微生物的生長簡

1、第七章：微生物的生長繁殖及其控制（3學(xué)時(shí),通過本章的學(xué)習(xí)，要求掌握： 1、微生物生長量的測定方式。 2、細(xì)菌純培養(yǎng)生長曲線各個(gè)時(shí)期的主要特點(diǎn)。 3、物理、化學(xué)手段用于控制微生物生長的方法及原理。 重點(diǎn)： 細(xì)菌純培養(yǎng)生長曲線。 難點(diǎn)： 如何利用細(xì)菌純培養(yǎng)生長曲線的對(duì)數(shù)生長期來計(jì)算細(xì)菌的代時(shí)和代數(shù),第一節(jié) 微生物生長的測定,第二節(jié) 細(xì)菌的群體生長繁殖,第三節(jié) 微生物生長繁殖的控制,微生物生長的概念（與動(dòng)植物生長概念的差別） 微生物生長的常規(guī)測定方法（原理和操作,細(xì)菌生長繁殖的規(guī)律（標(biāo)準(zhǔn)生長曲線） 及控制技術(shù)（連續(xù)培養(yǎng)的概念與方法,各種物理、化學(xué)因素對(duì)微生物生長的影響（方法原理,二. 以數(shù)量變化對(duì)微

2、生物生長情況進(jìn)行測定,三. 以生物量為指標(biāo)測定微生物的生長,一. 微生物生長概述,要求：掌握微生物生長的概念及常規(guī)測定方法 （原理和操作,第一節(jié) 微生物生長的測定,生長growth：有機(jī)體的細(xì)胞組分與結(jié)構(gòu)在量方面的增加。 表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)的量不斷增加，體積加大。 繁殖reproduction由于細(xì)胞分裂而引起的個(gè)體數(shù)目的增加。 單細(xì)胞微生物如細(xì)菌，生長往往伴隨著細(xì)胞數(shù)目的增加。 多細(xì)胞微生物（如某些霉菌）細(xì)胞數(shù)目的增加（菌絲細(xì)胞的不斷延長或分裂）如不伴隨著個(gè)體數(shù)目的增加，只能叫生長。只有通過形成無性孢子或有性孢子使得個(gè)體數(shù)目增加的過程才叫做繁殖,一般情況下，當(dāng)環(huán)境條件適合時(shí)，生長與繁殖始終是交替進(jìn)

3、行的。從生長到繁殖是一個(gè)由量變到質(zhì)變的過程，這個(gè)過程就是發(fā)育development,一. 微生物生長概述,微生物在自然界總是混雜地生活在一起，要想研究某一種微生物，必須把研究對(duì)象從混雜群體中分離出來,獲得純培養(yǎng)的方法 稀釋倒平板法pour plate method 涂布平板法spread plate method 平板劃線分離法streak plate method 利用選擇培養(yǎng)基分離 單細(xì)胞（單孢子）分離法,純培養(yǎng)技術(shù),純培養(yǎng)(pure culture)微生物學(xué)中把從一個(gè)細(xì)胞或一群相同的細(xì)胞經(jīng)過培養(yǎng)繁殖而得到的后代,稱純培養(yǎng),1、稀釋倒平板法,2、涂布平板法,操作較麻煩，對(duì) 好氧菌、熱敏感

4、菌效果不好,使用較多的常規(guī) 方法，但有時(shí)涂 布不均勻,3、平板劃線分離法（Streak Plate,特點(diǎn)：快速、方便。 分區(qū)劃線（適用于濃度較大的樣品） 連續(xù)劃線（適用于濃度較小的樣品,4、選擇培養(yǎng)分離,抑制大多數(shù)其它微生物的生長，使待分離的微生物生長更快, 數(shù)量上升,直接挑取待分離的微生物的菌落獲得純培養(yǎng),為了從混雜的微生物群體中分離出某種微生物，可以根據(jù)該微生物的特點(diǎn)，包括營養(yǎng)、生理、生長條件等，采用選擇培養(yǎng)的方法進(jìn)行分離,利用選擇培養(yǎng)基進(jìn)行直接分離 富集培養(yǎng),利用選擇培養(yǎng)基分離 根據(jù)所要分離的菌種的特性選用培養(yǎng)基： 分離真菌用馬丁氏培養(yǎng)基，pH偏酸； 分離放線菌用高氏1號(hào)，pH中性偏堿。

5、 根據(jù)不同菌對(duì)化學(xué)試劑的敏感性： 分離放線菌，培養(yǎng)基中加10%酚，抑制細(xì)菌、真菌； 從土壤中分離真菌，加鏈霉素，抑制細(xì)菌生長。 根據(jù)分離對(duì)象的營養(yǎng)特征： 分離能發(fā)酵纖維素的菌株，培養(yǎng)基以纖維素為唯一碳源。 分離固氮菌，用無氮培養(yǎng)基,5、單細(xì)胞（單孢子）分離法,采用顯微分離法在顯微鏡下從混雜群體中直接分離單個(gè)細(xì)胞或單個(gè)個(gè)體進(jìn)行培養(yǎng)以獲得純培養(yǎng)。 毛細(xì)管法：用毛細(xì)管提取微生物個(gè)體，適于較大微生物 顯微操作儀：用顯微針、鉤、環(huán)等挑取單個(gè)細(xì)胞或孢子 小液滴法：將經(jīng)過適當(dāng)稀釋后的樣品制成小液滴，在顯微鏡下選取只含一個(gè)細(xì)胞的液滴來進(jìn)行純培養(yǎng)物的分離,第一節(jié) 微生物生長的測定,二. 以數(shù)量變化對(duì)微生物生長情

