組織RTPCR注意事項(xiàng)

1、1. 抽提rna都是為了得到其mrna，而mrna和組織的狀態(tài)密切相關(guān)，因此需要超低溫的狀態(tài)，一般選擇用液氮保存組織。而且去的時(shí)候要盡可能的新鮮，動(dòng)作要快，取后立即放入液氮罐中。2.提取rna前要對(duì)腦組織進(jìn)行研磨，切記要在液氮中進(jìn)行，也是為了防止rna的降解。研磨要充分，使組織塊變小。3.加入trizol后要充分吹打開，目的是使組織中的核蛋白體，多糖等與rna分離。4.其次是注意外源性的rna酶污染，操作全過(guò)程要戴口罩，手套。操作速度要快，冰上進(jìn)行。我做過(guò)大鼠下丘腦組織的rt-pcr，在動(dòng)物房將組織取好先放在rnafree的ep管中，放在冰盒內(nèi)，然后再轉(zhuǎn)移到實(shí)驗(yàn)室的70冰箱內(nèi)，在抽rna的時(shí)候

2、，腦組織最好要氯仿抽提兩次，這個(gè)是我在別的地方看到的，但是真的很好用，可以改善rna抽提的質(zhì)量。用生理鹽水或pbs沖洗掉血液，分切成50-100mg大小的組織塊，早點(diǎn)把提rna的試劑盒買過(guò)來(lái)就可以根據(jù)說(shuō)明書加入變性液中（ep管內(nèi)），80儲(chǔ)存，到時(shí)候拿出來(lái)組織就很容易攆碎了。如果試劑盒沒(méi)到，那就直接放在ep管中，提rna的時(shí)候再拿出來(lái)再加也可以。就是組織可能會(huì)不容易攆碎一些。我覺(jué)得你可以用高壓過(guò)的edpc處理的水進(jìn)行清洗（23次），后迅速切成合適的大小的組織（具體大小與rna提取方法相關(guān)，我用的是trnzol法，一般取50100mg，）于ep管中，直接放到80度冰箱，不需要液體浸泡！到時(shí)直接取出

3、提取rna即可！建議你的剪刀、鑷子等物品最好depc處理過(guò)！1.組織塊若沒(méi)有很多血液，可直接凍存；2.若有較多血液，可用生理鹽水沖洗；3.我以前取小腸組織時(shí)，先剪開自來(lái)水沖洗，再生理鹽水沖洗；4.一般1cm左右就可以，根據(jù)標(biāo)本將來(lái)的用途。5.直接原組織凍存。本實(shí)驗(yàn)室做過(guò)人子宮內(nèi)膜fgf基因的克隆，方法是從子宮肌瘤切除的人子宮中撕下新鮮內(nèi)膜組織，凍存與液氮總備用，實(shí)驗(yàn)前在液氮中充分研磨后提取總rna。因?yàn)槲覀兊哪康氖莗cr出目的基因，因此并不要求材料100的純凈，只要引物正確，反應(yīng)條件合適一般能克隆出目的基因。例如：從豬肝臟中提取總rna（本人實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)）：采用trizol試劑從新鮮豬肝臟組織中提

4、取總rna。將液氮凍存的新鮮豬肝臟組織約50mg放入ep管中，用研磨杵迅速研磨，然后加入1ml trizol試劑室溫裂解5min。然后10000r/min，離心1min，將上清液轉(zhuǎn)移到另一新的ep管中,加入200l氯仿輕輕混勻，室溫靜置3min。4，12000r/min，離心10min，轉(zhuǎn)移上層水相至另一新的ep管中，加入0.5ml異丙醇混勻，室溫靜置5min。4，12000r/min，離心10min，可以看到白色的rna沉淀貼于ep管底部，棄上清后用75%的乙醇洗滌，真空干燥后用100ldepc處理過(guò)的ddh2o溶解rna沉淀。含有rna的溶解液立即反轉(zhuǎn)錄，剩余部分零下70凍存。另外我用過(guò)r

5、na提取試劑盒效果也很好，方便，快速，純度較高組織勻漿器械：depc水處理的勻漿器，一次性換藥包，一次性刀片，depc水處理槍頭，電動(dòng)勻漿器1.新鮮或冰凍組織用蒸餾水沖洗除去表面污物切下1mm(3)組織塊2.將組織放入1。5ml的試管底，試管配有研棒3.加入1mltrizol4.插入研棒研磨碎組織塊，旋轉(zhuǎn)研棒將組織擠壓在使館壁上，10次左右（電動(dòng)12次）5.因標(biāo)本已勻漿話，將勻漿管至于4度冰桶中提取組織rna提取rna提取組織rna的準(zhǔn)備事項(xiàng)1。準(zhǔn)備depc泡的槍頭，以及depc泡的勻漿器2。用depc配制的1*pbs清洗組織3。準(zhǔn)備depc水配制的75%的酒精，泡制手術(shù)器械。帶者酒精在火上燎

