30種氨基酸同時定量檢測方法及試劑盒制備

1、專利中文英語查找前案討論此申請查看 PDF下載 PDF公開號CN A發(fā)布類型申請專利申請?zhí)朇N 8公開日2013年6月19日申請日期2011年12月14日優(yōu)先權(quán)日2011年12月14日公開號8.3,CN A,CN A,CN 8,CN-A-,CN A,CNA,CN8,CN8.3發(fā)明者劉麗宏,李鵬飛,李丹,張緒得,陶蓓蓓申請人劉麗宏,李鵬飛,李丹導(dǎo)出引文BiBTeX,EndNote,RefMan被以下專利引用(4),分類(2),法律事件(3)外部鏈接:中國國家知識產(chǎn)權(quán)局,歐洲專利數(shù)據(jù)庫 (Espacenet)30種氨基酸同時定量檢測方法及試劑盒制備CN A摘要本發(fā)明提供一種高靈敏和高通量的30種氨

2、基酸同時定量檢測試劑盒及其制備方法。復(fù)雜樣本中氨基酸經(jīng)有機(jī)溶劑提取處理后采用甲醇沉淀并加入穩(wěn)定同位素標(biāo)記的氨基酸內(nèi)標(biāo)，用鹽酸正丁醇衍生化處理，吹干復(fù)溶后，采用C18鍵合相硅膠為固定相，以含七氟丁酸和甲酸的乙腈水為流動相進(jìn)行反相色譜梯度分離，運(yùn)用質(zhì)譜儀進(jìn)行定量檢測。本發(fā)明的試劑盒，測試靈敏度可達(dá)到10ng/ml，各項(xiàng)方法學(xué)指標(biāo)均可滿足氨基酸臨床檢驗(yàn)、工業(yè)生產(chǎn)和科學(xué)研究等定量需要。權(quán)利要求(8)1.一種高靈敏30種氨基酸同時定量檢測試劑盒，其特征在于由特定濃度的穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)樣本、質(zhì)控樣本、衍生化試劑、流動相調(diào)節(jié)液組成。2.根據(jù)權(quán)利I所述的30種氨基酸同時定量檢測試劑盒的制備方法，其特征在于包括如

3、下步驟:(1)穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)凍干粉的制備；(2)質(zhì)控樣本的配制；(3)衍生化試劑的制備；(4)流動相調(diào)節(jié)液的配制。3.種30種氨基酸同時定量檢測方法，包括: (1)濃縮儲備液和日常工作液的配制: 取“穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)凍干粉”用有機(jī)溶劑充分溶解，混勻，即為濃縮儲備液，使用效期I個月；濃縮儲備液用有機(jī)溶劑稀釋適宜倍數(shù)，即為日常工作液，使用效期I周。 (2)樣本預(yù)處理: 取一定量的樣本，加入日常工作液，渦流，高速離心取上清液，吹干或凍干或揮干，加入適量的衍生化試劑衍生化一定時間，吹干或凍干或揮干，加入復(fù)溶液復(fù)溶。 (2)液相分離: a.采用C18、C8或氰基鍵和硅膠作固定相； b.流動相:甲醇；乙腈；

4、乙酸；甲酸；三氟乙酸；七氟丁酸；乙酸銨；甲酸銨；二乙胺三乙胺；等度或梯度洗脫；控制流速。 (3)質(zhì)譜測定:電噴霧離子源；大氣壓化學(xué)電離源；正離子方式。4.根據(jù)權(quán)利3所述的30種氨基酸同時定量檢測方法，其特征在于同時定量檢測30種氨基酸(精氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、天門冬氨酸、瓜氨酸、谷氨酸、纈氨酸、甘氨酸、酪氨酸、丙氨酸、鳥氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、蘇氨酸、色氨酸、組氨酸、Y-氨基丁酸、絲胺酸、牛磺酸、脯氨酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸、-氨基正丁酸、肌氨酸、-羥基賴氨酸、羥基脯氨酸、1-甲基組氨酸、3-甲基組氨酸、焦谷氨酸)中的一種或多種，包含且不限于此30種氨基酸。5.根據(jù)權(quán)利3所述的3

5、0種氨基酸同時定量檢測方法，其特征在于用乙腈、甲醇、三氯醋酸或高氯酸等蛋白沉淀劑進(jìn)行蛋白沉淀。6.根據(jù)權(quán)利3所述的30種氨基酸同時定量檢測方法，其特征在于用鹽酸正丁醇進(jìn)行衍生化處理。7.根據(jù)權(quán)利3所述的30種氨基酸同時定量檢測方法，其特征在于用穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量檢測。8.根據(jù)權(quán)利3所述的30種氨基酸同時定量檢測方法，其特征在于其所使用的流動相為:甲醇；乙腈；乙酸；甲酸；三氟乙酸；七氟丁酸；乙酸銨；甲酸銨；二乙胺；三乙胺；反相色譜等度或梯度分離。說明30種氨基酸同時定量檢測方法及試劑盒制備所屬技術(shù)領(lǐng)域0001 本發(fā)明涉及一種基于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(LC-MS/MS)開發(fā)的30種氨基酸同時

