第八章抗生素藥物的分析

1、第八章抗生素藥物的分析第一節(jié)概述抗生素的概念：具有抑制或殺滅微生物的一類物質(zhì)?？股氐奶卣鳎荷矬w在生命活動過程中合成的次級代謝產(chǎn)物O性質(zhì)不穩(wěn)定，易降解、聚合純度一般較低臨床上會引起不良反應(yīng)臨床應(yīng)用廣泛，影響大抗生素藥品質(zhì)量研究的項目:性狀及鑒別試驗，含量測定或效價測定，酸堿度 直度，水分或干燥失重，安全試驗（尊希養(yǎng)裡5,熱原，降壓物質(zhì)，無菌。其他檢查：組分、雜質(zhì)、晶型、比旋度、灰分、 重金屬、熔點等?？股厮幤贩治龀Ｓ玫姆椒ǎ何锢矸椒?旋光法、紫外、紅外、色譜等=III化學(xué)方法（專屬性不強）:功能團反應(yīng)，鑒別和 含量的測定。容量分析法：酸堿滴定（青霉素 含量測定）和碘量法。生物學(xué)方法：酶反應(yīng)

2、、微生物法測定效價L第二節(jié)抗生素效價微生物檢定法、微生物檢定法定義：是利用微生物發(fā)育時對某些物質(zhì)的特殊依賴 性，按這些物質(zhì)對微生物生長的影響，對他們作 出定量鑒定的方法。微生物檢定法可分為三類： 稀釋法(Hlute method)、比濁法(turbid compare method)、瓊脂擴散法(diffuse method)。與化學(xué)方法相比: 優(yōu)點：1、原理與醫(yī)療要求基本一致2、對微生物作用直接反映其抗菌活性缺點：1、結(jié)果是總效價，無法區(qū)分多組分2、時間長，有一定誤差，操作繁雜:、抗生素標(biāo)準(zhǔn)效價(potency)單位牛津單位:抑制50毫升肉湯培養(yǎng)基中金黃色葡萄球 菌生長的青霉素的最低含量為一

3、個牛津單位.一個牛津單位相當(dāng)于06ug的青霉素鈉鹽所具有的 抗生活力，lmg青霉素G鈉鹽含有1667個牛津單 位，(IU)(一) 稀釋單位(u/ml, u/mg)1!將lmg抗生素配成溶液，在一定條件下進行稀釋， 對某一細(xì)菌能抑制其生長的最高稀釋度，即為 lmg抗生素中可含有的單位。（二）重量單位（u/mg）III以抗生物有效成分（即生理活性部分） 的重量作為抗生素的單位。稱重量單位 如一個鏈霉素堿卒位的重量為1微克，一 個青霉素G鈉鹽的單位的重量為06微克。 同一種抗生素的各種鹽的校價可根據(jù)其 分子量與標(biāo)準(zhǔn)鹽類進行換算而得。青霉素G鉀鹽的理論效價(U/mg)二青霉素G鈉鹽的理論效價x青霉素G

4、鈉鹽的分子量青霉素G鉀鹽的分子量1667x356.37372.48= 1593 (U/mg)1類似重量單位：以抗生素鹽類純品的重量為單位。包括無生 物活性的酸根和金屬離子。2重量折算單位以與原始的生物活性相當(dāng)?shù)募兛股貙嶋H 重量為一個單位，3特定單位以特定抗生素某一批產(chǎn)品的某一重量為一個 單位，經(jīng)有關(guān)國家權(quán)威機構(gòu)認(rèn)可而定.效價測定的方法：一、稀釋法(dilute method)二、比濁法 (turbid compare method)三、瓊脂擴散法(diffuse method)稀釋法1=理用液體培養(yǎng)基逐級將抗生素稀釋, 在各管中加入等量的試驗菌液，進行培養(yǎng), 觀察抑制細(xì)菌生長的最低抗生素濃度

