電噴霧質(zhì)譜在非共價蛋白復合物研究中的應用

1、資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。電噴霧質(zhì)譜在非共價蛋白復合物研究中的應用1. 前言質(zhì)譜作為一種分析方法 ,長期以來一直用于小分子化合物的結(jié)構(gòu)分析。直到80 年代末電噴霧電離質(zhì)譜 ( electrospray ionization mass spectrometry,ESI-MS) 和基體輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜( matrix assisted laserdesorptionionizationtime of flightmass spectrometry,MALDI-TOF-MS)兩種”軟電離 ( soft ionization)”質(zhì)譜的出現(xiàn) ,才將質(zhì)譜的分

2、析范圍擴大到生物大分子的結(jié)構(gòu)分析。在生物界,生物分子的非共價特殊作用是分子識別的基礎。因此 ,非共價復合物的檢驗在生物學上是一個重要的研究課題。雖然MALDI-TOF的較高靈敏度和 Mr表征范圍對于測定生物大分子物質(zhì)優(yōu)于ESI質(zhì)譜 ,可是它在檢測非共價復合物的應用上卻受到供試品制備條件的限制1 劉益華 ,徐俊福 . 基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間質(zhì)譜在生物大分子中的應用. 中國生化藥物雜志 . , 25(3): 192-193。而 ESI-MS對蛋白質(zhì)復合物的研究在樣品用量少、快速的情況下可得到可靠的數(shù)據(jù)和較多的信息。由于其具有靈敏度高、快速和質(zhì)量精確度高的優(yōu)點 ,復合物的化學計量比能夠很容易地推導

3、出。經(jīng)過改變源的錐孔 ( cone) 電壓、 改變?nèi)芤旱?pH 值和進樣毛細管溫度 , 能夠比較不同化合物與蛋白質(zhì)的親合力的大小 2 Parmanik BN, Bartner PL, Mirza UA, et al.Electrospray ionization mass spectrometry for the study of non-covalentcomplexes: an emerging technologyJ.J Mass Spectrom ,1998,33(10):911-920。對非共價鍵復合物進行部分酶解或完全酶解,還能夠確定小分子與蛋白質(zhì)的結(jié)合位點 3 MillarAL,

4、 NicholasAC, Jackson NAC, et al.Rapidanalysis of epitope-paratope interactions between HIV-1 and a17-amino-acidneutralizingmicroantibodyby electrosprayionizationmassspectrometryJ.Eur J Biochem ,1998,258(1):164-169.?？梢?, ESI-MS 可廣泛用于研究蛋白質(zhì)非共價鍵復合物。到當前為止,用ESI-MS觀察到的不同的非共資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。價鍵

5、復合物包括蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì) 4Ogorzalekloo RR, GoodlettDR, Smith RD,et al. Observation of a noncovalent ribonuclease S-protein S-peptidecomplex by electrospray ionization mass spectrometryJ,J AM ChemSoc,蛋白質(zhì)-配體 ,1993,115(10):4391-43925 Robinson CV, Chung EW,Kragelend BB, et al. Probingthe nature ofnoncovalentinter

6、actionby massspectrometry. A study of protein-CoA ligand binding and assemblyJ.JAmChemSoc蛋白質(zhì)-寡核苷酸 Light-Wahl KJ,1996,118(36):8646-8653 ,6Springer DL, Winger BE, et al. Observation of a small oligonucleotideduplex by electrospray ionization mass spectrometryJ.J Am Chem Soc,1993,115(2):803-804. 和蛋白質(zhì)-雙

7、鏈 Cheng XH, Morin PE, Harms AC,DNA 7et al. Mass spectrometry characterizationof sequence-specificcomplexesof DNA and transcription factor PU.1 DNA binding domainJ.Analbiochem及蛋白質(zhì)-金屬離子等 ,1996,239(1):35-40.8 Hu P, Loo JA. Gas-phasecoordination properties of Zn2+,Cu2+,Ni 2+, and Co 2+ with histidine-co

8、ntaining peptidesJ.J AM Chem Soc。,1995,117(45):11314-11319.2. 電噴霧質(zhì)譜 ( ESI-MS) 的基本原理及特點其原理是 9,10岳貴花 ,許崇峰 ,卞利萍等 . 電噴霧質(zhì)譜在非共價蛋白復合物研究中的應用 .分析化學學報 , ,16(6):495-502.王紅霞 ,楊松成 . 蛋白質(zhì)非共價復合物的電噴霧質(zhì)譜研究進展. 藥學學報 , ,36(4):315-320.: 在高壓電場下 , 少量的液體在霧化氣的作用下形成溶劑化離子飛向電極 , 在這一過程中 , 受外界條件作用 ( 如逆向干燥氣流 ) , 逐漸脫溶劑化以致最終溶質(zhì)離子從該溶劑化

