糖化血紅蛋白 HbA1c 測(cè)定的原理方法與儀器解析及

1、糖化血紅蛋白 hba1c 測(cè)定的原理方法與儀器解析及糖尿病目前在世界上發(fā)病率很高，占免疫病的比率，在發(fā)達(dá)國(guó)家高達(dá)2-5%，而我國(guó)糖尿病的發(fā)病率亦達(dá)2-3%，并且每年還以1的速度增長(zhǎng)。糖尿病是一種終生性疾病，其并發(fā)癥是至殘至死的主要原因，所以人們希望能盡早發(fā)現(xiàn)和治療糖尿病。臨床上廣泛采用血糖參數(shù)來判定糖尿病，而血糖參數(shù)只代表抽血時(shí)的血糖水平，對(duì)確診有局限性。近年來的醫(yī)學(xué)研究證明：血液中的糖化血紅蛋白(hba1c)濃度相對(duì)穩(wěn)定，其濃度值能準(zhǔn)確反映最近1-3個(gè)月期間的血糖水平，便于醫(yī)生對(duì)糖尿病進(jìn)行早期診斷；也可用于糖尿病人的血糖監(jiān)控及慢性并發(fā)癥的判斷等，受到臨床的廣泛重視，目前我國(guó)各大、中型醫(yī)院正逐

2、漸開展糖化血紅蛋白(hba1c)占總血紅蛋白(hb)的百分含量的測(cè)定項(xiàng)目。有些發(fā)達(dá)國(guó)家已將hba1c的測(cè)定列入中老年人的常規(guī)體檢項(xiàng)目。測(cè)定hba1c比較常用的方法，目前有乳膠凝集反應(yīng)法和離子交換高壓液相色譜法兩種，分別用生化分析儀和糖化血紅蛋白自動(dòng)分析儀進(jìn)行測(cè)定。1 hba1c的臨床意義糖化血紅蛋白是一項(xiàng)說服力較強(qiáng)、數(shù)據(jù)較客觀、穩(wěn)定性較好的生化檢查，不受偶爾一次血糖升高或降低的影響。能反應(yīng)糖尿病患者2-3個(gè)月以內(nèi)的糖代謝狀況，同時(shí)與糖尿病并發(fā)癥尤其是微血管病變關(guān)系密切，在糖尿病學(xué)上有重要的臨床參考價(jià)值。1.1增高：測(cè)定hba1c可以了解糖尿病人在23個(gè)月的血糖控制情況。此外，用含葡萄糖的透析液

3、作血透的慢性腎衰病人，地中海貧血和白血病病人亦增高。1.2降低：溶血性及失血性貧血，慢性腎衰，慢性持續(xù)性低血糖癥等。1.3作為糖尿病的病情監(jiān)測(cè)指標(biāo)1.3.1作為輕癥、型、隱性糖尿病的早期診斷指標(biāo)。1.3.2不是診斷糖尿病的敏感指標(biāo)，不能取代現(xiàn)行的糖耐量試驗(yàn)。1.3.3可以列為糖尿病的普查和健康檢查的項(xiàng)目。1.4當(dāng)hba1c9%時(shí)，說明患者存在著持續(xù)性高血糖，可以出現(xiàn)糖尿病腎病、動(dòng)脈硬化、白內(nèi)障等并發(fā)癥。臨床經(jīng)常以糖化血紅蛋白作為監(jiān)測(cè)指標(biāo)來了解患者近階段的血糖情況，以及估價(jià)糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生與發(fā)展情況。1.5對(duì)預(yù)防糖尿病孕婦的巨大胎兒、畸形胎、死胎，以及急、慢性并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的監(jiān)督具有重要意