6、一下。4。器械：離心管2支，吸管4個(gè)，酒精燈，打火機(jī)，記號(hào)筆，200ul,1000ul槍，depc泡過(guò)的槍頭ep管，紫外照過(guò)的手套。濾紙，depc純水（750ml無(wú)水乙醇150mldepc水,劇烈振蕩，使勁的搖晃，直至混勻），氯仿，75酒精，異丙醇，trizol，預(yù)冷的離心機(jī)（兩種），ep管架（洗液擦洗）,手套，滅菌剪刀，鑷子（2個(gè)），冰桶，冰塊，高靈敏度稱量?jī)x1.將組織取出后用眼科剪剪成1mm3左右的小塊2.組織樣品按50100mg/mltrizol加入trizol(組織體積不能超過(guò)trizol體積的10，否則勻漿效果不好，（此時(shí)可預(yù)冷另一個(gè)離心機(jī)），研磨10次左右（剩余的組織至于冰桶中，最

7、后存于液氮中3.4度，12000g離心去除不溶物(勻漿得時(shí)候最好將勻漿器放置在冰水中以免發(fā)熱)4.帶雙層手套，混合好的樣品全部移置到0.1ml的ep管中，室溫1530度靜置5分鐘5.加入0.2ml氯仿/1mltrizol,蓋好ep管，劇烈振蕩（上下顛倒），15秒鐘，室溫靜置23min6.28度，離心，10500rpm/min，15min,取上清，用200ul在20ul刻度使用，小心不要使界面混淆，剩余界面上不要）7.上清中加入等量的異丙醇(一般是0.5:1),顛倒5次（用200ul槍加小心），室溫靜置10min7. 2-8度離心，10500rmp/min,10min,棄上清8. rna洗滌：7

8、5酒精（這次用的100。未影響）1ml沉淀，輕輕彈其底部（直接放入70度冰箱可以長(zhǎng)期保存，靜置幾秒鐘9 28度離心，8500rpm/min,5min ,棄上清10 取出濾紙，將ep管敞開放在濾紙上，管口向酒精燈（不要完全干燥，不好溶解）11. depc水溶解（30ul,可變），分裝,2ul電泳，2ul比色，其余5ul分裝至于手套中凍于20度中大概量為組織（ugrna/mg組織）：110ug28s是18s亮度的兩倍（晾干時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)使rna降解）根據(jù)我抽提的經(jīng)驗(yàn)，當(dāng)提取組織rna時(shí)一般都有白色沉淀，當(dāng)細(xì)胞量多的時(shí)候也可以看到少許，不應(yīng)該是蛋白質(zhì)。用酒精洗滌兩次比洗一次好，然后等到差不多完全透明以后

9、再加depc水溶解，可以放四度冰箱過(guò)夜，然后比色。最好比色1.82.0，一般1.70以上都可以逆轉(zhuǎn)錄，沒(méi)問(wèn)題的。據(jù)我提取rna的經(jīng)驗(yàn)，一般在加入異丙醇并離心后都會(huì)在管底部看到一抹帶狀的白色沉淀，量不會(huì)很大，如果很大的話，預(yù)后并不樂(lè)觀，蛋白污染而且嚴(yán)重降解。如果提取材料量少的話，也有看不到任何東西的情況，我就會(huì)棄之增大樣本量，因?yàn)槿庋劭床坏降脑?，即使有也有限。而且我一般?huì)在提取總rna以后，跑膠看看提取的質(zhì)量，有無(wú)降解，有無(wú)dna污染，然后定量后才做rt的。所以我認(rèn)為你應(yīng)該適當(dāng)增加提取的細(xì)胞數(shù)。1.trizol：無(wú)論保存還是使用的時(shí)候都不要搖動(dòng)，因?yàn)槲覀兪褂胻rizol提取rna實(shí)際利用的是異硫