6、況進(jìn)行測定,1、培養(yǎng)平板計(jì)數(shù)法,2、膜過濾培養(yǎng)法,3、顯微鏡直接計(jì)數(shù)法,三. 以生物量為指標(biāo)測定微生物的生長,1、比濁法,2、重量法,3、 生理指標(biāo)法,在微生物學(xué)中提到的“生長”，一般均指群體生長,1、培養(yǎng)平板計(jì)數(shù)法,二. 以數(shù)量變化對(duì)微生物生長情況進(jìn)行測定,測定微生物的活菌數(shù)viable count 稀釋平板測數(shù)法dilute plate count 以CFU(colony forming units)表示,稀釋培養(yǎng)測數(shù)法（又稱最大概率法，MPN most probable number）（參見實(shí)驗(yàn)教材,2、膜過濾培養(yǎng)法測定含菌較少的空氣和水中的微生物數(shù)目,水中的細(xì)菌總數(shù)：124個(gè)/100

7、ml,將定量的樣品通過濾膜過濾，菌體被阻留在濾膜上，取下濾膜進(jìn)行培養(yǎng)，然后計(jì)算菌落數(shù)，可求出樣品中所含菌數(shù),菌數(shù)低的樣品（如水） 膜過濾 培養(yǎng) 菌落計(jì)數(shù),二）以數(shù)量變化對(duì)微生物生長情況進(jìn)行測定,3、顯微鏡 直接計(jì)數(shù)法,采用細(xì)菌計(jì)數(shù)板或血球計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下對(duì)微生物數(shù)量進(jìn)行直接計(jì)數(shù)（計(jì)算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量,缺點(diǎn)： 不能區(qū)分死菌與活菌； 不適于對(duì)運(yùn)動(dòng)細(xì)菌的計(jì)數(shù)； 需要相對(duì)高的細(xì)菌濃度； 個(gè)體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察,三. 以生物量為指標(biāo)測定微生物的生長,1、比濁法 在一定范圍內(nèi)，菌懸液中的細(xì)胞濃度與混濁度成正比，即與光密度成正比，菌數(shù)越多，光密度越大。因此，在一定波長下測定菌懸液的光密

8、度，就可反映菌液的濃度,2、重量法 細(xì)胞干重測定：單位體積的培養(yǎng)液中的微生物細(xì)胞的干重,3、 生理指標(biāo)法 總氮量：用化學(xué)分析方法測出微生物細(xì)胞中蛋白質(zhì)或氮元素的含量。 DNA含量：用熒光法測定微生物細(xì)胞中DNA含量。 代謝活性：根據(jù)微生物生命活動(dòng)的強(qiáng)度來估算生物量。 如單位體積培養(yǎng)物在單位時(shí)間內(nèi)的O2消耗、糖消耗或產(chǎn)酸產(chǎn)CO2量等,特點(diǎn)：快速、簡便；但易受干擾,細(xì)菌生長繁殖的規(guī)律（標(biāo)準(zhǔn)生長曲線） 及控制技術(shù)（連續(xù)培養(yǎng)的概念與方法,第二節(jié) 細(xì)菌的群體生長繁殖,一、生長曲線,一條典型的生長曲線至少可以分為 遲緩期，對(duì)數(shù)期，穩(wěn)定期和衰亡期等四個(gè)生長時(shí)期,遲緩期lag phase （滯留適應(yīng)期） 菌種

9、初接入新鮮培養(yǎng)液內(nèi)，微生物細(xì)胞需要通過自身生理機(jī)能的調(diào)節(jié)逐步適應(yīng)新環(huán)境。表現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)量不增加了但細(xì)胞個(gè)體體積增大，代謝活躍,菌種 ： 繁殖速度較快的菌種的延遲期一般較短 菌齡 ： 用對(duì)數(shù)生長期的菌種接種時(shí)，其延遲期較短，甚至檢查不到延遲期 接種量：一般 接種量增大可縮短甚至消除延遲期（發(fā)酵工業(yè)上一般采用1/10的接種量） 培養(yǎng)基成分： 在營養(yǎng)成分豐富的天然培養(yǎng)基上生長的延滯期比在合成培養(yǎng)基上生長時(shí)短； 接種后培養(yǎng)基成分有較大變化時(shí)，會(huì)使延滯期加長，所以發(fā)酵工業(yè)上盡量使發(fā)酵培養(yǎng)基的成分與種子培養(yǎng)基接近,影響延遲期長短的因素,認(rèn)識(shí)延遲期的特點(diǎn)及原因?qū)?shí)踐的指導(dǎo)意義,在發(fā)酵工業(yè)上需設(shè)法盡量縮短延遲期

10、； 采取的縮短lag phase 的措施有： 增加接種量； （群體優(yōu)勢-適應(yīng)性增強(qiáng)） 采用對(duì)數(shù)生長期的健壯菌種； 調(diào)整培養(yǎng)基的成分，在種子基中加入發(fā)酵培養(yǎng)基的某些成分。 選用繁殖快的菌種 在食品工業(yè)上，盡量在此期進(jìn)行消毒或滅菌,對(duì)數(shù)期logarithmic growth phase 細(xì)菌生長旺盛，代謝活力強(qiáng)。分裂速度快，菌數(shù)以指數(shù)級(jí)數(shù)增加，代時(shí)穩(wěn)定,應(yīng)用意義： 由于此時(shí)期的菌種比較健壯，生產(chǎn)上用作接種的最佳菌齡； 發(fā)酵工業(yè)上盡量延長該期，以達(dá)到較高的菌體密度 食品工業(yè)上盡量使有害微生物不能進(jìn)入此期 是生理代謝及遺傳研究或進(jìn)行染色、形態(tài)觀察等的良好材料,在對(duì)數(shù)生長期內(nèi)，細(xì)菌數(shù)目的增加是按指數(shù)級(jí)數(shù)