4、義。1.6對(duì)于病因尚未明確的昏迷或正在輸注葡萄糖(測(cè)血糖當(dāng)然增高)搶救者，急查糖化血紅蛋白具有鑒別診斷的價(jià)值。1.7對(duì)于糖化血紅蛋白特別增高的糖尿病患者，應(yīng)警惕如酮癥酸中毒等急性合并癥的發(fā)生。2臨床常用的測(cè)定糖化血紅蛋白hba1c的方法2.1乳膠凝集反應(yīng)法乳膠凝集反應(yīng)法是利用抗原抗體直接測(cè)定總血紅蛋白hb中的糖化血紅蛋白hba1c的百分含量。目前有國(guó)內(nèi)外幾家廠商可以提供hba1c測(cè)定的試劑盒。這種免疫反應(yīng)是由被測(cè)血樣品中的總hb和hba1c與試劑中的抗體結(jié)合而形成凝集，凝集量隨hba1c濃度的大小而變化。使用生化分析儀器來進(jìn)行比濁測(cè)定hba1c的濃度，采用終點(diǎn)法，生化儀通過測(cè)定反應(yīng)液的吸光度值

5、，可直接反映出凝集量的多少；推算出hba1c占hb的百分含量，測(cè)定時(shí)，儀器多采用660nm單色光做主波長(zhǎng)，800nm單色光做副波長(zhǎng)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得出實(shí)測(cè)值。由于這種試驗(yàn)其標(biāo)準(zhǔn)曲線是非線性的，所以在測(cè)定前，首先用隨試劑盒一起帶有的5種不同濃度的定標(biāo)液，做出5點(diǎn)非線性標(biāo)準(zhǔn)曲線。曲線和數(shù)值存在生化儀的貯存器中，測(cè)定樣品時(shí)，實(shí)測(cè)出的吸光度值a與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，由儀器cpu求出實(shí)測(cè)樣品中的hba1c百分含量。乳膠凝集反應(yīng)法測(cè)定hba1c簡(jiǎn)便、不用增加儀器，可直接用自動(dòng)生化分析對(duì)樣品進(jìn)行快速測(cè)定。該方法也可以用手工的方法，在酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定，是目前使用較多的方法。但是乳膠凝集反應(yīng)法其準(zhǔn)確性和重復(fù)性均有欠缺。2

6、.2離子交換高壓液相色譜法hplc使用離子交換高壓液相色譜hplc(high pressure liquid chromatography)來測(cè)定hba1c的百分含量目前被認(rèn)為是分析hba1c的金標(biāo)準(zhǔn)。采用hplc方法工作的全自動(dòng)糖化血紅蛋白分析儀器，以其快速、簡(jiǎn)便、精巧、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，受到越來越多用戶的歡迎。色譜分析是一類利用混合物的各組分在不同相上的分配差別，在兩相物質(zhì)相對(duì)運(yùn)動(dòng)過程中，將混合物中的各種成份分離開的一種分析技術(shù)。液相色譜是以液體或固體為固定相，以液體為液動(dòng)相的色譜法的總稱。色譜法又叫色層或?qū)游觯@一技術(shù)在生命科學(xué)研究中用于生物活性物質(zhì)的分析；生物活性物質(zhì)是以混合物形式存在，人類

7、血液中的蛋白質(zhì)有上千種，只有把混在一起的被測(cè)蛋白分離出來，才能準(zhǔn)確測(cè)定；在hba1c的測(cè)定時(shí)，可以通過高精度hplc，將hba1c從hb中分離出來，才能得到準(zhǔn)確的數(shù)值。在生命科學(xué)研究中，活性物質(zhì)的分離主要應(yīng)用的是液相柱色譜。這種技術(shù)誕生于20世紀(jì)初葉，俄國(guó)化學(xué)家茨維特把植物色素混合液置于裝有碳酸鈣吸附劑的玻璃管頂端，用石油醚洗脫后，在玻璃柱上出現(xiàn)了幾組顏色不同的色帶，這些色帶隨著不斷的洗脫，越分越開，先后從玻璃柱下端流出，茨維特把這樣一種用流體洗脫色素混合液，使之通過碳酸鈣做固定相從而實(shí)現(xiàn)分離的技術(shù)，起名叫色譜法。這種方法被推廣用于分離許多混合物中的各種物質(zhì)，被分離物質(zhì)已和顏色無關(guān)了，但色譜分

