細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)一

1、動(dòng)物細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù),主 要 內(nèi) 容,第一節(jié) 培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞生物學(xué) 第二節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng) 第三節(jié) 顯微鏡知識(shí) 第四節(jié) 細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù),第一節(jié)培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞生物學(xué),主要內(nèi)容,（一）體內(nèi)、外細(xì)胞的差異,（二）體外培養(yǎng)細(xì)胞的分型,（三）培養(yǎng)細(xì)胞的生長和增殖過程,體外培養(yǎng)的細(xì)胞和體內(nèi)細(xì)胞的比較 相似：仍存在細(xì)胞和細(xì)胞、 細(xì)胞和基質(zhì)的相互關(guān)系 單個(gè)細(xì)胞雖能生長繁殖, 但不如群體細(xì)胞能力強(qiáng)， 當(dāng)相鄰細(xì)胞接觸，便導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)停止 細(xì)胞相互溝通生物信息的結(jié)果 對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)仍有依存性 差異：失去原有組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)， 分化減弱或不明顯,細(xì)胞外基質(zhì) 存在于組織中，由細(xì)胞合成并分泌至胞外的成分，分布在細(xì)胞表面或細(xì)胞

2、之間的大分子，包括纖維性成分(膠原蛋白、彈性蛋白和網(wǎng)織蛋白)、連接蛋白(纖維粘連蛋白、層粘連蛋白)和空間充填分子(主要為糖胺聚糖)等，其對(duì)細(xì)胞增殖和分化發(fā)揮重要調(diào)控作用。 這些物質(zhì)構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，支持并連接組織結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)組織的發(fā)生和細(xì)胞的生理活動(dòng)。,1影響細(xì)胞的存活、生長與死亡 正常真核細(xì)胞，大多須粘附于特定的細(xì)胞外基質(zhì)上才能抑制凋亡而存活，稱為定著依賴性（anchorage dependence）。例如，上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞一旦脫離了細(xì)胞外基質(zhì)則會(huì)發(fā)生程序性死亡。,2決定細(xì)胞的形狀 細(xì)胞呈單個(gè)游離狀態(tài)時(shí)多呈球形。 同一種細(xì)胞在不同的細(xì)胞外基質(zhì)上粘附時(shí)可表現(xiàn)出完全不同的形狀。 細(xì)胞外基質(zhì)決定

3、細(xì)胞的形狀這一作用是通過其受體影響細(xì)胞骨架的組裝而實(shí)現(xiàn)的。,3控制細(xì)胞的分化 細(xì)胞通過與特定的細(xì)胞外基質(zhì)成分作用而發(fā)生分化。 例如，成肌細(xì)胞在纖粘連蛋白上增殖并保持未分化的表型；而在層粘連蛋白上則停止增殖，進(jìn)行分化，融合為肌管。,4參與細(xì)胞的遷移 細(xì)胞外基質(zhì)可以控制細(xì)胞遷移的速度與方向，并為細(xì)胞遷移提供“腳手架”。 細(xì)胞的遷移依賴于細(xì)胞的粘附與細(xì)胞骨架的組裝。細(xì)胞粘附于一定的細(xì)胞外基質(zhì)時(shí)誘導(dǎo)粘著斑的形成，粘著斑是聯(lián)系細(xì)胞外基質(zhì)與細(xì)胞骨架“鉚釘”。,（一）體內(nèi)、外細(xì)胞的差異,體內(nèi)：神經(jīng)和體液的調(diào)節(jié)、細(xì)胞間相互影響,體外：缺乏動(dòng)態(tài)平衡的穩(wěn)定環(huán)境,發(fā)生的變化 分化現(xiàn)象減弱 形態(tài)功能趨于單一化 一定時(shí)