11、增加的，即 20 2 1 22 23 2n 這里的指數(shù) n 為細(xì)菌分裂的次數(shù)或者增殖的代數(shù)，也就是一個(gè)細(xì)菌繁殖n代產(chǎn)生2n 個(gè)細(xì)菌。 如果在對(duì)數(shù)期開始時(shí)間 t1的菌數(shù)為 x1 ，繁殖 n 代后到對(duì)數(shù)期后期t2的菌數(shù)為 x2，則 代時(shí)(Generation time，G) （即每增加一代所需要的時(shí)間） G=（t2 - t1）/n 先求代數(shù)n 由于x2 = x1 2n lgx2 = lgx1 + nlg2 ； n=（lgx2 - lgx1）/lg2 n = 3.3 lg (x2 /x1 ) G =（t2 - t1 ）/3.3 lg (x2 /x1,例如：在一細(xì)菌培養(yǎng)液中第一次測得的細(xì)菌數(shù)為 104

12、 /ml，經(jīng)過培養(yǎng) 4 h后，又測得菌液中的細(xì)菌數(shù)為 108 /ml，求此菌的世代時(shí)間和在此時(shí)間內(nèi)繁殖的代數(shù)。 根據(jù)公式：G = （t2 - t1 ）/3.3 lg (x2 /x1) t2 - t1 = （4 - 0） 60 min = 240 min x2 = 108 x1 = 104 lg(x2 /x1 ) = lg108 lg104 = 8 - 4 = 4 代入上式 G = 240/3.3 4 = 240/13.2 = 18 min 即在上述培養(yǎng)液中，世代時(shí)間為 18 min。 細(xì)菌繁殖代數(shù) n = (t2 - t1)/G = 240/18 = 13.3 繁代,穩(wěn)定期(stationar

13、y phase) 又稱恒定期或最高生長期。處于穩(wěn)定期的微生物，新增殖的細(xì)胞數(shù)與老細(xì)胞的死亡數(shù)幾乎相等，整個(gè)培養(yǎng)物中二者處于動(dòng)態(tài)平衡，此時(shí)生長速度，又逐漸趨向零。 在一定容積的培養(yǎng)基中，細(xì)菌為什么不能按對(duì)數(shù)期的高速率無限生長呢? 這是由于對(duì)數(shù)期細(xì)菌活躍生長引起周圍環(huán)境條件條件發(fā)生了一系列變化，某些營養(yǎng)物質(zhì)消耗，有害代謝產(chǎn)物的積累，以及諸如pH、氧化還原電位、溫度等的改變，限制了菌體細(xì)胞繼續(xù)以高速度進(jìn)行生長和分裂,穩(wěn)定期的細(xì)胞內(nèi)開始積累貯藏物，如肝糖、異染顆粒、脂肪粒等，大多數(shù)芽孢細(xì)菌也在此階段形成芽孢。如果為了獲得大量菌體，就應(yīng)在此階段收獲，因這時(shí)細(xì)胞總數(shù)量最高。 這一時(shí)期也是發(fā)酵過程積累代謝產(chǎn)

14、物的重要階段，某些放線菌抗生素的大量形成也在此時(shí)期。 穩(wěn)定期的微生物，在數(shù)量上達(dá)到了最高水平，對(duì)于發(fā)酵生產(chǎn)來說，一般在穩(wěn)定期的后期產(chǎn)物積累達(dá)到高峰，是最佳的收獲時(shí)期,應(yīng)用意義： 1）發(fā)酵生產(chǎn)形成的重要時(shí)期（抗生素、氨基酸等），生產(chǎn)上應(yīng)盡量延長此期，提高產(chǎn)量，措施如下： 補(bǔ)充營養(yǎng)物質(zhì)（補(bǔ)料） 調(diào)pH 調(diào)整溫度 2）穩(wěn)定期細(xì)胞數(shù)目及產(chǎn)物積累達(dá)到最高,衰亡期(decline phase) 細(xì)菌死亡率逐漸增加，群體中活菌數(shù)目急劇下降，出現(xiàn)了“負(fù)生長”。其中有一段時(shí)間，活菌數(shù)呈幾何級(jí)數(shù)下降，故有人稱之為“對(duì)數(shù)死亡階段”。 這一階段的細(xì)胞，有的開始自溶，產(chǎn)生或釋放出一些產(chǎn)物，如氨基酸、轉(zhuǎn)化酶、外肽酶或抗生

15、素等。菌體細(xì)胞也呈現(xiàn)多種形態(tài)，有時(shí)產(chǎn)生畸形，細(xì)胞大小懸殊，有的細(xì)胞內(nèi)多液泡，革蘭氏染色反應(yīng)的陽性菌變成陰性反應(yīng)等,不是所有細(xì)胞均處于完全相同的生理狀態(tài)，因此，在細(xì)菌生長的整個(gè)周期，細(xì)菌數(shù)和培養(yǎng)時(shí)間，往往是一條緩慢上升以后又逐漸下降的曲線。 認(rèn)識(shí)和掌握細(xì)菌生長曲線，對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)的指導(dǎo)意義： 1）計(jì)算生長速率和代時(shí)； 2）不同生長期的細(xì)胞在結(jié)構(gòu)和生理上可能有很大差別，了解生長曲線，就能根據(jù)需要進(jìn)取樣和收獲； 3）不同的生長期理化因子對(duì)微生物的影響可能不同。對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞較為一致，因此常用于研究細(xì)胞的新陳代謝,三、連續(xù)培養(yǎng)（continuous culture,分批培養(yǎng)（batch culture）