8、析的名稱仍沿用至今。當(dāng)然更貼切的名稱應(yīng)該叫層析法。早期的色譜柱體積大，做固定相的物質(zhì)顆粒大，分離時(shí)需要大量的洗脫液。并且洗脫液靠重力流動(dòng)，分離時(shí)間長(zhǎng)，效率低。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，20世紀(jì)60年代，人們研制出新型液相柱，同時(shí)采用高壓輸液泵自柱上端為洗脫液加壓，大大加速了洗脫液的流速，開發(fā)出相應(yīng)的高靈敏度的檢測(cè)器，新的分析儀器-高壓液相色譜儀在70年代誕生，很快就占領(lǐng)了分析化學(xué)的舞臺(tái)。特別是在生命科學(xué)的研究中，hplc技術(shù)由于對(duì)被測(cè)物活性影響小，幾乎可以測(cè)定生物醫(yī)學(xué)中所有的非發(fā)揮性物質(zhì)，如近年來利用離子交換hplc法測(cè)定血液中的hba1c的百分含量，被認(rèn)為是糖尿病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。3糖化血紅蛋白自動(dòng)分

9、析儀糖化血紅蛋白自動(dòng)分析儀采用離子交換hplc法測(cè)定hba1c。離子交換hplc法，是利用能交換離子的材料為固定相來分離離子型化合物的方法。儀器使用陽離子交換柱進(jìn)行hba1c的百分比測(cè)定；當(dāng)一定量的全血樣品被取樣針吸入到進(jìn)樣裝置內(nèi)，在稀釋部分被溶血，釋放出紅細(xì)胞中的血紅蛋白hb，并由稀釋液稀釋，稀釋好的已經(jīng)溶血的樣品，由高壓泵注入離子交換柱。柱內(nèi)的固定相是最新開發(fā)的非多孔性，不溶和可滲透的交聯(lián)高聚物，上面分布固定的帶電荷基團(tuán)和能游動(dòng)的配衡離子；樣品通過過濾器從交換柱頂端加入后，由三種不同濃度的鹽洗脫緩沖液(流動(dòng)相)洗脫，使樣品向下移動(dòng)。此時(shí)溶液中所含血紅蛋白(hb)的各種組份即與固定相上能移動(dòng)

10、的離子進(jìn)行交換，樣品中的血紅蛋白多種組分在固定相上連續(xù)進(jìn)行可逆的交換吸著和解吸作用，而3種不同離子濃度的鹽液，形成線性梯度洗脫，洗脫液no1叫起始緩沖液，含低離子濃度的鹽，洗脫液no2、no3緩沖液，其離子濃度依次增高很多，這種流動(dòng)相離子濃度的改變對(duì)分離效果的影響非常明顯，前面洗脫出來的組分分離效果好，色譜峰很窄，后面組分也能在很短時(shí)間內(nèi)洗脫出來，大大縮短了分離時(shí)間；所以全自動(dòng)血紅蛋白分析儀，在1分多鐘內(nèi)、hb中的多種成份被分離成6個(gè)部分，其中的hba1c、hbf、hba1被有效、精確的分離；由交換柱流出的hb成分到達(dá)儀器的檢測(cè)器，檢測(cè)器內(nèi)裝有發(fā)射單色光的發(fā)光二極管，通過雙波長(zhǎng)可見光比色法測(cè)定

11、hba1c、hbf、hba1三個(gè)參數(shù)。儀器的檢測(cè)器檢測(cè)出分離后hba1c、hbf、hba1組分的吸光度值，與hba1c標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值比較，分析計(jì)算出結(jié)果，最后以百分率表示的hb組分結(jié)果與色譜圖一起打印出來。離子交換柱hplc法對(duì)全血直接測(cè)定hba1c，其批內(nèi)和批間變異系數(shù)cv均可以小于1%(cv 1%)，結(jié)果精確，hba1c檢測(cè)結(jié)果不受存在的變異型血紅蛋白及其衍生物的影響，特別適合于糖尿病人的監(jiān)控。產(chǎn)品說明性能特點(diǎn)：采用金標(biāo)準(zhǔn)-離子交換高效液相層析法最新開發(fā)的非多孔離子交換hplc-常光特有的即插式層析柱，裝卸時(shí)不需要工具，使部件更換簡(jiǎn)單易行全自動(dòng)高速檢測(cè)90秒/樣本常光通過光感原理，開發(fā)出獨(dú)特的可變稀釋倍率功能，可智能地隨樣品濃度改變稀釋倍率，大大提高了檢測(cè)范圍采用離子交換高壓液相層析法，對(duì)穩(wěn)定的hba1c進(jìn)