4、間后死亡或者轉(zhuǎn)化獲得不死性,體外培養(yǎng)的細(xì)胞仍具有研究的意義 許多性狀仍與體內(nèi)相同 如體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞仍可博動(dòng)， 細(xì)胞在培養(yǎng)中的表現(xiàn)，存在相應(yīng)基因關(guān)閉開啟引起的現(xiàn)象，在培養(yǎng)的細(xì)胞中某些特定功能的喪失，可為該基因的表達(dá)與調(diào)控提供線索。,（二）體外培養(yǎng)細(xì)胞的分型,貼附型：大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞貼附生長，屬于貼壁依賴性細(xì)胞，判斷細(xì)胞形態(tài)時(shí)不能按體內(nèi)組織學(xué)標(biāo)推判定,懸浮型：見于少數(shù)特殊的細(xì)胞，白血病細(xì)胞，骨髓細(xì)胞或免疫細(xì)胞，不需要細(xì)胞間和細(xì)胞與培養(yǎng)表面的接觸 。,貼附型細(xì)胞的分類,成纖維細(xì)胞型,上皮型細(xì)胞,游走細(xì)胞型,多型細(xì)胞型,成纖維細(xì)胞型 梭型或不規(guī)則三角形，生長時(shí)呈放射狀。 除真正的成纖維細(xì)胞外，凡由中

5、胚層間充質(zhì)起源的組織，如心肌、平滑肌、成骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮等常呈本型狀態(tài)。 凡培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維類似時(shí)皆可稱為成纖維細(xì)胞。,上皮型細(xì)胞：,扁平不規(guī)則多角形，彼此緊密相連。生長時(shí)呈膜狀移動(dòng)，細(xì)胞很少單獨(dú)行動(dòng)。,起源于內(nèi)、外胚層的細(xì)胞如皮膚表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形態(tài)。,游走細(xì)胞型： 散在生長，不連成片，呈活躍游走或變形運(yùn)動(dòng)，方向不規(guī)則。 此型細(xì)胞不穩(wěn)定，有時(shí)難以和其他細(xì)胞相區(qū)別。,多型細(xì)胞型： 有一些細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)歸于此類。,（三）培養(yǎng)細(xì)胞的生長和增殖過程,培養(yǎng)細(xì)胞的生命周期,是指細(xì)胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時(shí)間。,種類、供體的年齡等

6、。,人胚成纖維細(xì)胞可傳3050代，約150300個(gè)增殖周期，能維待一年左右，最后衰老凋亡（Apoptosis）。小鼠的胚胎成纖維細(xì)胞僅可傳幾代,供體為成體或衰老個(gè)體，則生存時(shí)間較短；,肝細(xì)胞或腎細(xì)胞，生存時(shí)間更短，僅能傳幾代或十幾代。,當(dāng)細(xì)胞發(fā)生遺傳改變，如獲永生性或惡性轉(zhuǎn)化時(shí)，細(xì)胞的生存期才可能發(fā)生改變。,生命周期的三個(gè)階段,原代培養(yǎng)期,傳代期,衰退期,原代培養(yǎng)：從體內(nèi)取出組織,分離出細(xì)胞、接種培養(yǎng) 到 第一次傳代。,原代培養(yǎng)（Primary Culture）期,原代培養(yǎng)細(xì)胞與體內(nèi)原組織細(xì)胞在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能上相似性大。,特點(diǎn) 細(xì)胞群是異質(zhì)的（Heterogeneous） 細(xì)胞克隆形成率（Cl

7、oning Efficiency）低，即細(xì)胞獨(dú)立生存性差。 由于原代培養(yǎng)細(xì)胞和體內(nèi)細(xì)胞性狀相似性大，是檢測藥物很好的實(shí)驗(yàn)對(duì)象,原代培養(yǎng)分為兩種方法 直接接種組織塊 由組織分離出細(xì)胞后接種,組織塊接種：牛胎兒成纖維細(xì)胞,傳代期：,原代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代后便改稱做細(xì)胞系（Cell Line）。此期的持續(xù)時(shí)間最長。,在培養(yǎng)條件較好情況下，細(xì)胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型。,為保持二倍體細(xì)胞性質(zhì)，細(xì)胞應(yīng)在原代培養(yǎng)期或傳代后早期凍存。,一般情況下當(dāng)傳代1050次左右，細(xì)胞增殖逐漸緩慢，以至完全停止，細(xì)胞進(jìn)入第三期。,衰退期：,增殖很慢或不增殖，最后衰退凋亡。,少數(shù)情況下，細(xì)胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化（Sponta