16、 ：將微生物置于一定容積的定量的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基一次性加入。不再補(bǔ)充和更換，最后一次性收獲。 連續(xù)培養(yǎng)（continuous culture） ：在微生物培養(yǎng)的過程中，不斷供給新鮮的營養(yǎng)液，同時(shí)排除含菌體及代謝產(chǎn)物的發(fā)酵液，讓培養(yǎng)的微生物長時(shí)間地處于對(duì)數(shù)生長期。 連續(xù)培養(yǎng)理論基礎(chǔ)：基于對(duì)典型生長曲線中穩(wěn)定期形成原因的認(rèn)識(shí)，采取相應(yīng)有效措施推遲其來臨，從而發(fā)展出連續(xù)培養(yǎng)技術(shù),原理：當(dāng)微生物在單批培養(yǎng)方式下生長達(dá)到對(duì)數(shù)期后期時(shí)，一方面以一定的速度流進(jìn)新鮮培養(yǎng)基并攪拌，另一方面以溢流方式流出培養(yǎng)液，使培養(yǎng)物達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，其中的微生物就能長期保持對(duì)數(shù)期的平衡生長狀態(tài)和穩(wěn)定的生長速率,連續(xù)培養(yǎng)原理,

17、概念：通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基流速，使培養(yǎng)液濁度保持恒定的連續(xù)培養(yǎng)方法。 原理：調(diào)節(jié)新鮮培養(yǎng)基流入的速度和培養(yǎng)物流出的速度來維持菌濃度不變, 即濁度不變。采用光電裝置檢測培養(yǎng)容器中的濁度，當(dāng)濁度高時(shí)，使新鮮培養(yǎng)基的流速加快，濁度降低，則減慢培養(yǎng)基的流速。 特點(diǎn)：基質(zhì)過量，微生物始終以最高速率進(jìn)行生長；但工藝復(fù)雜，煩瑣,連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)恒濁連續(xù)培養(yǎng),使用范圍：用于生產(chǎn)大量菌體、生產(chǎn)與菌體生長相平行的某些代謝產(chǎn)物，如乳酸、乙醇等,連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)恒化連續(xù)培養(yǎng),概念：以恒定流速使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)濃度恒定并保持細(xì)菌生長速率恒定，使微生物始終在低于其最高生長速率下進(jìn)行生長繁殖的方法。 原理：通過控制某一種營養(yǎng)物濃度（如碳、氮源、

18、生長因子等） ，使其始終成為生長限制因子，而達(dá)到控制培養(yǎng)液流速保持不變，細(xì)菌的生長速率將取決于限制性因子的濃度。 特點(diǎn)：維持營養(yǎng)成分的亞適量，控制微生物生長速率。菌體生長速率恒定，菌體均一、密度穩(wěn)定，產(chǎn)量低于最高菌體產(chǎn)量。 應(yīng)用范圍：實(shí)驗(yàn)室科學(xué)研究,恒濁器恒化器的比較,連續(xù)發(fā)酵（continuous fermentation,連續(xù)培養(yǎng)在生產(chǎn)上的應(yīng)用，相對(duì)于單批發(fā)酵而言。 優(yōu)點(diǎn)： 缺點(diǎn)： 連續(xù)發(fā)酵的生產(chǎn)時(shí)間受以上因素限制，一般只能維持?jǐn)?shù)月 1年,縮短發(fā)酵周期，提高設(shè)備利用率； 便于自動(dòng)控制； 降低動(dòng)力消耗及體力勞動(dòng)強(qiáng)度； 產(chǎn)品質(zhì)量較穩(wěn)定,雜菌污染 菌種退化 營養(yǎng)物利用率低于單批培養(yǎng),在分批培養(yǎng)中

19、，各個(gè)細(xì)胞的生理狀態(tài)、代謝活動(dòng)并不完全一樣。為了解決這一問題，就必須設(shè)法使群體處于同一發(fā)育階段，使群體和個(gè)體行為變得一致，因而發(fā)展了單細(xì)胞的同步培養(yǎng)技術(shù)。 同步培養(yǎng)法synchronous culture ：能使培養(yǎng)的微生物處于比較一致的生長發(fā)育階段上的培養(yǎng)方法。 同步生長的概念：一個(gè)細(xì)胞群體中各個(gè)細(xì)胞都在同一時(shí)間進(jìn)行分裂的狀態(tài)，稱為同步生長（synchronous growth） ，進(jìn)行同步分裂的細(xì)胞稱為同步細(xì)胞。 同步細(xì)胞群體在任何一時(shí)刻都處在細(xì)胞周期的同一相，彼此間形態(tài)、生化特征都很一致，因而是細(xì)胞學(xué)、生理學(xué)和生物化學(xué)等研究的良好材料,四、同步培養(yǎng),獲得同步生長的方法,獲得同步生長的方法

20、主要有兩類： 環(huán)境條件誘導(dǎo)法：變換溫度、光線、培養(yǎng)基等，造成與正常細(xì)胞周期不同的周期變化。 選擇法：選擇性過濾、梯度離心。物理方法，隨機(jī)選擇，不影響細(xì)胞代謝,機(jī)械法又稱選擇法 微生物的子細(xì)胞與成熟細(xì)胞，通過機(jī)械法就可使它們在一定程度上分開來。然后用同樣大小的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)便可獲得同步培養(yǎng)物。 離心沉降分離法 過濾分離法 硝酸纖維薄膜法,機(jī)械法同步培養(yǎng)物是在不影響細(xì)菌代謝的情況下獲得的，因而菌體的生命活必然較為正常。 局限性：有些微生物即使在相同的發(fā)育階段，個(gè)體大小也不一致，甚至差別很大，這樣的微生物不宜采用這類方法,Helmstetter-Cummings 法,原理：一些細(xì)菌細(xì)胞會(huì)緊緊粘附于硝酸