9、離子中解吸出來形成帶多電荷分子離子進入質(zhì)譜。 電噴霧電離的特點是蛋白質(zhì)等生物分子能產(chǎn)生多電荷離子 , 使質(zhì)荷比降低到多數(shù)質(zhì)譜儀都能夠檢測的范圍 , 因而大大擴大了分子量的分析范圍。 分析物離子的真實分子量能夠根據(jù)質(zhì)荷比及所帶電荷數(shù)計算 , 一般由計算機軟件完成。 電噴霧質(zhì)譜可充許有少量的鹽和緩沖液 , 但鹽和緩沖液的存在會使儀器的靈敏度降低。 電噴霧質(zhì)譜的優(yōu)點是能夠方便地與多種分離技術聯(lián)用 , 如液質(zhì)聯(lián)用和毛細管電泳質(zhì)譜聯(lián)資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。用等。3噴霧質(zhì)譜 ( ESI-MS)在蛋白質(zhì)非共價鍵復合物研究的應用自1991年Ganem11Ganem B,

10、LI YT, Henion JD. Detction noncovalentreceptor-ligand complexes by mass spectrometryJ.J Am Chem Soc,1991,113(16):6249-6296.等最早應用電噴霧質(zhì)譜研究細胞漿中受體蛋白FKBP12及其配體 FK506和rapamycin 的非共價鍵復合物以來 ,該技術被越來越多的學者所應用。有關蛋白質(zhì)配體以及組成蛋白質(zhì)的各亞基間的非共價相互作用的文獻報道很多 , Joseph12Joseph A Loo. Mass Spectrom.ReviewJ ,1997,16:1.列出了近年來 ESIM

11、S在這一領域的研究進展。3.1蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用很多蛋白質(zhì)在體內(nèi)實驗中相互作用很強,而相同蛋白質(zhì)寡聚體或其它形成功能蛋白復合體相互作用很弱。 ESI-MS可能能夠經(jīng)過質(zhì)量的測定對蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)復合體的結(jié)構(gòu)供應直接、 明確的信息。與其它光譜技術相比 , 這種技術有很多優(yōu)勢 , 比如 , 測定余因子依賴蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì)相互作用 84 。4- 草酸丁烯酸酯異構(gòu)體酶四級結(jié)構(gòu)是第一次采用ESI-MS進行分析的寡聚蛋白 86 。根據(jù)分子篩色譜和超速離心,認為 4- 草酸丁烯酸酯異構(gòu)體酶為五倍體87 。X射線衍射和質(zhì)譜明確顯示此蛋白質(zhì)為一個41kDa的六倍體 (86,88)。另一方面 ,四個單點突變4-

12、草酸丁烯酸酯異構(gòu)體酶只能形成單體蛋白質(zhì)離子。這些數(shù)據(jù)說明自然蛋白具有寡聚行為,殘基對保持六倍體結(jié)構(gòu)有重要作用。在 Standing 等研究的基礎上 , 其它研究小組也開始用 ESI-MS分析已知和未知寡聚蛋白質(zhì)復合體的化學計量式。在 proteasome催化蛋白 ( 89,90) , chaperone complex GroEL91, 和各種血色素 92-96 的研究中均得到有趣的結(jié)果。 ESI-MS實驗證明 GroEL由兩個七倍體環(huán)組成 , 并非共價結(jié)合 14亞單元 , 總分子質(zhì)量為 800kDa91 。GroEL在擁有 co-chaperoneGroES的前提下才具有活性。 進一步用 M

13、S研究 GroES可變部分與模型底物 helix D的相互作用 97 。結(jié)合熒光交聯(lián)實驗得到甚至在 GroEL四倍體上也有 GroES及底物蛋白明顯 , 至少式部分結(jié)合的資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。位點。根據(jù) MS研究 , 在大多數(shù)哺乳動物系統(tǒng)中血色素以分子量約為 60kDa的四倍體存在 , 在低濃度下則很可能以二倍體存在。 MS廣泛用于研究血色素的結(jié)構(gòu)。 比如 , 鐮刀紅血球患者組織血液中的血色素 S和胎兒血色素 98 。此研究總結(jié)了鐮刀紅血球病不均勻血色素混合物和其它四聚體的定量測定。 因此 , 血紅素亞基的非共價結(jié)合可用 ESI-MS進行研究。質(zhì)譜顯示患