8、neous Transformation）。轉(zhuǎn)化的標(biāo)志之一是細(xì)胞可能獲得永生性（Immortality）或惡性性質(zhì)（Malignancy）。這樣的細(xì)胞群體稱無限細(xì)胞系（Infinite Cell Line），也稱連續(xù)細(xì)胞系（Continuous Cell Line）。,無限細(xì)胞系的形成主要發(fā)生在第二期末，或第三期初階段。細(xì)胞獲不死性后，核型大多變成異倍體（Heteroploid）。,細(xì)胞的一代生存期,1潛伏期（Latent Phase）,2指數(shù)增生期（Logarithmic growth Phase）,3停滯期（Stagnate Phase）,1潛伏期（Latent Phase）,細(xì)胞接種培養(yǎng)

9、后，先是懸浮期。此時(shí)細(xì)胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。,接著細(xì)胞貼附于底物表面，稱貼壁，,各種細(xì)胞貼附速度不同，這與細(xì)胞的種類、培養(yǎng)基成分和底物的理化性質(zhì)等密切相關(guān)。,經(jīng)過延展過程變成極性細(xì)胞,可運(yùn)動(dòng)，基本無增殖。,細(xì)胞接種密度大時(shí)潛伏期短。,當(dāng)細(xì)胞分裂相開始出現(xiàn)并逐漸增多時(shí)，標(biāo)志細(xì)胞已進(jìn)入指數(shù)增生期。,不同的細(xì)胞貼壁的時(shí)間不同,如巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等粘附能力強(qiáng), 能在數(shù)分鐘至數(shù)十分鐘內(nèi)粘附到固相表面 如神經(jīng)元細(xì)胞、羊水細(xì)胞，粘附能力弱, 需要數(shù)小時(shí)乃至更長的時(shí)間才能粘附到固相表面 可利用此特點(diǎn)（粘附：快、牢；慢、弱） 分離、純化細(xì)胞,貼附過程 ：3步 貼附因子粘附 細(xì)胞開始附著 細(xì)胞進(jìn)一步牢固附著

10、伸展,細(xì)胞貼壁影響因素 生物因素：血清、培養(yǎng)液中的促附著因子 機(jī)械、物理等其他因素： 流動(dòng)：培養(yǎng)液流動(dòng)可阻止細(xì)胞附著 離心：促進(jìn)附著 低溫：可抑制附著,加速細(xì)胞貼壁的措施,包被培養(yǎng)皿底面：對(duì)分化程度高、生長能力差的細(xì)胞可在培養(yǎng)瓶皿表面包被有利于細(xì)胞粘附和生長的生物活性物質(zhì) 如:-通過其所帶電荷先吸附培養(yǎng)皿底部, 培養(yǎng)的細(xì)胞再與其結(jié)合。,血清內(nèi)含有多種能夠促進(jìn)細(xì)胞粘附的成分,減少接種時(shí)細(xì)胞懸液的量，待細(xì)胞粘附和貼壁之后，再補(bǔ)充足夠的培養(yǎng)液,培養(yǎng)液中離子成分及其濃度 如，培養(yǎng)液中的Ca含量過低時(shí)不利于 細(xì)胞的粘附、貼壁和鋪展 合適的培養(yǎng)溫度,細(xì)胞鋪展（伸展） (spread) 進(jìn)行生命活動(dòng)的一種基

11、本的生長特點(diǎn)或生長行為 鋪展?fàn)顩r制約細(xì)胞的分裂增殖活動(dòng) 鋪展的過程 細(xì)胞先由圓形變?yōu)閳A餅形(放射狀鋪展細(xì)胞) 逐漸鋪開伸展成為扁平的極性細(xì)，鋪展的越好與生長基質(zhì)的表面接觸面越大 極性細(xì)胞就是細(xì)胞在體外的特征性細(xì)胞形態(tài) 鋪展?fàn)顩r與細(xì)胞的生長有密切關(guān)系 只有當(dāng)細(xì)胞鋪展到合適的程度DNA合成才開始進(jìn)行,2， 指數(shù)增生期（Logarithmic growth Phase）,是細(xì)胞增值最旺盛的階段，是細(xì)胞一代中活力最好的時(shí)期,是進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)最好的和最主要的階段。,以細(xì)胞分裂指數(shù)（Mitotic Index：MI）作為判定細(xì)胞生長旺盛與否的重要標(biāo)志。即每1000個(gè)細(xì)胞中的分裂相數(shù)。 體外培養(yǎng)細(xì)胞分裂指數(shù)受