21、纖維微孔濾膜上。 步驟：菌懸液通過微孔濾膜，細(xì)胞吸附其上；反置濾膜，以新鮮培養(yǎng)液通過濾膜，洗掉浮游細(xì)胞；除去起始洗脫液后就可以得到剛剛分裂下來的新生細(xì)胞，即為同步培養(yǎng),調(diào)整生理?xiàng)l件的同步法（誘導(dǎo)法） 溫度調(diào)整法 將微生物的培養(yǎng)溫度控制在亞適溫度條件下一段時(shí)間，使細(xì)胞的生長在分裂前不久的階段稍微受到抑制，然后將培養(yǎng)溫度提高或降低到最適生長溫度，大多數(shù)細(xì)胞就會(huì)進(jìn)行同步分裂。 營養(yǎng)條件調(diào)整法 即控制營養(yǎng)物的濃度或培養(yǎng)基的組成以達(dá)到同步生長。例如限制碳源或其他營養(yǎng)物，使細(xì)胞只能一次分裂而不能繼續(xù)生長，從而獲得了剛分裂的細(xì)胞群體，然后再轉(zhuǎn)入適宜的培養(yǎng)基中，它們例進(jìn)入了同步生長。 用最高穩(wěn)定期的培養(yǎng)物接種

22、 抑制DNA合成法 利用代謝抑制劑阻礙DNA合成相當(dāng)一段時(shí)間，然后再解除其抑制，也可達(dá)到同步化的目的。試驗(yàn)證明：氨甲蝶呤、5-氟脫氧尿苷、羥基尿素、胸腺苷、脫氧腺苷和脫氧鳥苷等，對(duì)細(xì)胞DNA合成的同步化均有作用,機(jī)械法對(duì)細(xì)胞正常生理代謝影響很少；而誘導(dǎo)同步分裂雖然方法多，應(yīng)用廣，但對(duì)正常代謝有時(shí)有影響，而且對(duì)其誘導(dǎo)同步化的生化基礎(chǔ)了解很少。 必須根據(jù)待試微生物的形態(tài)、生理性狀來選擇適當(dāng)?shù)姆椒ā?同步生長的時(shí)間，因菌種和條件而變化，由于同步群體的個(gè)體差異，同步生長不能無限地維持，往往會(huì)逐漸破壞，最多能維持23個(gè)世代，又逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)殡S機(jī)生長，即非同步化,第三節(jié) 真菌的生長,一、菌絲的生長繁殖,菌絲的

23、生長是頂端生長，菌絲各個(gè)部分都有極性之分，即位于前端的為幼齡菌絲，位于后面的為老齡菌絲。 菌絲生長與營養(yǎng)有關(guān)，營養(yǎng)豐富則分支點(diǎn)與菌絲生長頂端的距離短，即分支多而頻繁；營養(yǎng)貧乏分支點(diǎn)同菌絲生長頂端距離長，即分支少。菌絲在固體培養(yǎng)基或在液體培養(yǎng)中靜止培養(yǎng)時(shí)形成菌落，在液體培養(yǎng)中振蕩培養(yǎng)時(shí)則形成菌絲球,二、孢子生長,無性孢子繁殖 孢子的生長包括: 孢子腫脹（外源腫脹，不需營養(yǎng)；內(nèi)源腫脹，需要營養(yǎng)） 萌發(fā)管形成 菌絲生長,有性孢子繁殖 第一階段是質(zhì)配（plasmogamy） 第二階段為核配（karyogamy） 第三階段是減數(shù)分裂（meiosis,絲狀微生物的群體生長,絲狀微生物的純培養(yǎng)采用孢子接種，

24、在液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)或深層通氣加攪拌培養(yǎng)，菌絲體通過斷裂繁殖不形成產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)?？梢杂镁z干重作為衡量生長的指標(biāo)，即以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以菌絲干重為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線,可分為三個(gè)階段： 1、生長停滯期 2、迅速生長期 3、衰退期,1、生長停滯期: 造成生長停滯的原因一是孢子萌發(fā)前真正的停滯狀態(tài)，另一種是生長已經(jīng)開始，但還無法測定。 2、迅速生長期:菌絲體干重迅速增加，其立方根與時(shí)間呈直線關(guān)系，菌絲干重不以幾何級(jí)數(shù)增加，沒有對(duì)數(shù)生長期。生長主要表現(xiàn)在菌絲尖端的伸長和出現(xiàn)分支、斷裂等，此時(shí)期的菌體呼吸強(qiáng)度達(dá)到高峰，有的開始積累代謝產(chǎn)物。 3、衰退期:菌絲體干重下降，到一定時(shí)期不再變化。大多數(shù)次級(jí)代謝產(chǎn)

25、物在此期合成，大多數(shù)細(xì)胞都出現(xiàn)大的空泡。有些菌絲體還會(huì)發(fā)生自溶菌絲體，這與菌種和培養(yǎng)條件有關(guān),絲狀微生物的群體生長,第四節(jié) 微生物生長繁殖的控制,控制（有害）微生物的生長速率或消滅不需要的微生物， 在實(shí)際應(yīng)用中具有重要的意義,抑制(Inhibition)：生長停止，但不死亡,死亡(Death)：生長能力不可逆喪失,防腐(Antisepsis)：防止或抑制霉腐微生物在食品等物質(zhì)上的生長,化療(Chemotherapy)：殺死或抑制宿主體內(nèi)的病原微生物,消毒(Disinfection)：殺死或滅活病原微生物（營養(yǎng)體細(xì)胞,滅菌(Sterilization)：殺死包括芽孢在內(nèi)的所有微生物,防腐anti

26、sepsis 一種抑菌作用，利用某些理化因子，使物體內(nèi)外的微生物暫時(shí)處于不生長繁殖但又未死亡的狀態(tài)。這是一種防止食品腐敗和其他物質(zhì)霉變的技術(shù)措施。如低溫、干燥、鹽腌、糖漬等等。 消毒disinfection 是指殺死或消除所有病原微生物的措施，可達(dá)到防止傳染病傳播的目的。例如將物體煮沸10 min，就可殺死病原菌的營養(yǎng)體，但絕非殺死所有的芽孢，常用于牛奶、食品以及某些物體表面的消毒。利用消毒劑（disinfectant），也可進(jìn)行皮膚、體膜或體內(nèi)的處理,滅菌sterilization 是指用物理或化學(xué)因子，殺滅物體中的所有活微生物，包括最耐熱的細(xì)菌芽孢。這是一種徹底的殺菌措施。通過滅菌的物品不