10、氰酸胍/苯酚法，苯酚很容易被氧化，所以不要搖動(dòng)，使用時(shí)也要從最底層吸取，也就是避免破壞表面的保護(hù)層。2.標(biāo)本保存：提取組織rna時(shí)涉及保存標(biāo)本的問(wèn)題，現(xiàn)在有一種樣品儲(chǔ)存液，其中含有rnase抑制劑，可以幫助保護(hù)rna，當(dāng)然仍需低溫.另外還可以將標(biāo)本浸在trizol里，70或20即可。3.減少dna污染：可以適當(dāng)多加一些trizol4.晾干：75酒精洗滌rna沉淀后，需要晾干。建議75酒精洗后再用無(wú)水乙醇沖洗一邊，這樣液體揮發(fā)的比較快2.4.晾干：75酒精洗滌rna沉淀后，需要晾干。建議75酒精洗后再用無(wú)水乙醇沖洗一邊，這樣液體揮發(fā)的比較快 我認(rèn)為第四步有點(diǎn)問(wèn)題，原理和操作都有問(wèn)題！通常我這么來(lái)

11、晾干，1、盡量吸干75的乙醇；2、5000rpm短暫離心；3、再次用黃色tip頭吸干，盡量吸干液體4、自然風(fēng)干5min，絕對(duì)可以做以后的實(shí)驗(yàn)了！3.其實(shí)trizol的工作容量是有一定限度的，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)特別豐富的時(shí)候，有的時(shí)候蛋白質(zhì)不能全部沉在中間層，可以把上清提出來(lái)，用trizol重新提取，（充分振蕩，加氯仿）把蛋白質(zhì)逐步去處。也可用酚氯仿反復(fù)抽提。需要特別指出的是，本人更推薦單獨(dú)用酚充分振蕩，然后再加氯仿，不提倡酚氯仿提前混在一起。我剛做過(guò)肝肺的。結(jié)果很不錯(cuò)。（斑竹給我加分鼓勵(lì)我啊）一、組織抽提：1. 取組織塊60左右，加入400600ul的trizol用勻漿器攆成漿液狀。2. 然后移到1.5

12、ml的ep管中，加入剩余的trizol，最終trizol的量為1ml。3. 冰上孵育5分鐘5. 離心12,000g 4 5分鐘 取上清液移入1.5ml新離心管。注意取組織塊不要太多。太多反而效果不好。我們這么做出來(lái)的od值都在1.9左右。后面的步驟就和做細(xì)胞的rt-pcr一樣了。在反應(yīng)體系中加入bsa（10100ug/ml）可屏蔽有害物質(zhì)對(duì)pcr的抑制作用，提高擴(kuò)增成功率。我們的方法如下：1、取材時(shí)，最好預(yù)先準(zhǔn)備好去rna酶的水或生理鹽水，組織取下后，用rna酶的水或生理鹽水沖洗干凈；2、器材最好200度干烤2小時(shí)，塑料制品用0.1depc水浸泡過(guò)夜，烤干后高壓；3、我們一般放在液氮里，如果不

13、方便的話，可以從液氮里轉(zhuǎn)到-80度冰箱。1各種器械一定要高溫（180度4小時(shí)或200，2小時(shí)）烤，取材用的玻璃器皿，錫箔紙，最好都烤過(guò)。2塑料制品泡depc，高壓后（去除殘留的depc），烤干。3，操作時(shí)動(dòng)作迅速，戴帽子口罩手套該是常識(shí)吧。4盡量用新鮮組織。非要保存當(dāng)然要液氮，保存時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。我們實(shí)驗(yàn)室用的只是普通高壓過(guò)的器械，也沒(méi)有什么問(wèn)題。不放心的話，可以用depc泡一下再高壓，至于tip頭還是泡一下，安全起見，但我同學(xué)提的時(shí)候從不用depc 也照樣能提出來(lái)啊，他們說(shuō)新的包裝里面一般沒(méi)有污染的，但裝入盒時(shí)一定要帶口罩阿如何去除rna酶外源性來(lái)源1.被污染的緩沖液2.自動(dòng)移液裝置應(yīng)采取的措

14、施1.當(dāng)處理rna酶時(shí)保證自動(dòng)移液器專用2.將要用到的用于rna試驗(yàn)的玻璃器皿、塑料制品和緩沖液留出來(lái)專用3.分成小份保存溶液或緩沖液并在用后丟棄。不用已經(jīng)在試驗(yàn)室用于其他目的的材料或儲(chǔ)存液4.留出專門用于分離rna的電泳裝置。用清潔劑清洗后再用流水沖洗，乙醇清洗干燥后加入3的h2o2。室溫10分鐘后用depc處理過(guò)的水徹底沖洗電泳槽5.準(zhǔn)備所有的溶液和緩沖液時(shí)，使用無(wú)rna酶的玻璃器皿、depc處理過(guò)的水，用于rna的化學(xué)用品用一次性刮刀或直接敲擊瓶底分離。可能的化，用0.1的depc在37處理溶液至少1小時(shí)后在15pis（1.05kg/cm2）高壓蒸汽滅菌15分鐘6.滅菌的玻璃器皿和塑料制