5、，再 與同法測定的標(biāo)準(zhǔn)品終點作比較，從而求 得被測抗生素的效價。5ml（或 2ml_一 2 J標(biāo)準(zhǔn)液或被檢液 12345液體培養(yǎng)基u 空白 X=(T/S)*C X樣品效價(U/ml) T檢品液最大稀釋倍數(shù) S標(biāo)準(zhǔn)品液最大稀釋倍數(shù) C標(biāo)準(zhǔn)品液效價(U/ml)試管編號12345678910稀釋倍數(shù) 標(biāo)準(zhǔn)品 供試品2481632+64+128+256+512+1024+細(xì)菌被抑制+:細(xì)菌生長X二(T/S)*C= (16/32) *40=20 (U/ml)2、3、4、5、1試驗菌生長完全抑制 生長50%抑制 指示劑變色 電位差的改變 菌種的溶血現(xiàn)象等原理：將一定量的抗生素加至接種有試驗 微生物的液體培

6、養(yǎng)基內(nèi)，混勻后，經(jīng)短期 培養(yǎng)（約3-4h）,測量培養(yǎng)基濁度，其濁 度與細(xì)菌數(shù)、細(xì)菌群體質(zhì)量存在直接關(guān)系, 在一定的范圍內(nèi)符合比耳定律。細(xì)菌數(shù)、細(xì)菌群體質(zhì)量又直接受抗生素效 價的影響。耳.影響因素：鼻一、影響比濁法的物理因素1、散射現(xiàn)象2、菌液濃度:3、細(xì)菌體大小的變化1=二、培養(yǎng)基：在沒有外加抑制劑的情況下， 菌體的生長受培養(yǎng)基的成分、酸度、培養(yǎng) 溫度、通氣等條件影響。一般的試驗菌是 金黃色葡萄球菌，pH在6.8-78。三、培養(yǎng)：溫度、振搖。一般培養(yǎng)時間3小 時，可縮短為2小時。I操作流程如圖:1=基本要點：乃. 1培養(yǎng)條件的控制：試管規(guī)格均一水浴* 均勻，試管按拉丁方排列。2細(xì)菌生長誤差的控

7、制：3測量時間的控制：各管應(yīng)先充分混勻， 將菌液移入比色皿后靜止2分鐘后測定。圖313細(xì)菌比濁法、大試竝丁方排列圖 為電動攜拌機m?三、瓊脂擴散法(diffuse method) 電管碟法*管碟法原理：抗生素在涂布特定菌的瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)擴散，形成!1II=J已一定濃度抗生素的球型區(qū)，抑制試驗菌生長，通過透 明培養(yǎng)基觀察抑菌圈，抗生素劑量的對數(shù)與抑菌圈面 積或直徑成正比。在同樣條件下將已知效價的標(biāo)準(zhǔn)品 溶液與未知效價的供試品溶液的劑量反應(yīng)(抑菌圈)進 行比較；當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品和供試品是屬于同一性質(zhì)的抗生素 時，標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液.對一定試驗菌所得的 劑量反應(yīng)曲線，在一定劑量范圍內(nèi)應(yīng)互相平行。根據(jù)測豔蠶

8、誡慕法及列量法。抑菌圈的形成T-擴散時間（h）、. M-抗生素在管中的量（U卩 r抑菌圈的半徑（mm ）L 一管的高度（mm）H培養(yǎng)基的厚度（mm）3-8抗生素在管嚟法中呈球面擴散示意圖C-最低抑菌濃度（U/ml ） D擴散系數(shù)（mm2/h ）ogAf =(l/921DT)r2 +logCx4D7H)M:抗生素在管中的量 D：擴散系數(shù) T：擴散時間 H：培養(yǎng)基厚度 C：=9.21DT(log M-logCx 4ttDTH)D 的 響因抗生素本身事構(gòu)、分子量等，結(jié)構(gòu)簡單者容易擴 散，分子量大的擴散就慢，雜質(zhì)：抗生素或培養(yǎng)基中含有雜質(zhì)，雜質(zhì)本身也 有擴散系統(tǒng)，看干擾抗生素的擴散，影響抑菌圈 的大小

