課題申報書肝移植中移植排斥反應(yīng)新機制的研究

1、（一）立項依據(jù)與研究內(nèi)容（4000-8000字）1.項目的立項依據(jù)（研究意義、國內(nèi)外研究現(xiàn)狀及分析，附主要參考文獻目錄。）（基礎(chǔ)研究需結(jié)合科學(xué)研究發(fā)展趨勢來論述科學(xué)意義；應(yīng)用研究需結(jié)合國民經(jīng)濟和社會發(fā)展中迫切解決的關(guān)鍵科技問題來論述其應(yīng)用前景。）目前，移植排斥反應(yīng)仍然是制約肝移植療效的主要原因。雖然由于免疫抑制劑的臨床應(yīng)用，肝移植的1年的存活率大幅度提高，已超過了80%。但是終生服用免疫抑制劑不僅成為患者沉重的經(jīng)濟負擔(dān)，而且造成機體的免疫功能低下，可能促進肝炎及腫瘤復(fù)發(fā)，誘發(fā)感染、腫瘤等疾病。因此，找尋誘導(dǎo)特異性移植耐受的新方法，是克服移植排斥反應(yīng)的最佳途徑。特異性移植耐受是指在無需使用免疫抑

2、制藥物的情況下，受者的免疫系統(tǒng)對同種異體或異種供體抗原長期不發(fā)生免疫反應(yīng)，而對其它抗原可發(fā)生正常免疫應(yīng)答的狀態(tài)。目前認(rèn)為，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫耐受涉及免疫清除、免疫失能、免疫抑制和免疫忽視四類機制1。根據(jù)以上誘導(dǎo)免疫耐受的機制，學(xué)者們發(fā)展出許多誘導(dǎo)移植耐受的新方法2：(1)在胸腺內(nèi)直接注射表達供體抗原的細胞，在胸腺內(nèi)通過克隆清除誘導(dǎo)免疫耐受。(2)利用骨髓移植造成造血細胞嵌合體誘導(dǎo)耐受。(3)阻斷t細胞活化的共刺激信號通路。(4)輸注供體樹突狀細胞(dentritic cell，dc)誘導(dǎo)耐受。(5)針對t細胞粘附和活化相關(guān)分子的單克隆抗體：抗t細胞及t細胞亞群的單抗；抗粘附分子或細胞因子的單抗。

3、(6)其它特異性免疫抑制的方法：合成肽阻斷tcr對同種異體抗原的識別；合成肽阻斷趨化因子及其受體。以上方法均不同程度地誘導(dǎo)了對供體抗原的耐受，但它們存在如下不足：(1)成年人胸腺已經(jīng)萎縮，無法在胸腺內(nèi)直接注射表達供體抗原的細胞，故該方法適用范圍大大受限。(2)供體骨髓移植能誘導(dǎo)部分耐受，但不易控制嵌合程度，移植物抗宿主病(graft versus host disease，gvhd)的發(fā)生率大大增加。(3)dc誘導(dǎo)的淋巴細胞失能狀態(tài)可通過給予外源性il-2而逆轉(zhuǎn)；感染或其它因素引起機體強烈的免疫應(yīng)答，產(chǎn)生大量的il-2等細胞因子也可以通過旁效應(yīng)解除失能的細胞克??；失能狀態(tài)的維持需要抗原的持續(xù)存

4、在，抗原的去除也能逆轉(zhuǎn)失能。(4)阻斷協(xié)同刺激通路、應(yīng)用針對t細胞粘附和活化相關(guān)分子的單克隆抗體、合成肽阻斷tcr對同種異體抗原的識別、阻斷趨化因子及其受體等方法能誘導(dǎo)出確切的免疫抑制，但是其作用范圍是全身性的、非特異性的，且一旦中止阻斷劑的供給，則移植耐受消失?？傊?目前誘導(dǎo)移植耐受的方法存在非特異性、容易逆轉(zhuǎn)、實際操作困難等缺陷。肝移植排斥反應(yīng)啟動時，首先表現(xiàn)為淋巴細胞對匯管區(qū)中央靜脈周圍的浸潤，隨著排斥反應(yīng)的進展，淋巴細胞的損傷導(dǎo)致小葉間膽管上皮細胞、中央靜脈內(nèi)皮細胞的炎癥，最后波及匯管區(qū)周圍的肝實質(zhì)細胞，造成廣泛的肝臟炎性反應(yīng)。因此肝移植排斥反應(yīng)的過程是從匯管區(qū)啟動，進而擴展至小葉間