14、者和胎兒血液均含有包含 2 2、 2兩種雜交體的完整血紅素四倍體。 根據(jù)不均勻血色素雜和物質(zhì)量的測定 , 發(fā)現(xiàn)在患者血液中有一種平均質(zhì)量為 64.6kDa獨特的四倍體標記蛋白。另一個優(yōu)秀的研究顯示 MS可用于甲狀腺傳遞系統(tǒng)寡聚蛋白的分析 99 。四倍體人類蛋白質(zhì) reansthyretin 經(jīng)過與維生素 A結(jié)合蛋白非共價結(jié)合傳遞荷爾蒙甲狀腺素。Transthyretin被認為淀粉纖維的組成成分,并與一些疾病如 Alzheimer s,二型糖尿病和遺傳性海綿狀組織腦病有關。在正常情況下, transthyretin運輸甲狀腺素和維生素 A, 可是天然型展開和單點突變分別導致老年系統(tǒng)淀粉樣變性病和

15、家族淀粉質(zhì)神經(jīng)病。 Transthyretin 四倍體的分裂被認為是形成淀粉狀纖維的第一步 100 。McCammon等用 MS試驗了 18種這一過程的抑制劑 (99) 。測定了這些配體結(jié)合 , 穩(wěn)定四倍體結(jié)構(gòu) , 與transthyretin 復合體相互作用及與自然配體甲狀腺素競爭的能力。經(jīng)過對含有六個蛋白質(zhì)亞基 , 兩個維生素 A分子和兩個合成配體 ( 四個 transthyretin 和兩個維生素 A結(jié)合蛋白 ) 的多面十組分復合物的研究發(fā)現(xiàn)配體的加入不會抑制transthyretin與維生素 A的結(jié)合。甲狀腺素與作為探針的人工合成配體的作用特點則不一樣。研究積極、 消極與無作用機理 ;

16、 并證明人工配基對甲狀腺素的結(jié)合產(chǎn)生消極影響。 Loo等 對 ADH(Alcohol Dehydrogenase) 鋅金屬酶在乙醛、 乙醇互變中的作用進行了研究 , 表明酵母及哺乳動物的 ADHs都是均質(zhì)的 , 在這個過程中 , 僅有 25的殘基參與互變。在ESIMS分析蛋白質(zhì)亞基結(jié)構(gòu)過程中 , 溶液的 pH及離子源的條件都很重要 , 在不同pH值下 , 蛋白質(zhì)以不同數(shù)目的亞基聚集體存在。 這對我們研究蛋白質(zhì)性質(zhì)具有重要意義。 Standing 等 Fitzgerrald M C, Chermushevish I, Standing K G, etal.Acad. Sci. USAJ, 199

17、6,93:6851.采用 ESI-TOF-MS對4OT酶的低聚結(jié)構(gòu)進資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。行分析、 測試 ,結(jié)果表明在溶液中其以六聚體存在,這和以往的X-Ray衍射結(jié)果一致。對SilurusAsotus Roe Lectin(SAL)的ESIMS測定表明SAL的單體分子量為31 750Da, 而沉淀平衡法測定的分子量為95 200Da。由此能夠說明該蛋白質(zhì)在溶液中以三聚體的形式存在。 經(jīng)基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間質(zhì)譜測定驗證了這一推斷 Murayama K, Taka H, Kaga N, et al.Anal. BiochemistryJ,1997,24

18、7:319. 。Lafitte對鈣調(diào)節(jié)蛋白在溶液中及變性條件下的蛋白質(zhì)聚合體的研究與超離心測定結(jié)果一致36LafitteD, Heck A J R, HillT J, et al.Eur.J. BiochemJ. , 1999,261(1): 337.3.2蛋白質(zhì)和配體MS用于配體 - 蛋白質(zhì)非共價作用的研究最初關注于完整亞鐵血紅素 - 肌血球素化合物 40 及完整復合 FK結(jié)合蛋白 ( FLBP) 61, 后者為免疫抑制結(jié)合蛋白 , 可與免疫抑制劑 FK506、 rapamycin 結(jié)合。非共價 ESI-MS能夠測定蛋白質(zhì) - 配體化合物的分子質(zhì)量 , 因此它能夠精確的區(qū)分結(jié)合在同一位點上的

19、兩個接近的相關配體。Ras蛋白結(jié)合 GDP和GTP的研究有力的證明了這一點 73,74 。ras 蛋白為細胞生長調(diào)整蛋白 ; 結(jié)合 GDP后活性喪失。因此 , 研究細胞生長過程對于區(qū)分 GDP-ras蛋白與 GTP-ras蛋白非常重要。根據(jù)分子質(zhì)量的差別 , 以上兩種非共價結(jié)合物很容易經(jīng)過 ESI-MS區(qū)別出來 ( Mw GDP-ras=19295Da; GTP-ras=19375Da) 。ESI-MS 不但可用于確定配體的質(zhì)量及其結(jié)合化學計量,它還可用于估計溶液中不同蛋白質(zhì) - 配體的相對強度 75-77 。楊松成等 王紅霞 ,張學敏 ,楊松成等 .中國科學 ( C 輯 ) , , 32(