6、定量檢測試劑盒，更具體地說是采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對樣本中30種氨基酸進(jìn)行高靈敏度定量檢測的方法。0002 本發(fā)明還涉及本發(fā)明試劑盒的生產(chǎn)方法和應(yīng)用。背景技術(shù)0003 氨基酸(Amino acid)是含有氨基和羧基的一類有機(jī)化合物的通稱。自然界中已發(fā)現(xiàn)的氨基酸有180多種，人體內(nèi)重要的氨基酸有30多種。生命的產(chǎn)生、存在和消亡，無一不與蛋白質(zhì)有關(guān)，而氨基酸正是蛋白質(zhì)的基本單位，所以如果人體氨基酸發(fā)生變化，不在正常值范圍內(nèi)，就會導(dǎo)致生理功能異常，影響機(jī)體代謝的正常進(jìn)行，最后導(dǎo)致疾病。目前氨基酸代謝障礙所引起的疾病已超過400多種，涉及代謝、腫瘤、免疫、心腦血管、神經(jīng)系統(tǒng)、腎病、糖尿病、亞健康、

7、老年病等各類疾病和人體生長發(fā)育、營養(yǎng)健康、肌肉骨骼生長、激素分泌、解毒功能等各個健康環(huán)節(jié)。0004 氨基酸在醫(yī)藥上也有廣泛應(yīng)用。目前用作藥物的氨基酸有一百幾十種，其中包括構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸有20種和構(gòu)成非蛋白質(zhì)的氨基酸有100多種。因此，檢測復(fù)雜樣本中氣基酸的含量對臨床檢驗(yàn)、工業(yè)生廣和科學(xué)研究等都具有重要意義。0005 1958年Spackman等首先提出了用陽離子交換色譜與柱后卻三酮衍生結(jié)合的方法分析蛋白質(zhì)中的氨基酸，實(shí)現(xiàn)了氨基酸分析的自動化。其后，新的氨基酸分析方法不斷涌現(xiàn)，柱前衍生反相高效液相色譜法、高效陰離子交換色譜-積分脈沖安培檢測法、毛細(xì)管電泳法、液相色譜法等相繼應(yīng)用于氨基酸分析。

8、傳統(tǒng)的氨基酸分析技術(shù)已很難滿足極微量氨基酸的準(zhǔn)確和高通量檢測需求。0006 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)以液相色譜作為分離系統(tǒng)，質(zhì)譜作為檢測系統(tǒng)，樣本在液相色譜質(zhì)譜部分分別被分離及離子化，經(jīng)檢測器得到質(zhì)譜圖，具有高選擇性、高靈敏度、樣本處理簡單和自動化程度高的特點(diǎn)，日漸成為體內(nèi)外定性和定量分析的實(shí)用方法。研究開發(fā)一種結(jié)果準(zhǔn)確、嚴(yán)格區(qū)分同分異構(gòu)體、分析通量高、價格低廉、操作簡便、易于推廣的30種氨基酸LC-MS/MS同時定量檢測試劑盒，使其能廣泛應(yīng)用于復(fù)雜樣本中氨基酸臨床、科研和工業(yè)生產(chǎn)，將有助于提高氨基酸檢測質(zhì)量、促進(jìn)檢測方法標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化。發(fā)明內(nèi)容0007 本發(fā)明的目的在于提供一種高靈敏和高通量的

9、30種氨基酸同時定量檢測試劑盒，以滿足臨床檢驗(yàn)、工業(yè)生產(chǎn)和科學(xué)研究等對氨基酸定量檢則的需要。0008 本發(fā)明的另一目的在于提供上述試劑盒的制備方法。0009 技術(shù)方案0010 本試劑盒是一種采用LC-MS/MS測定復(fù)雜樣本中30種氨基酸(精氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、天門冬氨酸、瓜氨酸、谷氨酸、纈氨酸、甘氨酸、酪氨酸、丙氨酸、鳥氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、蘇氨酸、色氨酸、組氨酸、Y-氨基丁酸、絲胺酸、?；撬帷⒏彼?、半胱氨酸、同型半胱氨酸、-氨基正丁酸、肌氨酸、-羥基賴氨酸、羥基脯氨酸、1-甲基組氨酸、3-甲基組氨酸、焦谷氨酸)濃度的新型試劑盒。復(fù)雜樣本中氨基酸經(jīng)有機(jī)溶劑提取處理后采用甲醇沉