5、膽管上皮細胞、中央靜脈內(nèi)皮細胞、匯管區(qū)周圍的肝實質(zhì)細胞。移植排斥反應(yīng)發(fā)生時，ctl細胞在活化后可以通過以下兩條途徑殺傷靶細胞：(1)穿孔素/顆粒酶途徑。(2)fas/fasl途徑：在ctl細胞識別靶細胞后，細胞表面表達的高水平fasl與靶細胞表面的fas相互識別，通過fas觸發(fā)靶細胞內(nèi)部的凋亡程序，使靶細胞發(fā)生程序性死亡。體外實驗證實兩條途徑相互獨立。然而體內(nèi)實驗證實單一阻斷fas/fasl途徑即可抑制ctl對靶細胞的殺傷，其原因可能與體內(nèi)環(huán)境有關(guān)28. 誘騙受體3(decoy receptor 3，dcr3)是一種新發(fā)現(xiàn)的可結(jié)合fasl的可溶性tnfr超家庭成員，rna印跡表明dcr3 mr

6、na 表達于胎肺、腦、肝及成人脾、結(jié)腸和肺，特別是在肺癌和結(jié)腸癌細胞系的表達很高，也可由t細胞絲裂原激活的外周血單核細胞分泌。dcr3 分子質(zhì)量為35kda，肽鏈長300個氨基酸殘基。dcr3 的配體是light、fasl、tl1a。其主要作用有：(1)與fas競爭性結(jié)合fasl，阻斷fasl所誘導(dǎo)的細胞凋亡，這一作用可以減弱ctl和nk細胞對靶細胞的殺傷14。(2)通過抑制light與hvea 或tr2之間的雙向信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、tl1a至dcr3的單向信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來抑制t細胞激活。7 (3)抑制cxcl12/基質(zhì)細胞來源的因子1(sdf-1) 、fasl對t細胞的趨化作用，從而減少cd4+和cd8+t

7、細胞對腫瘤的浸潤。25. 27(4)通過調(diào)節(jié)dc分化和成熟從而抑制cd4+ t細胞增生。20(5)抑制t細胞偽足形成，阻止它們形成不可分離的細胞簇從而調(diào)節(jié)t細胞與其它細胞如apc的相互作用。7因此根據(jù)其作用機理，人們推測其可能有以下四方面的作用(1)腫瘤細胞逃避免疫監(jiān)視。（2）抗炎作用。(3)致癌作用。（4）誘導(dǎo)移植耐受。目前的研究工作已經(jīng)肯定dcr3基因?qū)δ[瘤細胞逃避免疫監(jiān)視、抑制炎癥反應(yīng)的作用，但dcr3基因的高表達與細胞癌變無相關(guān)性，不是癌基因。wu等證實dcr3減少了fasl、ifn-誘導(dǎo)的胰島細胞凋亡及胰島素釋放，可防止同種異基因胰島移植時的胰島原發(fā)性無功能。2zhang等于心臟移植

8、術(shù)前一天開始連續(xù)7天靜脈注射dcr3，小鼠心臟存活時間比對照組延長3.3天，提示dcr3可以減弱t細胞對同種異體抗原的反應(yīng)。24我們利用腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus, aav)（aav helperfree system, stratagene 公司）作為dcr3基因的載體，將aav病毒顆粒從門靜脈、肝動脈、膽管注入冷保存時的供肝，成功實現(xiàn)了dcr3基因在供肝的表達，在沒有使用免疫抑制劑的情況下，供肝正常存活了105天（目前仍然存活，繼續(xù)觀察中），而對照組僅存活了15天（見研究工作基礎(chǔ)）。aav helperfree system的特點有：病毒載體產(chǎn)生、效價滴定階段

9、均不需野生型腺病毒共感染，因此有極高的生物安全性、宿主的免疫反應(yīng)極??；aav可感染的細胞類型廣泛，感染不依賴于活躍的細胞分裂；aav病毒滴度高，常規(guī)可達107病毒顆粒/ml，經(jīng)濃縮可達1012病毒顆粒/ml；aav在允許復(fù)制的條件下可在染色體外復(fù)制，在不能復(fù)制的條件下可以5-10%的效率定點整合入宿主19號染色體的一個2-4kb的區(qū)域，因此aav被證明有應(yīng)用于基因長期表達的價值。我們目前的研究工作的特色有：（1）證明了腺相關(guān)病毒攜帶的dcr3基因可以誘導(dǎo)肝移植耐受。(2)采用aav helperfree system克服了逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低、隨機整合入受者染色體中而致腫瘤的危險的缺點1以