20、4) : 355360. 系統(tǒng)地用電噴霧質(zhì)譜研究了重組人受體蛋白 FKBP12(rhFKBP12)和其小分子神經(jīng)生長促進劑配體的非共價鍵相互作用,從 52 個化合物中篩選出 3個有非共價鍵結(jié)合的化合物 000107, 000308 和A2B12,并經(jīng)過競爭實驗測定了它們與rhFKBP12 的結(jié)合位點和相對結(jié)合強度。其中000107 和000308 與rhFKBP12 非共價鍵復合物的 X 晶體衍射結(jié)果與 ESI-MS 的結(jié)果吻合。小分子化合物 000308在雞胚背根神經(jīng)節(jié)無血清培養(yǎng)實驗中有很好的促神經(jīng)生長活性 ,表明 ESI-MS 能夠在分子水平上為新藥篩選提供依據(jù),是很有發(fā)展前途的新方法。資

21、料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。Rostom 等80 發(fā)現(xiàn) 58kDa的外周胞質(zhì)氨基酸受體蛋白 OppA可與 11個不同性質(zhì)的多肽發(fā)生作用。將具有 2, 3 和5個氨基酸殘基的多肽加入到 OppA中。 ESI-MS實驗證明 , OppA 與三肽、 二肽均可形成化合物 , 其中前者的的親和力較大 , 而與五肽或 N-末端乙?；蟮娜臒o法形成化合物。具有單一 D氨基酸殘基的三肽與天然 OppA無法結(jié)合。對氨基酸結(jié)合比例和低能量MS條件下的自由蛋白的分析與液相Kd測定的結(jié)果相似。此研究得到的結(jié)果很好的反映了這一蛋白不論序列可包含細胞二肽和三肽的生理特性。3.3蛋白質(zhì)和金

22、屬金屬離子對酶的催化性及結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性都非常重要,同時對許多蛋白質(zhì)的生物功能也具有重大的作用。 研究金屬離子與蛋白質(zhì)相互作用的方法有許多( 如吸收光譜、 園二色譜、 NMR等 ) 。近年來采用 -./*.研究二者的相互作用也取得了很大進展。結(jié)合金屬離子后 ,根據(jù) ESI-MS測得的蛋白質(zhì)質(zhì)譜的變化可得到直接、準確金屬與蛋白質(zhì)結(jié)合的化學計量數(shù)據(jù)66-68 。等 用ESI-MS估計 Ca2結(jié)合蛋白( calbindin D28k) 的金屬結(jié)合化學計量式 69 。傳統(tǒng)方法認為 calbindin D28k 具有 36個Ca2+結(jié)合位點 70-72 。 ESI-MS最終顯示一個 calbindin D28

23、k 分子可結(jié)合 4個Ca2離子 69 。無 Ca2蛋白質(zhì)和結(jié)合 Ca2后質(zhì)量相差 151Da( 4 38 152) 。Ca2離子的質(zhì)量為 40Da, 而質(zhì)譜得到每增加一個 Ca2質(zhì)量增加 38Da。這是因為 Ca2及二價金屬離子一般在結(jié)合時會替代兩個質(zhì)子 ( 2Da) 。Witkowska Witkowska HE, ShackletonCHL, Dahlman-Wright K, et al.J. AM.Chem. SocJ ., 1995,117:3319研究了糖皮質(zhì)激素受體的DNA結(jié)構(gòu)域與 Zn2+、Ca2+結(jié)合的特性。結(jié)果表明糖皮質(zhì)激素受體含有2個鋅指 ,每 4個半胱氨酸殘基與一個 Z

24、n2作用 ,在CysCysHisCys型鋅指結(jié)構(gòu)中二個巰基各脫去一個質(zhì)子后與Zn2結(jié)合。近年來 ,對鈣調(diào)節(jié)蛋白與金屬離子Ca2, Cd2 的結(jié)合 ,以及鈣調(diào)節(jié)蛋白 - 蜂毒素 - Ca2 的研究證實 ESIMS已逐漸成為探測蛋白質(zhì) - 金屬離子復合物的重要工具之一 Chazin W, Veenstra TD.Rapid Communications In MassSpecJ. , 1999,13(6):548.Veenstra TD, Tomlinson AJ, Benson L. J. Am. Soc.資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。Mass SpectromJ., 1998,9(6):580.3.4蛋白質(zhì)和核苷酸最初 ESI-MS 的研究研究之一是將 ds-DNA與真核 tRNA因子 ( PU1) DNA-結(jié)合位點連接起來 ( 81) 。PU.1-DNA結(jié)合位 ( DBD) 蛋白與天然型目標 DNA序列混合物產(chǎn)生的ESI-MS譜圖僅出現(xiàn) 1