶功能以及催化卟啉環(huán)金屬螯合的脫氧核酶,10-23結(jié)構(gòu)脫氧核酶 目前篩選到的最多的核酶，因為切割RNA分子而可以應用于基因治療中，阻斷體內(nèi)有害mRNA的表達,具有代表

17、性和實用價值的是Joyce等發(fā)現(xiàn)的切割RNA的10-23脫氧核酶,催化中心,底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域,10-23脫氧核酶相當于一種序列特異性限制性內(nèi)切核酸酶，可以分成兩個結(jié)構(gòu)域：催化結(jié)構(gòu)域和底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域。 催化結(jié)構(gòu)域也稱活性中心，是由15個核苷酸組成，第八個堿基可以是T、C或A，其中以T的活性最高，其余序列則高度保守。 活性中心兩端各為7-8個脫氧核苷酸組成的臂構(gòu)成了底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域，可通過堿基互補與底物RNA特異性結(jié)合，其序列可以根據(jù)靶RNA的改變而靈活變動,10-23脫氧核酶分子小，催化效率和底物專一性高，靶序列可以多樣化設計，因此除了醫(yī)療外，還有許多其它的應用價值,另一種切割RNA分子的脫氧核酶與

18、1023脫氧核酶的作用機制不同，Terry L. Sheppard等篩選到一個具有N-糖苷酶活性的脫氧核酶，這個酶可以水解(反應速率提高106倍)特定位置上脫氧鳥苷的N-糖苷鍵，實現(xiàn)去嘌呤作用，在這個位置上剪切DNA分子,8-17結(jié)構(gòu)脫氧核酶 8-17結(jié)構(gòu)脫氧核酶的結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)類似類似錘頭核酶且具有RNA切割活性的脫氧核酶的活性中心為8-17型，包含一個常為3個堿基對的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)和一個45nt的非配對區(qū)。莖至少應為2個G-C對，莖環(huán)5-AGC-3高度保守，非配對區(qū)一般為5-WCGR-3或5-WCGAA-3(W=A或T，=A或G)，切割位點是5-AG-3，A不與脫氧核苷酸配對，G則必須與脫氧核

19、苷酸配對,手槍型結(jié)構(gòu)脫氧核酶 手槍型結(jié)構(gòu)脫氧核酶包括了I型和II型等兩種二級結(jié)構(gòu)呈手槍狀并具有自切割功能DNA分子,二分”型結(jié)構(gòu)脫氧核酶 “二分”型結(jié)構(gòu)脫氧核酶是一類比較特殊的脫氧核酶，其活性中心為20nt，底物結(jié)合區(qū)為58nt，具有RNA切割活性，識別底物RNA位點為AANNN（N為任何一種核苷酸，不同組合切割活性有一定差異,二分”型結(jié)構(gòu)脫氧核酶的通用結(jié)構(gòu),環(huán)狀結(jié)構(gòu)脫氧核酶 以-內(nèi)酰胺酶mRNA為靶位點，設計并合成10-23結(jié)構(gòu)脫氧核酶，將其克隆到噬菌體M13mp18質(zhì)粒中，通過噬菌體表達系統(tǒng)產(chǎn)生含有脫氧核酶片段的單鏈環(huán)狀DNA分子,DzM13環(huán)狀脫氧核酶的結(jié)構(gòu),在10-23結(jié)構(gòu)脫氧核酶分子引入環(huán)狀結(jié)構(gòu)后，不僅提高了其穩(wěn)定性和在生物體內(nèi)的遺傳性，而且在一定的條件下具有特異性切割RNA-DNA嵌合底物的功能,核酶(脫氧核酶)的應用,基因治療的概念出現(xiàn)在二十幾年前，現(xiàn)在已經(jīng)在臨床上得到了實際應用?；蛑委熥钤绲?/p>