9、和清晰度。瓊脂含量：含量過多影響抗生素的擴散，過少又 使鋼管下陷，影響抑菌圈的大小。菌種對抗生素的吸附作用：pH影響分子的形式、溫度影響擴散D增大，也增大 T的影響： 一般T增加，增大，但時間太長影響抑菌圈 清晰度。.菌圈直徑越大，M還與抗生素的抗菌活性、 濃度、鋼管的大小、劑型、輔料等有關(guān)。 C的影響：C越小，抑菌圈直徑越大，C與菌種、 菌量、培養(yǎng)基、溫度等有關(guān) H的影響：培養(yǎng)基增厚，則抑菌圈減小。 M的影響：在一定的范圍內(nèi)，小管內(nèi)M越大， 抑操作中要注意: 1試驗菌種：挑選合適的敏感菌;用適宜的菌種保存方法；定期對菌種分離純化;控制菌齡菌量 2培養(yǎng)基：培養(yǎng)基的成分影響抑菌圈的大1=II小和

10、清晰度，pH也很重要。一劑量法（標(biāo)準(zhǔn)曲線法） 一劑量法（標(biāo)準(zhǔn)曲線法）原理：在一定范圍內(nèi)，抑菌圈的直徑隨抗生素濃度的 增減而增減。并且抑菌圈的直徑與抗生 素的對數(shù)劑量成線性關(guān)系。據(jù)此測定抗8 6 4 2 O 8 62 2 2 2 2 1 1(UIUO0 杷SSS0.1 0.512 3折出圭誡疔E/mlY二a+bXY:抑菌圈直徑A：截距:;蠶素濃度的對數(shù)。o方法：為了消除平板間的差異，在每一平板的含菌 培養(yǎng)基上放置6個小鋼管，相間的3個小管內(nèi)加入 j啦笙素標(biāo)準(zhǔn)品的某一濃度(Ck),他所產(chǎn)生的抑 鼻窗圈責(zé)隹年筠值為，禍外3個小管內(nèi)加入標(biāo)準(zhǔn)品 的中心濃度(Co),他所產(chǎn)生的抑菌圈直徑平均值令垃=Yk

11、Yo這樣采用自身對照的方法，可以消除平板間的誤差, 使結(jié)果更加準(zhǔn)確。f= a+bX標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：做8個濃度，取24個平皿，分8組, 每組3個取平均值。fk對X作圖。檢品的效價檢定：取3個平皿，每個放6個小管。在間隔的3 個小管內(nèi)加入抗生素標(biāo)準(zhǔn)品的中心濃度 (Co),另3個小管內(nèi)加入估計濃度相當(dāng)于 Co的檢品溶液。測量出血,從標(biāo)準(zhǔn)曲線中 計算出檢品的濃度，在換算出每毫克的 單位數(shù)。二劑量法:將抗生素的標(biāo)準(zhǔn)品及檢品各稀釋成有 一定比例的二種劑量（2： 1或4： 1）,即高劑量和低劑量，在同一平板上進行對比, 根據(jù)所產(chǎn)生抑菌圈大小來計算檢品效價的 方法。豔抗生素標(biāo)準(zhǔn)品高劑量(dS2)所致的抑菌圈I

12、m UH：為抗生素檢品高劑量(dT2)所致的抑菌圈直徑 UL：為抗生素檢品低劑量(dTl)所致的抑菌圈直徑IV0 - D anti log WTIZ UH-ULSH-SLW =/ 二 log/logL 二 logKUH -SH +UL-SL1高劑量抑菌圈直徑應(yīng)為20-24nm,個別可為18-24mm,高劑量與低劑量抑菌圈直徑之差應(yīng)大于或等于2rrirri。2、底層瓊脂20ml,上層5ml,每一檢品所用平板不少于4個。3、等距安置小鋼管4個，相對角為同一物質(zhì)。4、8為10010% （更精確要求1005%）5、標(biāo)準(zhǔn)品與檢品同質(zhì)三劑量法:應(yīng)用高、中、低三種劑量，在同一實驗條件下比較標(biāo)準(zhǔn)品及檢品溶液的