15、品不能有效滅活rna酶。300烘烤玻璃器皿4小時(shí)。用depc活其他滅活基于接觸的rna酶的商業(yè)化產(chǎn)品處理塑料制品7.用聲譽(yù)好的廠家證明無(wú)rna酶的一次性移液器頭和微量離心管。為了減少污染的機(jī)會(huì)，當(dāng)從原包裝去除這些小的器皿放在實(shí)驗(yàn)室架上時(shí)最好用無(wú)菌的鑷子8.在分離rna的過(guò)程中用抑制劑以抑制rna酶的活性1 注意無(wú)酶操作，包括戴手套，口罩，ep管最好用depc水泡后高壓。2 操作迅速，留取標(biāo)本后盡快液氮冷凍保存或凍后放入-70度冰箱保存。使用專門處理過(guò)的冷凍管，進(jìn)口的為佳。手套一定要戴，器械高溫（300）消毒，標(biāo)本液氮保存。組織液氮凍存后短時(shí)間內(nèi)提取rna，再將rna -70度保存，可行嗎？rn

16、a在-70度能保存多久？另一個(gè)問(wèn)題，組織在-70度能保存多久？有個(gè)博士說(shuō)她的組織在-70度保存一段時(shí)間后抽不出rna了，建議一直保存在液氮內(nèi)。rna要想保存的時(shí)間長(zhǎng)，最好保存在甲酰胺里面，用的時(shí)候再純化了使用?；蛘咛崛〉臅r(shí)候到用75乙醇洗滌時(shí)停止，將rna沉淀保存在75乙醇（depc水配置）里面，放在20度冰箱，一年應(yīng)該沒(méi)有問(wèn)題。要用新鮮的組織,至少也是用液氮處理后保存于-70度冰箱的組織.對(duì)于剛進(jìn)實(shí)驗(yàn)室的研究生可能一片茫然，為了節(jié)省大家的時(shí)間，向大家介紹一下rtpcr所需的實(shí)驗(yàn)耗材及試劑。 首先，必須設(shè)計(jì)目的基因引物和內(nèi)參照引物(或試劑盒自帶）。 此時(shí)，你需下列產(chǎn)品： 1.depc 用純水按

17、0.1%濃度配制 2.tip 10ul 200ul 1ml 3.ep tube （1.5ml） 4.tip box（10ul 200ul 1ml） 5.ep box（1.5ml） 6.pcr tube（200ul或500ul） 7.pe手套 將耗材及器皿等放入depc水中浸泡過(guò)夜，第二天高溫高壓滅菌，烘干，待用。 購(gòu)買total rna試劑盒先做抽提rna的預(yù)實(shí)驗(yàn)，也可將抽提樣品的rna于低溫保存。最好現(xiàn)提現(xiàn)用。 引物合成好后，就可以做rt-pcr啦。 由于pcr的反應(yīng)條件相對(duì)不好掌握，推薦二步法rt-pcr試劑盒(對(duì)于新手）。可以大大降低試劑盒成本。 rt-pcr產(chǎn)物出來(lái)后，接下來(lái)的工作就是

18、agarose電泳，需要下列試劑：1.agarose 2.eb 3.dna marker 4.tris.base 5.edta 以上所述可根據(jù)個(gè)人具體情況作相應(yīng)的調(diào)整。希望能給廣大戰(zhàn)友帶來(lái)方便。最好是新鮮的,不就再買只大鼠嘛!另外,腦提rna和用細(xì)胞提差不多,很容易:取出腦組織后放到研缽里,加rna提取試劑,(不用加液氮),研之,不象其它組織,腦比較易碎.我做過(guò)大鼠下丘腦組織的rt-pcr，在動(dòng)物房將組織取好先放在rnafree的ep管中，放在冰盒內(nèi)，然后再轉(zhuǎn)移到實(shí)驗(yàn)室的70冰箱內(nèi)，在抽rna的時(shí)候，腦組織最好要氯仿抽提兩次，這個(gè)是我在別的地方看到的，但是真的很好用，可以改善rna抽提的質(zhì)量。1.抽提rna都是為了得到其mrna，而mrna和組織的狀態(tài)密切相關(guān)，因此需要超低溫的狀態(tài)，一般選擇用液氮保存組織。而且去的時(shí)候要盡可能的新鮮，動(dòng)作要快，取后立即放入液氮罐中。2.提取rna前要對(duì)腦組織進(jìn)行研磨，切記要在液氮中進(jìn)行，也是為了防止rna的降解。研磨要充分，使組織塊變小。3.加入trizo