12、細(xì)胞種類、培養(yǎng)液成分、pH、培養(yǎng)箱溫度等多種因素的影響。一般細(xì)胞的分裂指數(shù)介于0.1%0.5%，原代細(xì)胞分裂指數(shù)低，永生細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞分裂指數(shù)可高達(dá)3%5%。pH和培養(yǎng)液血清含量變動(dòng)對(duì)細(xì)胞分裂指數(shù)有很大影響,2， 指數(shù)增生期（Logarithmic growth Phase）,接觸抑制（Contact Inhibition） 由于細(xì)胞增殖而的相互接觸，進(jìn)而抑制細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和增殖，這種現(xiàn)象稱接觸抑制（Contact Inhibition）。 惡性細(xì)胞則無接觸抑制現(xiàn)象，因此接觸抑制可作為區(qū)別正常與癌細(xì)胞標(biāo)志之一。 接觸抑制是創(chuàng)面愈合過程中一個(gè)十分有趣的現(xiàn)象。當(dāng)周邊的上皮向創(chuàng)面中央爬行時(shí),一旦上皮細(xì)胞

13、互相接觸,就停止分化和增殖。該現(xiàn)象就叫接觸抑制。因此,創(chuàng)面上不會(huì)出現(xiàn)多余的皮贅。這也是一種十分巧妙和神秘的調(diào)控現(xiàn)象。,接觸抑制（Contact inhibition）,細(xì)胞相互接觸時(shí)，將停止增長； 細(xì)胞停留在細(xì)胞周期的G0期； 轉(zhuǎn)化的細(xì)胞卻可以繼續(xù)生長導(dǎo)致細(xì)胞重疊堆積生長。,3停滯期（Stagnate Phase）：,細(xì)胞數(shù)量達(dá)飽和密度后，細(xì)胞遂停止增殖，進(jìn)入停滯期。此時(shí)細(xì)胞數(shù)量不再增加，故也稱平頂期（Plateau）。,停滯期細(xì)胞雖不增殖，但仍有代謝活動(dòng)，培養(yǎng)液中營養(yǎng)漸趨耗盡，代謝產(chǎn)物積累、pH降低。,此時(shí)需做分離培養(yǎng)即傳代，否則細(xì)胞會(huì)中毒，發(fā)生形態(tài)改變，重則從底物脫落死亡。傳代過晚（已有中

14、毒跡象）能影響下一代細(xì)胞的機(jī)能狀態(tài)。在這種情況下，雖進(jìn)行了傳代，因細(xì)胞已受損，需要恢復(fù)，至少還要再傳12兩代，通過換液淘汰掉死細(xì)胞和使受損輕微的細(xì)胞得以恢復(fù)后，才能再用。,第二節(jié)、細(xì)胞培養(yǎng),主 要 內(nèi) 容,（一）細(xì)胞培養(yǎng)所需條件,（二）細(xì)胞培養(yǎng)所需用品,（三）細(xì)胞培養(yǎng)液,（四）細(xì)胞的原代、繼代培養(yǎng),（五）細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇,（六）細(xì)胞污染,（一）細(xì)胞培養(yǎng)所需條件,1 營養(yǎng)需要,2 細(xì)胞的生存環(huán)境 溫度: 37 O2 CO2: 5% CO2 +H2O H2CO3 H+ + HCO3- pH: 7.2-7.4 滲透壓 濕度,3 無污染,4 無毒,（二）細(xì)胞培養(yǎng)所需用品：,無菌間、超凈工作臺(tái)，壓力蒸汽

15、消毒器，電熱干燥箱，濾器，酸缸，紫外燈,CO2培養(yǎng)箱,倒置顯微鏡,液氮罐,自動(dòng)雙重純水蒸餾器，純水儀,耗材：培養(yǎng)瓶，吸管，電動(dòng)吸引器，培養(yǎng)板， 凍存管,1超凈工作臺(tái)(Hood):,A.水平流超凈工作臺(tái)(Horizontal air flow),B.垂直流超凈工作臺(tái)(Lateral air flow),C.層流空氣超凈工作臺(tái)(Laminar air flow),水平流超凈工作臺(tái) 背送風(fēng)，但病毒是不實(shí)用的，容易對(duì)人有害,垂直流超凈工作臺(tái),超凈工作臺(tái)的清潔維護(hù)： 保持工作臺(tái)上無死角，讓空氣得到充分過濾，即試驗(yàn)完畢后，將所有的用品收藏起來，工作臺(tái)上只留有酒精燈及橡皮頭。工作前和工作完畢都要用酒精擦桌面

