蟲(chóng)草多糖的分離純化及含量測(cè)定

1、蟲(chóng)草多糖的分離純化及含量測(cè)定冬蟲(chóng)夏草首載于本草從新，味甘,性溫，歸肺、腎經(jīng)，具補(bǔ)肺益腎，止血化 痰之功效。冬蟲(chóng)蟲(chóng)草中含量最高的活性物質(zhì)是蟲(chóng)草多糖 ，因其可以抗氧化、抗腫 瘤和增強(qiáng)免疫力等功效而受廣大人群青睞，由于天然的活性成分來(lái)源有限，現(xiàn)多 采用人工發(fā)酵法生產(chǎn)制備。作者用苯酚-硫酸法測(cè)定蟲(chóng)草多糖含量。1?材料?供試材料蟲(chóng)草菌株（青海省）;蒸餾水（雙蒸水）、發(fā)酵液精多糖I和菌絲體精多糖n ;葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（100卩g/mL）等。?儀器及設(shè)備培養(yǎng)箱（常州市恒久儀器制造有限公司光照培養(yǎng)箱）;高壓蒸汽滅菌設(shè)備 （雞西辰豐醫(yī)療器械制造有限公司型立式壓力蒸汽滅菌器）;大容量離心機(jī)（北京 時(shí)代北利離心機(jī)有限

2、公司 GTR10-2）;紫外分光光度計(jì)（上海悅豐儀器儀表有限公 司）等。?培養(yǎng)基配方?活化培養(yǎng)基（g/mL）?蔗糖溶液，葡萄糖溶液，蛋白胨，酵母粉，瓊脂,KH2PO4 %,gSO4 7H2O 5%,pH 自然,培養(yǎng)溫度 27C。?發(fā)酵培 養(yǎng)基 （g/mL）?葡萄糖，蛋白胨，酵母粉5%, KH2PO4 %,MgSO47H2O 5%, pH 自然，溫度 27C。2?方法?配制培養(yǎng)基和滅菌按體積向培養(yǎng)基中加入蒸餾水，加熱煮沸,調(diào)節(jié)pH值至中性，趁熱倒入 容器中。高壓蒸汽滅菌，溫度C ,時(shí)間20 min。滅菌完成，趁熱倒在平板上。?活化菌種在無(wú)菌條件下，將冷凍完好的菌種接到培養(yǎng)基上，無(wú)光條件下27C培

3、養(yǎng), 培養(yǎng)菌絲潔白并生長(zhǎng)旺盛且無(wú)雜菌后備用。?配制發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)把培養(yǎng)基上的菌種快速接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在27C條件下,無(wú)光培養(yǎng)192 h。?發(fā)酵液多糖的分離純化?發(fā)酵液及透析袋的處理？發(fā)酵液在4 000 r/min條件下離心20 min,過(guò) 濾得到上清液和沉淀（菌絲體）。將透析袋分成小段后，處理后在4C條件下存放 于冰箱保存待用。?發(fā)酵液多糖的提??？醇沉：將無(wú)水乙醇以3倍體積加于發(fā)酵液中，離心后得上清液,4 C條件靜置12 h后,在4 000 r/min 離心15 min,過(guò)濾得沉淀，用 乙醇洗滌。脫蛋白：用熱水將發(fā)酵液粗多糖溶解，冷卻后反復(fù)3次去蛋白。脫色： 多糖溶液加舌性碳去色素，透析

4、:將脫色后的蟲(chóng)草多糖溶液裝入透析袋中，在蒸 餾水中透析24 h,將3倍體積乙醇加于透析后溶液中，在4C條件下沉淀過(guò)夜，離 心得沉淀物并干燥，制得發(fā)酵液精多糖。?沉淀物的處理？用研缽研碎發(fā)酵所制得的菌絲體，加蒸餾水至體積的10倍,水浴加熱96100C條件下浸提3 h,反復(fù)浸提3次并將濾液合并，加入95% 乙醇至4倍體積并低溫沉淀過(guò)夜，離心制得沉淀，然后用乙醇和丙酮各洗滌2次， 干燥,得粗多糖。?發(fā)酵液多糖的測(cè)定?制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線？將葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（100卩g/mL）、mL加入 試管中，加蒸餾水至mL。用移液管分別移取mL加入比色管中。滴入重蒸苯酚溶 液mL,震動(dòng)搖晃均勻，立即加入濃硫酸mL搖勻

5、，靜置10 min,水浴加熱30 min, 溫度40C。在波長(zhǎng)490 nm處,測(cè)定每個(gè)管的吸光度，得A值（以mL蒸餾水作為空白）。 橫坐標(biāo)為蔗糖濃度，縱坐標(biāo)為吸光度A做標(biāo)準(zhǔn)曲線，制得回歸方程:y= 3x+ 9。?測(cè)定樣品含量？將干燥至恒重的發(fā)酵液精多糖50 mg,用減量法稱取后 放置在100 mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，作標(biāo)號(hào)I。取樣品液I mL, 按剛制得的標(biāo)準(zhǔn)曲線方法，測(cè)定多糖溶液A值，平行測(cè)定3次。計(jì)算得出含量。3?結(jié)果?蟲(chóng)草多糖含量測(cè)定冬蟲(chóng)夏草的產(chǎn)地不同，提取率也不同，其有效成分多糖的含量用苯酚一硫酸法測(cè)定結(jié)果也不同，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。?與蒽酮一硫酸法比較取北蟲(chóng)草子實(shí)體，用蒽

6、酮一硫酸法進(jìn)行測(cè)定，得到4個(gè)樣品的多糖含量 數(shù)值分別為% % % %,但是這種測(cè)定方法對(duì)于測(cè)定蟲(chóng)草發(fā)酵液的胞外多糖重現(xiàn) 性不好,對(duì)測(cè)定結(jié)果的少部分蛋白影響較大。4?討論?濃硫酸對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響必須快速滴加濃硫酸，這樣才能使高溫瞬時(shí)產(chǎn)生，有利于多糖完全水解， 如果滴加硫酸過(guò)慢，則不能產(chǎn)生高溫條件，則多糖水解不完全，會(huì)給測(cè)定結(jié)果造成誤差。?苯酚對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響苯酚應(yīng)配制成一定濃度的溶液，并且在整個(gè)檢測(cè)過(guò)程中滴加苯酚動(dòng)作要 迅速,避免苯酚氧化變性，對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生影響?，F(xiàn)在蟲(chóng)草多糖的檢測(cè)方法中，主要測(cè)定是粗多糖含量。用苯酚一硫酸法 測(cè)定時(shí),不需要蟲(chóng)草多糖的純品和高級(jí)精密儀器，優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高、準(zhǔn)確性高、精 確度高、重現(xiàn)性好、簡(jiǎn)單快速等優(yōu)點(diǎn)，可以作為對(duì)蟲(chóng)草多糖含量測(cè)定的最佳選擇 方法之一。參考文獻(xiàn)袁建國(guó),程顯好,侯永勤,等.功能因子冬蟲(chóng)夏草多糖的研究開(kāi)發(fā)J.中 國(guó)食品添加劑，1999(2):18-22.韓永萍,林強(qiáng)，何緒文.蟲(chóng)草菌絲體多糖的提取研究J.中國(guó)食用菌,20XX (6) :53-55.來(lái)永斌,王琦,孫月.蛹蟲(chóng)草多糖含量的測(cè)定及分析J.中成藥,20XX,23(7):517-518.閆文娟,李泰輝，唐芳永.廣東蟲(chóng)草多糖的提取及含量測(cè)定J.華南農(nóng) 業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),20XX(30