13、抑菌圈 大小，以求得檢品效價的方法。3-7三劑量法檢品與標(biāo)準(zhǔn)品間平行直線關(guān)系S3:為抗生素標(biāo)準(zhǔn)品高劑量(dS3)所致的抑菌圈直徑SI:U3：U2：Ul:為抗生素檢品低劑量(dTl)所致的抑S2:外抗生素標(biāo)準(zhǔn)品中劑量(dS2)所致的抑菌圈直徑 生素標(biāo)準(zhǔn)品低劑量(dSl)所致的抑菌圈直徑 生素檢品高劑量(dT3)所致的抑菌圈直徑 生素檢品中劑量(dT2)所致的抑菌圈直徑 直徑IV0 D anti log U3 + U2 + U1-S3-S2-S13TI7 U3-U1 + S3-S1w =4/ = logK求：卜標(biāo)準(zhǔn)品屮劑量抑菌圈直徑15-18mm2、高、中、低劑距為上083、每一檢品不得少于6個平

14、皿4、每板上等距安放小鋼管6個5、e： 10010% (100%5%)亓影響抗生素效價管碟法測定結(jié)果的 丄因素及其控制（一）影響抑菌圈形狀的因素與控制III1. 稀釋抗生素用的緩沖液的PH值、鹽濃度的影 響111pH值低或含鹽濃度高，就會不顯抑菌圈或呈卵 團形轆冒。這晨因為蟹龕瘠液瞼抵魔甌 或pH盾巌，可能改變抗生素分子的解離狀殺, 影響了抗生素對試驗菌抑制作用。1=2. 制各瓊脂培養(yǎng)基菌層，加菌時培養(yǎng)基溫度的 影響3. 測試用的器材洗凈度的影響4雙碟培養(yǎng)溫度的影響5其他操作的影響（二）影響抑菌圈邊緣清晰度的因素與控制圈的邊緣1試驗菌長時間放置.菌群中的一些菌株生理特 醉紅或是生長速度改變，或

15、對抗生素的 學(xué)建肴所變化，往往出現(xiàn)雙圈，抑亠1 不蒲。=J在檢定時菌層培養(yǎng)基中的菌量影響抑菌圈，菌層 培養(yǎng)基中的菌量過低，抑菌圈邊緣模糊不清，菌 量璋高亠使理夏圈太塵并具影靈敏度。 因此，在正我耀測之俞，找出巖適Wio2培養(yǎng)基的原材料品種與質(zhì)量，生測用培養(yǎng)基用 的原務(wù)料的選擇很重要。3調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值或增加適量的鹽濃度可使抑 菌團清蛻4. 不適備延長雙碟的培養(yǎng)時間，使抑菌圈邊緣 不清?？股匦r管碟法測定的操作技術(shù)操作分為八步：1試驗菌的純化與懸液的制備2緩沖液、滅菌水與培養(yǎng)基的制備 3標(biāo)準(zhǔn)品、供試品的稱量、溶解與稀釋4雙碟的制備及放管5滴加藥液6恒溫培養(yǎng) 7測量抑菌圈直徑或面積 8計算操作

16、流程:圖39抗生素效價檢定管碟法操作流程BH右四、比濁法與管碟法比較比濁法管碟法優(yōu)點1、快速1結(jié)果較穩(wěn)定2、客觀、精確2、大批量3、無擴散影響缺點!、對樣品潔凈度 要求高1、擴散因素影響較 大2、實驗要求較嚴(yán)2、時間長（2天）3、操作繁瑣,人為因 素的干擾第二節(jié)抗生素類藥物的鑒別一、B內(nèi)酰胺類抗生素的鑒別ch3RCONH!-co2h結(jié)構(gòu)的共同點：1、和內(nèi)酰胺相鄰的碳原子上有一 竣基，2、內(nèi)酰胺中氮原子相對的碳原子上有一 功能團氨基。分類：青霉烷類，頭抱烯類,碳青霉烯類（硫霉素）,單環(huán)B-內(nèi)酰胺（克拉維酸）。鑒別:1、酶法:B-內(nèi)酰胺酶2、紅外吸收光譜法：3000-2800 (C-H), 335