16、，如果桌面滴有培養(yǎng)液等物，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后應(yīng)先用水擦，然后用酒精再擦。還需定期檢測工作臺(tái)濾器過濾的效率。,整個(gè)接種操作應(yīng)在近火焰處進(jìn)行，且動(dòng)作要迅速,正 確 錯(cuò) 誤,接種過程中盡可能達(dá)到懸空要求,防止操作帶來的污染,正 確 錯(cuò) 誤,接種時(shí)不得用手接觸瓶蓋內(nèi)壁或瓶口,正 確 錯(cuò) 誤,瓶蓋朝上放，接種完畢后立即蓋好瓶口,正 確 錯(cuò) 誤,2，CO2培養(yǎng)箱,CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37 ，100%濕度，5CO2 。,使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)注意的問題, 用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，需將瓶蓋微松，以保證通氣。, 保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。 定期消毒（90 ，14 h)。, 箱內(nèi)滅菌蒸餾水3000毫升蒸餾水， 以保持

17、箱內(nèi)濕度，避免培養(yǎng)液蒸發(fā)。,濕度以第二天第一次開門，能看到玻璃門上的水珠,3消毒設(shè)備：,A.高壓消毒鍋（Autoclave）：110 C，15 lb，20 分鐘，適合于橡皮、紙、布、塑料制品和液體（9 lb， 10 分鐘）等。消毒后必須在烤箱中低溫烤干。,B.干熱消毒箱：150-200 C， 2 -3小時(shí)。 適合于玻璃器皿、金屬器械等。,C.酒精消毒：解剖器械、塑料器皿、動(dòng)物皮毛 等，酒精濃度為7595 。,高壓消毒鍋,D. 濾膜過濾：,正壓過濾: 蠕動(dòng)泵通入培液；通入氣體。,負(fù)壓過濾：用水泵或油泵抽濾。,濾膜孔徑為0.22m，為延長濾膜壽命可同時(shí)添加0.45 m和1.2 m 濾膜。,濾 膜

18、濾 器,兩種：1，一次性濾器；2，買濾膜自己裝（需要消毒）,4. 蒸餾器與去離子純水系統(tǒng)： 1）用三蒸水，通過去離子純水 系統(tǒng)，電阻需達(dá)到170萬歐姆以上。 2）專門的去離子水系統(tǒng) 5. 倒置相差顯微鏡： 需用相差鏡頭和濾光片，集光器的選擇應(yīng)與接物鏡的放大倍數(shù)一致。,純水系統(tǒng),倒置相差顯微鏡 1，物鏡朝上 2，工作距離大 3，相差干涉,5，培養(yǎng)器皿,培養(yǎng)板與培養(yǎng)瓶,5，恒溫水浴箱，血清滅活，細(xì)胞解凍,6，移液管,7，低速離心機(jī),（三）細(xì)胞培養(yǎng)基,干粉培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基 常用的培養(yǎng)基種類 RPMI-1640（標(biāo)準(zhǔn)型）、DMEM-高糖（標(biāo)準(zhǔn)型）、DMEM-低糖（標(biāo)準(zhǔn)型）、McCoys 5A、M19

19、9、F12等,Gibco干粉培養(yǎng)液,液體培養(yǎng)液,1，培養(yǎng)在使用之前需要加入的成分：血清、H2CO3, 丙酮酸鈉、抗生素等,Hyclone胎牛血清,Gibco胎牛血清,血清使用前要根據(jù)需要的量進(jìn)行分裝， 避免反復(fù)凍融，血清保存要放置20,培養(yǎng)液的選擇,沒有一定的標(biāo)準(zhǔn)，有幾點(diǎn)建議可供參考,選擇培養(yǎng)這種細(xì)胞首選的培養(yǎng)液?？梢圆殚唴⒖嘉墨I(xiàn)，或在購買細(xì)胞株時(shí)咨詢。,其它實(shí)驗(yàn)室慣用的培養(yǎng)液不妨一試，許多培養(yǎng)液可以適合多種細(xì)胞。,用多種培養(yǎng)液培養(yǎng)目的細(xì)胞，觀察其生長狀態(tài)，可以用生長曲線、集落形成率等指標(biāo)判斷，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇最佳培養(yǎng)基，這是最客觀的方法，但比較繁瑣。,總之，首選MEM做粘附細(xì)胞培養(yǎng)、RPMI