27、再存在任何有生命的有機(jī)體。 化學(xué)治療chemotherapy 是指利用某些具有選擇毒性的化學(xué)藥物(如磺胺)或抗生素，對(duì)生物體的深部感染進(jìn)行治療，可以有效地消除宿主體內(nèi)的病原體，但對(duì)宿主卻沒有或基本上沒有損害,一、控制微生物的化學(xué)物質(zhì),化學(xué)物質(zhì)的抗微 生物能力的測定,液體培養(yǎng)法,最低抑制濃度（minimum inhibitory Concentration （MIC）實(shí)驗(yàn),平板培養(yǎng)法,抑菌圈（zone of inhibition）試驗(yàn),微生物生長繁殖的控制,一、控制微生物的化學(xué)物質(zhì),抗微生物劑,抑菌,抑菌劑(Bacteriostatic agent,殺菌,殺菌劑(Bactericide,溶菌劑(

28、Bacteriolysis,待測化學(xué)物質(zhì) 對(duì)數(shù)生長培養(yǎng)物 定時(shí)測定總菌數(shù)和活菌數(shù),常用的消毒防腐劑及其應(yīng)用,常用的消毒防腐劑及其應(yīng)用,一）抗代謝類藥物（生長因子類似物,概念：有些化合物在結(jié)構(gòu)上與生物體所必需的代謝物很相似，以致于可以和特定的酶結(jié)合，從而阻礙酶的功能，干擾代謝的正常進(jìn)行，這些物質(zhì)叫抗代謝物，用于疾病治療，稱抗代謝類藥物，如：磺胺類藥物。 機(jī)理：作為細(xì)菌細(xì)胞基本生長因子的競爭性抑制劑（與相應(yīng)酶競爭性結(jié)合）而阻止微生物對(duì)生長因子的利用，因而可以抑制微生物的生長。只有當(dāng)正常代謝產(chǎn)物的量少或不存在時(shí)，抗代謝物才有用。 種類： 磺胺藥對(duì)氨基本甲酸 ； 6 - 巰基嘌呤嘌呤； 5 - 甲基色

29、氨酸氨基酸； 異煙肼吡哆醇,上次課知識(shí)點(diǎn)回顧,1、微生物生長量的測定 2、細(xì)菌純培養(yǎng)生長曲線 3、分批培養(yǎng)與連續(xù)培養(yǎng)（恒化法與恒濁法） 4、微生物生長的控制,第三節(jié) 微生物生長繁殖的控制,一、控制微生物的化學(xué)物質(zhì),抗微生物劑,非選擇性 （對(duì)所有細(xì)胞均有毒性,有選擇性 （對(duì)病原微生物毒性更強(qiáng),消毒劑(Disinfectant,防腐劑(Antisepsis,抗代謝藥物,抗生素,中草藥有效成分,化學(xué)治療劑,二.化學(xué)治療劑對(duì)微生物的作用,能直接干擾病原微生物的生長繁殖并可用于治療感染性疾病的化學(xué)藥物。 它能選擇性地作用于病原微生物新陳代謝的某個(gè)環(huán)節(jié)，使其生長受到抑制或致死,抗代謝藥物,抗生素,中草藥有

30、效成分,化學(xué)治療劑 種類,一）抗代謝物,磺胺藥物是最早發(fā)現(xiàn)，也是最常見的化學(xué)治療劑，抗菌譜廣， 能治療多種傳染性疾病,大多數(shù)革蘭氏陽性細(xì)菌（如肺炎球菌、溶血性鏈球菌等） 某些革蘭氏陰性細(xì)菌（如痢疾桿菌、腦膜炎球菌、流感桿菌等） 對(duì)放線菌也有一定的作用,1934年，德國I. G. Farben染料廠的G. Domagk,prontosil在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成了具有抑菌作用的磺胺,G. Domagk因發(fā)明第一種治療微生物疾病的“神藥”獲得了1939年的諾貝爾生理和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng),一種紅色染料（prontosil），白鼠靜脈注射可治療因鏈球菌引起的感染，但在體外卻無作用。1935年，進(jìn)一步證明prontosil對(duì)人

31、的鏈球菌病也有效,二氫蝶啶 + 對(duì)氨基苯甲酸 二氫葉酸 四氫葉酸 磺胺藥 核酸合成,二氫葉酸合成酶,二氫葉酸還原酶,磺胺藥作用機(jī)理,細(xì)菌需要利用對(duì)氨基苯甲酸合成生長所需的葉酸,磺胺對(duì)人體無毒性，因?yàn)槿巳狈膶?duì)氨基苯甲酸合成葉酸的 相關(guān)酶-二氫葉酸合成酶，不能用外界提供的對(duì)氨基苯甲酸自行 合成葉酸，而必須直接利用葉酸為生長因子進(jìn)行生長,磺胺是對(duì)氨基苯甲酸的結(jié)構(gòu)類似物，在一定條件下它們竟?fàn)幮缘嘏c二氫葉酸合成酶結(jié)合，阻止或取代了 PABA進(jìn)入葉酸分子中，從而阻止了葉酸的合成,PABA,抗代謝物與抗代謝類藥物,有些化合物在結(jié)構(gòu)上與生物體所必需的代謝物很相似，以致可以和特定的酶結(jié)合，從而阻礙酶的功能，干