10、淀并加入穩(wěn)定同位素標(biāo)記的氨基酸內(nèi)標(biāo)，用鹽酸正丁醇為衍生化試劑進(jìn)行處理，吹干復(fù)溶后上清液進(jìn)行LC-MS/MS檢測，記錄氨基酸和內(nèi)標(biāo)的峰面積。根據(jù)氨基酸對應(yīng)穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)濃度、樣本中的氨基酸/對應(yīng)同位素內(nèi)標(biāo)峰面積比值即可計(jì)算出每種氨基酸的濃度。測定結(jié)果為復(fù)雜樣本中氨基酸濃度。0011 本發(fā)明的試劑盒制備過程包括如下步驟:0012 1.穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)凍干粉:12種穩(wěn)定同位素標(biāo)記氨基酸對照品凍干粉(含2H4 ;5-13C-精氨酸、2H3-亮氨酸、2H3-甲硫氨酸、13C6-苯丙氨酸、2H3-天門冬氨酸、2H2-瓜氨酸、2H3-谷氨酸、2H8-纈氨酸、13C6-酪氨酸、2H4-丙氨酸、2H3-鳥氨酸均0

11、.5pmoL ;含15N ；2-13C-甘氨酸2.5pmoL),貼簽標(biāo)記,完成操作。0013 2.質(zhì)控樣本A的配制:精密稱取IOmg精氨酸對照品，置IOmL容量瓶中，加甲醇溶解，并稀釋至刻度，配制成Img.mL1的精氨酸儲備液。精密量取精氨酸儲備液871 L，置50mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，配制成17.42 g.1的精氨酸(lOOymol/L)質(zhì)控樣本，分裝，貼簽標(biāo)記，完成操作。0014 3.質(zhì)控樣本B的配制:精密稱取IOmg苯丙氨酸對照品，置IOmL容量瓶中，加甲醇溶解，并稀釋至刻度，配制成Img.mL1的苯丙氨酸儲備液。精密量取苯丙氨酸儲備液413 L,置50mL容量瓶中，加甲醇稀釋

12、至刻度，配制成8.26 g *mL_1的苯丙氨酸(50 mol/L)質(zhì)控樣本，分裝，貼簽標(biāo)記，完成操作。0015 4.衍生化試劑組分A:色譜純正丁醇，分裝，貼簽標(biāo)記，完成操作。0016 5.衍生化試劑組分B:12mol/L鹽酸，分裝，貼簽標(biāo)記，完成操作。0017 6.流動相調(diào)節(jié)液A的配制:色譜純甲酸，分裝，貼簽標(biāo)記，完成操作。0018 7.流動相調(diào)節(jié)液B的配制:色譜純七氟丁酸，分裝，貼簽標(biāo)記，完成操作。0019 本發(fā)明的試劑盒使用方法如下:0020 取10 L樣本置于1.5mL EP管中，加入日常工作液100 L，13200r/min離心2min。將離心后的上清液直接轉(zhuǎn)移到另一 1.5mL E

13、P管中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下50C吹干，加入60 L衍生化試劑，密封，渦旋30s，瞬時離心，65C孵育15min進(jìn)行衍生化。衍生后的溶液再次瞬時離心，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下5011C吹干。加入100 L復(fù)溶液復(fù)溶,潤旋30s, 13200r/min離心2min,進(jìn)樣5 L進(jìn)行LC-MS/MS分析。0021 有益效果0022 本發(fā)明試劑盒采用LC-MS/MS同時定量檢測復(fù)雜樣本中30種氨基酸的濃度，建立了一種高靈敏度(pmol級)和準(zhǔn)確性的30種氨基酸LC-MS/MS定量方法，同分異構(gòu)體基本都能基線分離，方法操作簡單、快速、高通量，可用于臨床檢驗(yàn)、工業(yè)生產(chǎn)和科學(xué)研究中樣本的檢測。同時，本發(fā)明試劑盒首次實(shí)現(xiàn)多種氨基酸

14、LC-MS/MS定量檢測技術(shù)國產(chǎn)化，它的推廣應(yīng)用將有助于提氨基酸檢測質(zhì)量、促進(jìn)檢測方法標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化。附圖說明0023 圖1氨基酸樣本處理和檢測過程0024 圖230種氨基酸總離子流圖0025 圖3氨基酸同分異構(gòu)體基線分離圖具體實(shí)施方式0026 1、適用儀器0027 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(LC-MS/MS)，配備電噴霧離子源(ESI)。0028 2、樣本要求0029 血漿樣本:采集靜脈全血樣本，置于抗凝管中，采血后立即顛倒混勻56次，于30min以內(nèi)離心分離血漿，_20C冰凍保存待測。0030 尿樣、腦脊液:取樣后直接-20C冰凍保存待測。0031 組織樣本:生物組織或研磨或勻漿處理并用有機(jī)溶