20、-1640做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，各種目的無血清培養(yǎng)的首選是AIM V培養(yǎng)基（SFM）。,血清使用注意事項(xiàng),血清必須貯存于20 -70，若存放于4，請(qǐng)勿超過一個(gè)月。,血清解凍步驟(逐步解凍法): -20或70至4冰箱溶解一天，至室溫下全溶后再分裝。在溶解過程中須規(guī)則搖晃均勻(小心勿造成氣泡)，使溫度與成分均一，減少沉淀的發(fā)生。勿直接由20直接至37解凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生沉淀。,熱滅活（heat-inactivation）是指56, 30 分鐘加熱已完全解凍之血清。目的是使血清中之補(bǔ)體成份(complement) 去活化。除非必須，一般不建議作此熱處理，因?yàn)闀?huì)造成沉淀物顯著增多，

21、且會(huì)影響血清之品質(zhì)。,勿將血清置于37太久，若在37放置太久，血清會(huì)變得混濁，同時(shí)血清中許多較不穩(wěn)定之成份亦會(huì)因此受到破壞，而影響血清之品質(zhì),補(bǔ)體系統(tǒng)原指血清中引起免疫性細(xì)胞溶解（抗體包裹細(xì)胞溶解）的不耐熱因子；現(xiàn)指至少由20種截然不同的血清蛋白組成的完整功能相關(guān)系統(tǒng)。補(bǔ)體系統(tǒng)主要的功能是通過 在病原體表面的作用，破壞其細(xì)胞膜或者“調(diào)理”病原體表面供巨噬細(xì)胞吞食，此外還能引起發(fā)炎反應(yīng)。 加熱可以滅活補(bǔ)體系統(tǒng)。激活的補(bǔ)體參與溶解細(xì)胞事件，刺激平滑肌收縮，細(xì)胞和血小板釋放組胺，激活淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。在進(jìn)行免疫學(xué)研究、培養(yǎng)ES細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞時(shí)，推薦使用熱滅活血清。,凝絮物：發(fā)生之原因有

22、許多種，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein) 變性及解凍后血清中存在之血纖維蛋白(fibrin) 造成，這些凝絮沉淀物不會(huì)影響血清本身之品質(zhì)。若欲減少這些凝絮沉淀物，可用離心3000 rpm, 5 min 去除，或離心后上清液可以加入培養(yǎng)基中一起過濾。不建議用過濾步驟去除這些凝絮沉淀物，因?yàn)闀?huì)阻塞過濾膜。 顯微鏡下觀察之“小黑點(diǎn)”：通常經(jīng)過熱處理之血清，沉淀物的形成會(huì)顯著的增多。有些沉淀物在顯微鏡下觀察像是“小黑點(diǎn)”，常會(huì)誤認(rèn)為血清遭受污染，而將血清放在37中欲培養(yǎng)此“微生物“，但在37環(huán)境下，又會(huì)使此沉淀物增多，更會(huì)誤認(rèn)為微生物之增殖，但以培養(yǎng)細(xì)菌之培養(yǎng)基檢測，又沒有污染。

23、一般而言，此小黑點(diǎn)應(yīng)不會(huì)影響細(xì)胞之生長，但若懷疑此血清之品質(zhì)，應(yīng)立即停用，更換另一批號(hào)的血清。,血清沉淀物,谷氨酰胺,L谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)是重要的。脫掉氨基后，L谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過一段時(shí)間后會(huì)降解，但是確切的降解率一直沒有最終確定。L谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對(duì)于一些細(xì)胞具有毒性。 配制方法為 ：谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mM的溶液，充分?jǐn)嚢枞芙夂螅☉?yīng)加溫30），過濾除菌，分裝小瓶，-20保存，使用時(shí)可向100ml培養(yǎng)液中加入0.5-2ml谷氨酰胺濃縮液，終濃度為1-4mM,酚 紅,大多數(shù)培