32、擾代謝的正常進(jìn)行，這些物質(zhì)叫抗代謝物，用于疾病治療，稱抗代謝類藥物。 機(jī)理：作為細(xì)菌細(xì)胞基本生長因子的競爭性抑制劑（與相應(yīng)酶競爭性結(jié)合）而阻止微生物對(duì)生長因子的利用，因而可以抑制微生物的生長,二）抗生素,概念：微生物在其生命過程中產(chǎn)生的一類低分子量代謝產(chǎn)物，在很低濃度下就能抑制或殺死其它微生物的生長。 最小抑制濃度（Minimal Inhibitory Concentration, MIC）表示抗生素的抗菌活性，單位是g/ml. 抗菌譜：抗生素的作用范圍。 廣譜抗生素：對(duì)多種微生物有作用（如土霉素、四環(huán)素） 窄譜抗生素：僅對(duì)某一類微生物有作用（如多粘菌素,抗生素的作用機(jī)理,1）作用于細(xì)胞壁 青

33、霉素類、頭孢菌素類、桿菌肽、環(huán)絲氨酸、萬古霉素；多氧霉素 2）干擾細(xì)胞膜功能 多粘菌素、短桿菌素；制霉菌素、兩性霉素；纈氨霉素、莫能菌素；殺螨素。 3）作用于蛋白質(zhì)合成 卡那霉素、鏈霉素、四環(huán)素等主要作用于30S亞基； 氯霉素、林可霉素、紅霉素等則作用于50S亞基。 4）抑制核酸復(fù)制與轉(zhuǎn)錄 絲裂霉素C(自力霉素)、博萊霉素(爭光霉素)、放線菌素D(更生霉素)、蒽環(huán)類； 新生霉素、香豆霉素；喹諾酮類；利福霉素 5）作用于能量代謝系統(tǒng) 抗霉素、寡霉素,微生物的抗藥性： 使抗生素向無活性的形式轉(zhuǎn)化；抗生素作用靶位的修飾； 微生物對(duì)抗生素通透性的改變；主動(dòng)外排系統(tǒng)的產(chǎn)生,二、控制微生物的物理因素,殺滅

34、或抑制微生物的物理因素,溫度 輻射 過濾 滲透壓 干燥 超聲波,一、溫度對(duì)微生物生長的影響,一）微生物生長的溫度類型,低溫型微生物psychrophiles 可分為專性嗜冷和兼性嗜冷兩種。冷藏食物的腐敗往往由這類微生物引起。 分布： 地球兩極 5左右的海洋中 12的海洋深處 冷泉 機(jī)理： 細(xì)胞內(nèi)的酶在低溫下仍能有效地發(fā)揮作用； 細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸含量較高，細(xì)胞膜在低溫下仍保持半流動(dòng)狀態(tài)，從而能進(jìn)行活躍的物質(zhì)代謝,中溫型微生物mesophiles 又可分為室溫性微生物和體溫性微生物。 室溫性微生物 適于2030生長，如土壤微生物、植物病原微生物。主要為腐生或植物寄生，存在植物或土壤中。 體溫性

35、微生物 多為人及溫血?jiǎng)游锏牟≡?，最適生長溫度與其宿主體溫相近，在2540之間，人體寄生菌為37左右,高溫型微生物themophiles 適于在4550以上的溫度中生長，常見類群有Bacillus、Methanobacterium等，常給罐頭工業(yè)、發(fā)酵工業(yè)帶來麻煩。 分布：局限于堆肥、溫泉、火山等。 耐高溫的原因： 菌體內(nèi)的酶和蛋白質(zhì)對(duì)熱更穩(wěn)定； 核糖體和其他成分對(duì)高溫也具較大的抗性； 細(xì)胞膜中飽和脂肪酸含量高，使膜在高溫下能保持其穩(wěn)定性并具正常的功能,不同微生物的致死溫度不同，同一菌種不同菌株或不同菌齡，其抗熱性也可能不同： 一般幼齡的比老齡的對(duì)熱敏感。 一般原核生物能在比真核生物更耐高溫；

36、 非光合微生物能在比光合微生物耐溫； 噬菌體較其宿主細(xì)胞抗熱； 放線菌和霉菌孢子比營養(yǎng)細(xì)胞的抗熱性強(qiáng)； 細(xì)菌芽孢抗熱性最強(qiáng),高溫殺菌 干熱滅菌 焚燒滅菌法 此法滅菌徹底，迅速簡便，但使用范圍有限。常用于接種工具、污染物品以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物尸體等廢棄物的處理。 干熱滅菌法160170處理2 h 主要在干燥箱中利用熱空氣進(jìn)行滅菌, 只適用于玻璃器皿、金屬用具等耐熱物品的滅菌。其優(yōu)點(diǎn)是可保持物品干燥,濕熱滅菌 煮沸消毒法 在水中煮沸15 min以上，可殺死細(xì)菌的所有營養(yǎng)細(xì)胞和部分芽孢。這種方法適用于注射器、解剖用具等的消毒。 高壓蒸汽滅菌法 是實(shí)驗(yàn)室及生產(chǎn)中常用的滅菌方法。加壓則可提供高于100的蒸汽，熱

37、穿透力強(qiáng)，可迅速引起蛋白質(zhì)凝固變性。所以高壓蒸汽滅菌在濕熱滅菌法中效果最佳、應(yīng)用較廣。 一般培養(yǎng)基、各種緩沖溶液、玻璃器皿等，常采用1 kg/cm2 (121) 處理1530 min即可達(dá)到滅菌的目的,間歇滅菌法 常壓下100處理1530 min，以殺死其中的營養(yǎng)細(xì)胞。冷卻后，置于一定溫度(2837)保溫過夜，使其中可能殘存的芽孢萌發(fā)營養(yǎng)細(xì)胞，再以同樣方法加熱處理。如此反復(fù)三次，可殺滅所有芽孢和營養(yǎng)細(xì)胞，以達(dá)到滅菌的目的。 此法的缺點(diǎn)是滅菌比較費(fèi)時(shí)，一般只用于不耐熱的藥品、營養(yǎng)物、特殊培養(yǎng)基等的滅菌。在缺乏高壓蒸汽滅菌設(shè)備時(shí)亦可用于一般物品的滅菌。 巴斯德消毒法 即用較低的溫度處理牛奶、酒類等

