SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)分子量

1、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)分子量,SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳技術(shù)是動(dòng)物生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)教學(xué)中一個(gè)重要實(shí)驗(yàn)之一,能夠帶動(dòng)生化實(shí)驗(yàn)技術(shù)綜合型實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的開設(shè)。 如：蛋白質(zhì)鹽析沉淀提取 葡聚糖凝膠層析分離 DEAE-纖維素分離提純蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)純度鑒定、蛋白質(zhì)分子量測(cè)定等,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?通過該實(shí)驗(yàn)使學(xué)生掌握SDS-PAGE測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的原理； 掌握該技術(shù)的操作方法（基礎(chǔ)性很強(qiáng)，使用范圍寬闊； 運(yùn)用SDS-PAGE測(cè)定蛋白質(zhì)分子量及染色鑒定,二、實(shí)驗(yàn)原理,帶電質(zhì)點(diǎn)在電場(chǎng)中向帶有異相電荷的電極移動(dòng)，這種現(xiàn)象稱為電泳。 電泳分類：移動(dòng)界面電泳、區(qū)帶電泳等。 區(qū)帶電泳 是在半固相或膠狀介質(zhì)上加一

2、個(gè)點(diǎn)或一薄層樣品溶液，然后加電場(chǎng)，分子在支持介質(zhì)上或支持介質(zhì)中遷移,區(qū)帶電泳使用不同的支持介質(zhì)，有濾紙、纖維素粉、聚氯乙烯樹脂、淀粉凝膠、瓊脂凝膠、醋酸纖維素膜，現(xiàn)在則多用聚丙烯酰胺（PAGE）和瓊脂糖凝膠,一）分類 PAGE根據(jù)其有無濃縮效應(yīng)，分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類： 1. 連續(xù)系統(tǒng)：電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，主要靠電荷和分子篩效應(yīng),2.不連續(xù)系統(tǒng)：由于緩沖液離子成分、pH、凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在電場(chǎng)中泳動(dòng)不僅有電荷效應(yīng)，分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳,二）特點(diǎn)： SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，是在

3、 聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進(jìn)SDS（十二 烷基磺酸鈉,蛋白質(zhì)在一定濃度的含有強(qiáng)還原劑的SDS溶液中，與SDS分子按比例結(jié)合，形成帶負(fù)電荷的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物。 蛋白質(zhì)喪失了原有的電荷狀態(tài)形成僅保持原有分子大小為特征的負(fù)離子團(tuán)塊，降低或消除了各種蛋白質(zhì)分子之間天然的電荷差異，因此在進(jìn)行電泳時(shí),蛋白質(zhì)分子移速度取決于分子大小。當(dāng)分子量在15000KD到200000KD之間時(shí)，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系。合下式： ，式中 將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對(duì)分子量對(duì)數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量,圖1 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)與待

4、測(cè)樣品電泳圖譜,圖2 電泳遷移率與logMW之間的關(guān)系,94 000 62 000 43 000 31 000 20 100 14 400,膠槽1,2,3,注：膠槽1 標(biāo)準(zhǔn)蛋白；膠槽2、3 樣品蛋白,得到同行專家贊,采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)蛋白質(zhì)分子量時(shí)，必須完全打開蛋白質(zhì)之間的二硫鍵，使蛋白質(zhì)分子被解聚，SDS才能定量地結(jié)合到亞基上。因此在用SDS處理樣品同時(shí)用巰基乙醇處理。巰基乙醇是一種強(qiáng)還原劑，它使被還原的二硫鍵不易再氧化，從而使很多不溶性蛋白質(zhì)溶解而與SDS定量結(jié)合,三、 實(shí)驗(yàn)試劑和器材,材料 實(shí)驗(yàn)試劑 1.低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白試劑盒: 兔磷酸化酶B MW=97,400 牛血清白

5、蛋白 MW=66,200 兔肌動(dòng)蛋白 MW=43,000 牛碳酸酐酶 MW=31,000 胰蛋白酶抑制劑 MW=20,100 雞蛋清溶菌酶 MW=14,400 開封后溶于200l蒸餾水，置-20保存，使用前室溫融化，沸水浴中加熱3-5分鐘后上樣。 樣品1：稱3mg樣品1，加2 ml蒸餾水溶解,2. 30%丙烯酰胺（Acr）：稱Acr30g，甲叉雙丙烯酰胺 （Bis）0.8g，加蒸餾水至100ml，過濾后置棕色瓶中 3. 10%SDS（十二烷基磺酸鈉） 4. 1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl緩沖液：稱取Tris18.2g（PH計(jì),7）10%過硫酸銨(AP) （8）TEMED（四甲基

6、乙二胺） （9）樣品溶解液：SDS（100mg）+巰基乙醇（0.1ml）+ 溴酚藍(lán)（2mg）+甘油（2g） +0.05mol/L pH8.0Tris- HCl（2ml），最后定容至10ml。 （10）固定液：取50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混勻。 （11）染色液：稱取考馬斯亮藍(lán)R250 0.125g，加上述固定液 250ml， 過濾后備用。 （12）脫色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸餾水定容至1000ml。 （13）電極緩沖液（內(nèi)含0.1%SDS，0.05mol/LTris- 0.384mol/L甘氨酸緩沖液pH8.3）：稱Tris6.0g，甘 氨酸28.8g，加入SDS1g，加