15、劑充分提取后，高速離心取上清液，用提取試劑稀釋到合適的濃度，-20C冰凍保存待測。0032 其它需測定游離氨基酸的樣本:充分溶解或浸泡后，用甲醇水(I: lv/v)充分提取，高速離心取上清液，用提取試劑稀釋到合適的濃度，-20C冰凍保存待測。0033 其它需測定全部氨基 酸的樣本:稱取一定量樣本，加入適量的鹽酸mol/L)，密封，110C高溫水解24h，水解完自然冷卻后，取出水解液過0.45 m水系濾膜。所得濾液取一定量在50C下氮?dú)獯蹈?，用甲醇?I: lv/v)復(fù)溶并稀釋到合適的濃度，-20C冰凍保存待測。0034 3、檢驗(yàn)前準(zhǔn)備0035 濃縮儲備液的配制:取“穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)凍干粉”用2m

16、L甲醇充分溶解，混勻，即為濃縮儲備液，分裝，密封4C保存待用，使用效期I個月。0036日常工作液的配制:取濃縮儲備液，甲醇稀釋100倍，分裝，密封4C保存待用，使用效期I周。0037 衍生化試劑的配制(鹽酸正丁醇):衍生化試劑組分A-衍生化試劑組分B (95: 5v/v)，混勻，密封4C保存待用。0038 復(fù)溶液的配制:乙腈-水(4: lv/v)，混勻，密封4C保存待用。0039 4、檢驗(yàn)方法0040 全血樣本前處理:0041 取10 L樣本置于1.5mL EP管中，加入日常工作液100 L，13200r/min離心2min。將離心后的上清液直接轉(zhuǎn)移到另一 1.5mL EP管中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下50

17、C吹干，加入60 L衍生化試劑，密封，渦旋30s，瞬時離心，65C孵育15min進(jìn)行衍生化。衍生后的溶液再次瞬時離心，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下5(TC吹干。加入100 L復(fù)溶液復(fù)溶,潤旋30s, 13200r/min離心2min,進(jìn)樣5 L進(jìn)行LC-MS/MS分析。0042 質(zhì)譜條件:0043 離子源:電噴霧離子源(ESI)，正離子方式檢測；離子噴射電壓:5500V;溫度:5800C ;源內(nèi)氣體I (GSl，N2)壓力:55ps1.;氣體2(GS2，N2)壓力:60ps1.;氣簾氣體(N2)壓力:20ps1.;掃描方式為多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM);碰撞氣(N2)壓力=Medium ;解簇電壓(DP)為:35V

18、 ;碰撞能量(CE)為:30eV ;30種氨基酸用于定量分析的離子對見表I,同位素標(biāo)記的氨基酸內(nèi)標(biāo)及用于定量分析的離子對見表2。0044 表130種氨基酸及用于定量分析的離子對00450046 色譜條件:0047色譜柱:C18 柱(150 X 4.6mm，5 m 粒徑);0048 流動相:含0.1 %流動相調(diào)節(jié)液A和0.01 %流動相調(diào)節(jié)液B的乙腈-含0.1 %流 動相調(diào)節(jié)液A和0.01 %流動相調(diào)節(jié)液B的水溶液，梯度洗脫；0049柱溫:50C ;進(jìn)樣量:5 L00050 測定法:0051 取處理好的質(zhì)控樣本和待測樣本溶液各5 L注入液質(zhì)聯(lián)用儀，記錄色譜圖。0052 質(zhì)控要求:0053 每I分

19、析批樣本隨行2個質(zhì)控樣本(質(zhì)控樣本A和質(zhì)控樣本B)。質(zhì)控樣本測定結(jié)果偏差應(yīng)小于20%。如質(zhì)控樣本測定結(jié)果不符合上述要求，則該分析批樣本測試結(jié)果作廢，重新檢測。0054 表2氨基酸內(nèi)標(biāo)及用于定量分析的離子對00550058 5、結(jié)果計(jì)算:0059回收率的計(jì)算:計(jì)算質(zhì)控樣本A和質(zhì)控樣本B對應(yīng)的精氨酸和苯丙氨酸的濃度。質(zhì)控樣本回收率的計(jì)算公式為:回收率()=測定濃度/標(biāo)示濃度X100，回收率()應(yīng)在10020%范圍內(nèi)。0060 樣本結(jié)果計(jì)算:提取30種氨基酸對應(yīng)的樣本和內(nèi)標(biāo)的MRM離子流圖，進(jìn)行積分處理。每5 L進(jìn)樣中，含有12.5pmol從日常工作液中帶入的精氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、天門冬氨酸、瓜氨酸、谷氨酸、纈氨酸、酪氨酸、丙氨酸、鳥氨酸同位素內(nèi)標(biāo)衍生物，62.