24、養(yǎng)液中使用酚紅作為pH 指示 橙色表示中性pH 黃色代表酸性pH 紫色表示堿性pH 在一些特殊培養(yǎng)液中不含酚紅 因?yàn)橐延幸恍┭芯勘砻鳎悍蛹t能模擬類固醇激素（尤其是雌激素）樣作用，為避免固醇類反應(yīng)，培養(yǎng)細(xì)胞，尤其是哺乳類細(xì)胞時(shí)，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測時(shí)，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。,細(xì)胞消化液,由組織中分離細(xì)胞和細(xì)胞傳代,常用的有胰蛋白酶和乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)兩種溶液，單獨(dú)或混合使用,胰蛋白酶溶液 主要作用：使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解，使細(xì)胞相互離散 消化細(xì)胞時(shí)，加入一些血清或含血清的培養(yǎng)液，能終止消化作用,EDTA4Na 溶液 一種化學(xué)螯合劑，對(duì)細(xì)胞有

25、一定的離散作用，而且毒性小，價(jià)格低廉，使用方便 常用工作液濃度為0.02%。,注意：使用EDTA 處理細(xì)胞后，要用平衡鹽液沖洗干凈，因殘留的EDTA 會(huì)影響細(xì)胞生長,（四）細(xì)胞的原代和傳代培養(yǎng),鼠胎組織細(xì)胞原代培養(yǎng),取材：用頸椎脫位法使孕鼠迅速死亡。把整個(gè)孕鼠浸入盛有75乙醇的燒杯中數(shù)秒鐘消毒，取出后放在大平皿中攜入超凈臺(tái)。用消過毒的剪刀在軀干中部環(huán)行剪開皮膚，剖腹取出子宮置于無菌平皿中。用消過毒的剪刀剪開子宮，取出鼠胎，剪去頭、爪，以平衡鹽溶液洗去血污 切割：用PBS將取出的組織塊清洗三次，然后用眼科手術(shù)剪刀仔細(xì)將組織反復(fù)剪碎，直到成1mm3左右的小塊，再用平衡鹽溶液清洗，洗到組織塊發(fā)白為止

26、。靜置數(shù)分鐘，使組織塊自然沉淀到管底，棄去上清 消化、接種培養(yǎng)：加入0.25胰蛋白酶消化液（5-10倍量），與組織塊混勻。置37水浴，觀察消化情況（每隔幾分鐘搖動(dòng)一下試管），靜止，吸去上清，加入510ml細(xì)胞培養(yǎng)液，用吸管吹打混勻，移入二個(gè)培養(yǎng)瓶中，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng),全量換液和半量換液 換液時(shí)機(jī)的選擇： 培養(yǎng)液pH值：細(xì)胞生長旺盛，代謝產(chǎn)生酸性物質(zhì)積累增多， pH值下降，營養(yǎng)液酸化變黃。 細(xì)胞狀態(tài),細(xì) 胞 換 液,細(xì) 胞 傳 代,原代細(xì)胞傳代以便獲得穩(wěn)定的細(xì)胞株 細(xì)胞系傳代以得到大量的同種細(xì)胞，并維持細(xì)胞種的延續(xù) 接觸抑制 營養(yǎng)枯竭 將培養(yǎng)的細(xì)胞從培養(yǎng)器皿中消化下來，以1:2或l:3以

27、上的比率轉(zhuǎn)移到另外的器皿中進(jìn)行培養(yǎng)，即為傳代培養(yǎng) 細(xì)胞“一代”指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)的一段期間，與細(xì)胞世代或倍增不同，在一代中，細(xì)胞培增36次,消化法傳代培養(yǎng)步驟,(五)細(xì)胞凍存和復(fù)蘇,冷凍保存要點(diǎn) 冷凍過程要緩慢：緩凍速溶 4 3060 分鐘-20 30 分鐘 -80 1618 小時(shí)（或過夜）液氮長期保存 或使用程序降溫盒，每秒下降1 凍存細(xì)胞必須處在對(duì)數(shù)生長期，活力大于90，無微生物污染。 細(xì)胞濃度控制在：5x1062x107/ml。 常用細(xì)胞冷凍保存液 5%或10DMSO完全培養(yǎng)液 10甘油完全培養(yǎng)液,冷凍細(xì)胞注意事項(xiàng),凍存液配制 : 現(xiàn)用現(xiàn)配，DMSO是易燃物 凍存液體積：要小，0.