38、飲料，以殺死其中的病原菌如結(jié)核桿菌、傷寒桿菌等，但又不損害營養(yǎng)與風(fēng)味。 如用6263則處理30 min，若以71，只需15 min。處理后的物品應(yīng)迅速冷卻至10左右即可飲用。這種方法只能殺死大多數(shù)腐生菌的營養(yǎng)體而對(duì)芽孢無損害。此法是基于結(jié)核桿菌的致死溫度6215 min而規(guī)定的,微生物的致死溫度 在一定時(shí)間內(nèi)（如 10 min）殺死微生物所需要的最低溫度稱為微生物的致死溫度。 生物的致死時(shí)間 在一定溫度下殺死微生物所需要的最短時(shí)間稱為微生物的致死時(shí)間。溫度愈高，致死時(shí)間愈短。 D 值 decimus value 在特定溫度下使微生物菌數(shù)減少 10 倍所需的時(shí)間,影響膜表面電荷的性質(zhì)及膜的通透性

39、，進(jìn)而影響對(duì)物質(zhì)的吸收能力。 改變酶活、酶促反應(yīng)的速率及代謝途徑 影響培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的吸收或有毒物質(zhì)的毒性,二、pH值與微生物生長的相互影響,一）環(huán)境pH值對(duì)微生物生長的影響,微生物的生長pH值范圍極廣，但是絕大多數(shù)種類都生活在pH5.09.0之間。 細(xì)菌、藻類、原生動(dòng)物最適 pH 為6.57.5 放線菌最適 pH 7.58.0 霉菌、酵母最適 pH 56,二) 不同微生物對(duì)pH要求不同,同一種微生物在其不同的生長階段和不同的生理生化過程中，對(duì)pH值的要求也不同。在發(fā)酵工業(yè)中，控制pH值尤其重要。 微生物 生長最適pH 合成抗生素最適pH 灰色鏈霉菌6.36.96.77.3 紅霉素鏈霉菌6.

40、67.06.87.3 產(chǎn)黃青霉6.57.26.26.8 金霉素鏈霉菌6.16.65.96.3 龜裂鏈霉菌6.06.65.86.1 灰黃青霉6.47.06.26.5,三）生長的最適pH值與發(fā)酵的最適pH值,同一種微生物在不同的生長階段和不同生理生化過程中，對(duì)環(huán)境pH值要求不同。 例如：丙酮丁醇梭菌 在pH值=5.57.0時(shí)，以菌體生長為主 在pH值=4.35.3時(shí)，進(jìn)行丙酮丁醇發(fā)酵 同一種微生物由于環(huán)境pH值不同，可能積累不同的代謝產(chǎn)物。 例如：黑曲霉 pH值=2-2.5時(shí)，有利于合成檸檬酸，只產(chǎn)少量草酸 pH2.5-6.5時(shí)，以菌體生長為主 pH值在7左右時(shí)，合成草酸為主，只產(chǎn)少量檸檬酸,可利

41、用微生物對(duì)pH要求的不同，控制雜菌的污染。 無機(jī)酸如硫酸、鹽酸等殺菌力雖強(qiáng)，但腐蝕性大；某些有機(jī)酸如苯甲酸可用作防腐劑；酸菜、飼料青貯則是利用乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸抑制腐敗性微生物的生長。 強(qiáng)堿可用作殺菌劑，但由于其毒性大，用途局限于對(duì)排泄物及倉庫、棚舍等環(huán)境的消毒。強(qiáng)堿對(duì)G+與病毒比對(duì)G-作用強(qiáng)。結(jié)核分枝桿菌抗堿力特強(qiáng),根據(jù)微生物與氧的關(guān)系,可把它們分為幾種類群: 專性好氧菌 好氧菌 微好氧菌 兼性厭氧菌 耐氧厭氧菌 厭氧菌 專性厭氧菌,三、氧氣對(duì)微生物生長的影響,專性好氧菌（strict aerobe,必須在有分子氧的條件下才能生長,在有氧或無氧條件下均能生長，但有氧情況下生長得更好，在有氧

42、時(shí)靠呼吸產(chǎn)能，無氧時(shí)經(jīng)發(fā)酵或無氧呼吸產(chǎn)能,微好氧菌（microaerophilic bacteria,只能較低的氧分壓下才能正常生長，通過呼吸鏈并以氧為最終氫受體而產(chǎn)能,兼性好氧菌（facultative aerobe,耐氧菌（aerotolerant anaerobe,可在分子氧存在下進(jìn)行厭氧生活的厭氧菌。生活不需要氧，分子氧也對(duì)它無毒害,厭氧菌（anaerobe,分子氧對(duì)它有毒害，短期接觸空氣，也會(huì)抑制其生長甚至致死,在培養(yǎng)不同類型的微生物時(shí)，要采用相應(yīng)的措施保證不同微生物的生長。 培養(yǎng)好氧微生物：需振蕩或通氣，保證充足的氧氣或加入氧化劑提高基質(zhì)中的 Eh 值。 培養(yǎng)專性厭氧微生物：需排除環(huán)境中的氧氣，同時(shí)在培養(yǎng)基中添加還原劑如半胱氨酸、亞硫酸鈉、Na2S 等。 培養(yǎng)兼性厭氧或耐氧微生物：可深層靜止培養(yǎng),四、輻射 輻射：輻射是指通過空氣或