7、蒸餾水使其溶解后定容至1000ml,實(shí)驗(yàn)器材,垂直板電泳裝置 直流穩(wěn)壓電源電泳厚膠濃度后要做8各小時(shí)，薄膠5各小時(shí)） 電泳儀 標(biāo)準(zhǔn)型酸度計(jì)（TLD80-2B） 離心機(jī)等,四、實(shí)驗(yàn)過程 如：免疫球蛋白G 分子量的測(cè)定 （一）血清-球蛋白的提取 硫酸胺鹽析沉淀法 （二） -球蛋白脫鹽純化 葡聚糖凝膠過濾（柱層析法）除去硫酸胺，得到-球蛋白（去年完成的基金項(xiàng)目） （三）純化免疫球蛋白G DEAE-離子交換纖維素法純化免疫球蛋白G。 （四） SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定血液免疫球蛋白G的分子量（ 連續(xù)四個(gè)單項(xiàng)實(shí)驗(yàn),1）制膠（簡(jiǎn)單敘述）（雙層膠，摸索膠濃度） A.將玻璃板用蒸餾水洗凈晾干, 準(zhǔn)備2個(gè)

8、干凈的錐形瓶。把玻璃板在灌膠支架上固定好。 B.按比例配好分離膠，溶液立即傾入制膠模板中(1 5模板)，加少許蒸餾水，待膠凝固后，倒出水并用濾紙把剩余的水分吸干，按比例配好濃縮膠，連續(xù)平穩(wěn)加入濃縮膠至離邊緣5mm處，樣梳需一次平穩(wěn)插入，靜置40分鐘，待模板中的膠定型后，輕輕取出梳形樣品槽模具，梳口處不得有氣泡，拔出樣梳后，在上槽內(nèi)加入緩沖液,C.拔出樣梳后,在上槽內(nèi)加入緩沖液, D.加樣（摸索加樣量） 取10l標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶解液于EP管內(nèi)，再加入10l 2倍樣品緩沖液，上樣量為20l。 取10l樣品溶液，再加入10l 2倍樣品緩沖液，上樣量分別為5l 和10l。 E.用微量注射器距槽底三分之一處進(jìn)

9、樣,加樣前,樣品在沸水中加熱3分鐘，去掉亞穩(wěn)態(tài)聚合,F.電泳槽中加入緩沖液，接通電源，進(jìn)行電泳，開始電流恒定在8mA，（電流、電壓）當(dāng)進(jìn)入分離膠后改為16mA，溴酚藍(lán)距凝膠邊緣約5mm時(shí)，停止電泳。 G.凝膠板剝離與染色 電泳結(jié)束后，撬開玻璃板，將凝膠板做好標(biāo)記后放在大培養(yǎng)皿內(nèi)，加入染色液，染色 過夜。 H.脫色 染色后的凝膠板用蒸餾水漂洗數(shù)次，再用脫色液脫色 。剝膠時(shí)要小心,保持膠完好無損,染色要充分,圖1 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)與待測(cè)樣品電泳圖譜,圖2 電泳遷移率與logMW之間的關(guān)系,五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析,94 000 62 000 43 000 31 000 20 100 14 400,膠槽1,2,3

10、,注：膠槽1 標(biāo)準(zhǔn)蛋白；膠槽2、3 樣品蛋白,六、分析計(jì)算,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：按下式計(jì)算 電泳遷移率 = 樣品遷移距離/溴酚籃遷移距離 以每個(gè)蛋白標(biāo)準(zhǔn)的分子量對(duì)數(shù)對(duì)它的相對(duì)遷移率作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線，量出未知蛋白的遷移率即可測(cè)出其分于量，這樣的標(biāo)難曲線只對(duì)同一塊凝膠上的樣品的分子量測(cè)定才具有可靠性,標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量（標(biāo)準(zhǔn)試劑盒）： 97400kD、66200kD、43000kD、 31000kD、20100kD、14400kD。 采用不連續(xù)SDS-PAGE電泳法對(duì)所分離純化的蛋白質(zhì)進(jìn)行純度鑒定，發(fā)現(xiàn)圖中電泳圖譜可以清晰的看到兩條蛋白帶,兩條蛋白帶代表綿羊免疫球蛋白G的重鏈和輕鏈。 計(jì)算分析結(jié)果表明： 綿羊

11、血清lgG重鏈和輕鏈的分子量分別為50000和28000Kd。一般說來，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在200000至15000 kD 之間時(shí)，電泳遷移率與分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系 。實(shí)驗(yàn)結(jié)果各譜帶所代表的成分的分子量的范圍均在此之間。用SDS-PAGE垂直板電泳測(cè)得綿羊血清具有一定的可信度,七、思考題,在不連續(xù)體系SDS-PAGE中,當(dāng)分離膠加完后,需在其上加一層水,為什么? 在不連續(xù)體系SDS-PAGE中,分離膠與濃縮膠中均含有TEMED和AP,試述其作用? 樣品液為何在加樣前需在沸水中加熱幾分鐘,十二、達(dá)到預(yù)期目標(biāo) 1. SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳技術(shù)是動(dòng)物生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)教學(xué)中一個(gè)綜合性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目， 且是一個(gè)較高水平的一個(gè)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目,蛋白質(zhì)鹽析沉淀提取 凝膠層析分離（上年基金項(xiàng)目已完成） DEAE-纖維素分離提純蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)分子量測(cè)定、生物分子純度鑒定等綜合項(xiàng)目（五個(gè)單項(xiàng)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目,2. 該項(xiàng)目的完成對(duì)我們課程的建設(shè)起到了促進(jìn)發(fā)展的作用，達(dá)到了我們預(yù)期目標(biāo),3. 該實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的開設(shè)，使學(xué)生掌握了利用聚丙稀酰胺凝膠電泳技術(shù)分離蛋白質(zhì) 、SDSPAGE測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的基