17、0cnri (N- H), 1800-1600基)，1460-1375 (甲基或次甲基)3、紫外吸收光譜法4、弟三酮反應(yīng)：是a氨基的反應(yīng)，與苗三酮縮合, 生成藍紫色化合物。5、色譜法：薄層色譜后，氯鉗酸與硫醛基反 應(yīng)是靈敏度高的顯色試劑二、氨基糖昔類抗生素環(huán)己醇配基以糖昔鍵與氨基糖相連。鏈霉素，布魯霉素，卡那霉素，慶大霉素，新霉素。（一）呈色反應(yīng)1、昂三酮反應(yīng)：2、坂口反應(yīng)：鏈霉素水解產(chǎn)物鏈霉弧特有。鏈霉肌，8徑唾咻 分別與次漠酸鈉反應(yīng)，其各自的產(chǎn)物在相互作用生成橙紅色化 合物。3、糖類反應(yīng)：莫利西反應(yīng)基乙糖，在堿性條件下與乙酰丙酮縮合，形成毗咯樣的衍生物，在堿性條件下與對二甲胺基苯甲醛的乙醇

18、 及鹽酸溶液成紅色，在540nm處可定量測定。5、麥芽酚反應(yīng):水解、重排.麥芽酚紫紅色絡(luò)合物OHH+、四環(huán)類抗生素:氫化四駢苯丿四環(huán)素，土霉素，金霉素，強力霉素。（一）呈色反應(yīng)1、濃硫酸反應(yīng)四環(huán)素深紫色;土霉素朱紅色；2、三氯化鐵反應(yīng):金霉素藍色至綠色; 強力霉素 黃色；酚輕基嶷）熒光反應(yīng):土霉素綠色熒光,（三）紫外光譜 （四）色譜四、大環(huán)內(nèi)酯抗生素結(jié)構(gòu)：一個大環(huán)內(nèi)酯環(huán)為母核，通過糖昔鍵 與1-3個糖相連。（紅霉素，螺旋霉素，柱晶 白霉素）（一）呈色反應(yīng)X、硫酸反應(yīng)：遇硫酸均呈紅棕色2、莫利西反應(yīng)：糖類的反應(yīng)3、Seliwanaff 反應(yīng)：糖壁一糖醛衍生物間苯一酚.具顏色產(chǎn)物紅霉素淡黃色;螺旋

19、霉素亮紫紅色;碳霉素 深青紫色；柱晶白霉素 淡青色;=1X（二）薄層色譜 ?三）光譜學(xué)鑒別紫外光譜紅外光譜五、利福霉素類抗生素的鑒別結(jié)靈成第勰翳鍵冊 勰讓代表藥物：利福平（r辻ampicin） 鑒別：呈色反應(yīng)：1濃鹽酸反應(yīng):2三氯化鐵：，向1毫升利福霉素的溶液中，滴加三氯 化鐵乙醇溶液，有綠色，藍綠色。表明有酚輕基3硝酸鹽反應(yīng)：利福平，溶液中加入硝酸鈉溶液，顏色 由橙色變?yōu)榘导t色。q.六、多肽類抗生素:抗感染的桿菌肽(Bacitracin)、多粘 菌素、萬古霉素。用于癌癥治療的放線菌蘇 D、掠乗霉素。鑒別：苗三酮反應(yīng):磷餌酸反應(yīng):J第三節(jié)抗生素類藥物的雜質(zhì)檢查高分子雜質(zhì)、降解產(chǎn)物及異構(gòu)體1青霉

20、素過敏原：青霉嗟瞠多肽或青霉囈輕蛋白 凝膠過濾法分離，用Penamaldate法測定 亠HgCI2青霉嗟醴衍生物 Penamaldate半合成B -內(nèi)酰胺類抗生素中微量雜質(zhì)N, N二 甲基苯胺的測定：2、鏈霉素毒性雜質(zhì)：鏈霉肌，鏈肌雙氫鏈糖;雙氫鏈霉素;鏈霉素醛 基結(jié)合物；神經(jīng)毒性：二鏈霉胺III二鏈霉胺含量測定原理：二鏈霉胺等不被KBHU還原，能與鹽酸氨基JR 反應(yīng)，生成的縮氨JR在233nm有吸收峰、土霉素脫水土霉素、差向土霉素、a阿撲土 霉素、0阿撲土霉素等降解產(chǎn)物薄層分離,熒光測定4、四環(huán)素脫水四環(huán)素、差向四環(huán)素、差向脫水四環(huán)素HPLC測定二F、無機雜質(zhì)的檢查 三、溶媒殘留量 1、比色法：甲