28、5-1 ml 凍存細(xì)胞數(shù)：與正常傳代細(xì)胞數(shù)目要相當(dāng)，避免復(fù)蘇后細(xì)胞傳代比例發(fā)生變化 凍存速度： 降溫緩慢 4C，1030 min -20C，1 - 2 h -80C，1 hour 過夜 -196C，1- 2 year 完善記錄：凍存細(xì)胞名稱，PD，凍存日期，凍 存人，存放位置，其它特殊信息等,細(xì)胞凍存管，做好標(biāo)記,細(xì) 胞 復(fù) 蘇,速融 凍存細(xì)胞從液氮中取出后，立即放入37水浴中，輕輕搖動(dòng)冷凍管，使其在1 分鐘內(nèi)全部融化（不要超過3 分鐘）,解凍后的細(xì)胞可直接接種到含完全培養(yǎng)液中直接進(jìn)行培養(yǎng)，24 小時(shí)后再用新鮮完全培養(yǎng)液替換舊培養(yǎng)液，以去除DMSO,如果細(xì)胞對(duì)冷凍保護(hù)劑特別敏感 解凍后的細(xì)胞應(yīng)

29、先通過離心去除冷凍保護(hù)劑，然后再接種到含完全生長培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中,（六）細(xì) 胞 污 染,細(xì)菌污染 真菌污染 細(xì)菌和真菌的清除 支原體污染 支原體的清除,細(xì)菌污染,細(xì)胞培養(yǎng)常見的污染 最常見的有革蘭氏陽性菌，如枯草桿菌以及大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌，其中又以白色葡萄球菌較常見。 培養(yǎng)細(xì)胞受細(xì)菌污染后，會(huì)出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁，pH改變。 污染后細(xì)胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，最后變圓脫落死亡。,真菌污染,真菌污染后，細(xì)胞生長變慢，但最后由于營養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細(xì)胞脫落死亡。,白色念珠菌（倒置顯微鏡下）,中間長梭型的是正在分裂的念珠菌,細(xì)菌和真菌的清除,使用抗生素 抗生素對(duì)殺滅細(xì)菌較有效。

30、 聯(lián)合用藥比單獨(dú)用藥效果好。 預(yù)防用藥比污染后再用藥效果好，一般用雙抗生素。 污染后清除用藥需采用大于常用量510倍藥物沖洗法，于加藥后作用2448小時(shí)，再換常規(guī)培養(yǎng)液。此法在污染早期有效。,95以上是以下四種支原體： 口腔支原體（M.orale） 精氨酸支原體（M.arginini） 豬鼻支原體（M.hyorhinis） 牛萊氏無膽甾原體（A.laidlawii） 危害： 世界性問題，平均發(fā)生率達(dá)到11% 能改變細(xì)胞的DNA,RNA及蛋白表達(dá) 不能通過可視法對(duì)其進(jìn)行檢測 對(duì)細(xì)胞的生長率影響較小，不易引起注意污染 來源： 操作環(huán)境不良 操作人員的疏失 實(shí)驗(yàn)器具不潔等 已受污染的細(xì)胞 已受污染的

31、培養(yǎng)基、血清,支原體污染,熒光染色法 電鏡檢查：掃描電鏡、透射電鏡 支原體培養(yǎng) 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法,支原體污染檢測,細(xì)胞營養(yǎng)液常常仍清亮但變黃,細(xì)胞生長變緩，部分細(xì)胞發(fā)生脫落等等，細(xì)胞間隙可見鋪滿細(xì)沙樣小點(diǎn)。,支原體污染表現(xiàn),熒光染料Hoechst33258染色法檢測支原體,支原體的清除,支原體清除劑MRA （MycoplasmaRemovalAgent）處理法 每4天換一次液，連續(xù)處理15天 清洗純化法 細(xì)胞營養(yǎng)馴化優(yōu)質(zhì)細(xì)胞群的篩選細(xì)胞清洗反復(fù)離心洗滌 原理：由于支原體個(gè)體小且除發(fā)酵支原體外多為細(xì)胞外寄生，所以通過反復(fù)洗滌細(xì)胞和低速離心換液使其中潛在的支原體數(shù)量降低至極限. 如結(jié)合敏感抗生素的抑殺作用