10、及腺病毒載體雖然有較高的轉(zhuǎn)導(dǎo)率,但因不能在染色體外復(fù)制或整合入受者染色體中,目的基因只能一過性表達的缺點2。我們目前研究工作的缺陷有：（1）dcr3基因僅在肝臟血管內(nèi)皮細胞、膽管上皮細胞表達，而急性排斥反應(yīng)啟動時ctl細胞首先浸潤的是匯管區(qū)的中央靜脈周圍，因此它尚不能阻止急性排斥反應(yīng)的啟動，僅能阻止ctl細胞血管內(nèi)皮細胞、膽管上皮細胞的攻擊。（2）dcr3基因轉(zhuǎn)染的血管內(nèi)皮細胞、膽管上皮細胞是成熟的細胞。雖然攜帶dcr3基因的aav可在染色體外復(fù)制或整合入宿主基因組而使dcr3基因存在長期表達的可能，但是成熟細胞存在新老交替，dcr3基因的表達隨著細胞的死亡而消失。因此為了完善我們目前的研究工

11、作，我們需要作以下的改進：（1）將dcr3基因的表達定位于匯管區(qū)中央靜脈周圍，抑制排斥反應(yīng)的啟動。如能進一步將dcr3基因表達于血管內(nèi)皮細胞、膽管上皮細胞、肝細胞，則更能防止個別活化的ctl細胞對它們的攻擊，從而形成抑制排斥反應(yīng)的“雙保險”。（2）實現(xiàn)dcr3基因的持續(xù)表達。肝干細胞（hepatic stem cell，hsc）是指具有自我更新能力和具有分化形成肝細胞與膽管細胞潛能的原始細胞。最近有人證實它尚可分化為血管內(nèi)皮細胞(gao z, mcalister vc, williams gm. repopulation of liver endothelium by bone-marrow-

12、derived cells. lancet. 2001 mar 24;357(9260):932-3.) 11。肝干細胞的基本特征可概括為兩點：具有多向分化能力，可向肝細胞、膽管上皮細胞、肝臟血管內(nèi)皮細胞分化。具有自我更新與自我維持能力，對肝臟損傷或疾病產(chǎn)生反應(yīng)并進行修復(fù)。其形態(tài)特點是細胞體積小、核大而胞質(zhì)少、呈卵圓形、具有特殊的表面標(biāo)志如afp、肝細胞標(biāo)志（白蛋白）、膽管上皮細胞標(biāo)志（ck7、ck19）以及肝細胞、膽管上皮細胞共有的標(biāo)志(ck8、ck18)。目前有人證實其尚有血管內(nèi)皮細胞的標(biāo)志。該類細胞不僅在胚胎肝組織中存在，而且在成年肝組織中也存在。肝內(nèi)的肝干細胞稱為卵圓細胞(hepati

13、c oval cell，hoc)或小肝細胞。它們在正常情況下位于肝臟匯管區(qū)的hering小管d，當(dāng)肝臟受到損傷（肝毒性藥物、手術(shù)、創(chuàng)傷、缺血再灌注等）時，它們迅速增生分化，補充受損的肝細胞、膽管上皮細胞、肝臟血管內(nèi)皮細胞分化，因而被稱為肝干細胞池a。目前大量文獻證實，肝臟損傷時，肝臟有三個水平的細胞修復(fù)：肝細胞、hering 小管的雙向干細胞、hering小管周圍的來自骨髓的肝干細胞。骨髓來源的干細胞可定居于hering小管周圍，在肝臟損傷時發(fā)揮修復(fù)作用k。theise nd等通過三維觀測得出hering 小管、匯管區(qū)周圍是肝干細胞存在的場所的結(jié)論g。petersen 證實肝內(nèi)存在骨髓來源的干

14、細胞，theise 大鼠2%，人4-40%。alison0.5-2%(hsc8,78,79)。lagasse 30%.認(rèn)為hering管可能是人肝干細胞起源分化及滯留場所(theisend,saxenar,portmannbc,etal.thecanalsofheringandhepaticstemcellsinhumansj.hepa-tology,1999,30:1425-1433.)肝干細胞的肝外來源包括胰腺的上皮細胞、胰島前體細胞、骨髓造血干細胞3,4。自1999年petersen等發(fā)現(xiàn)肝卵圓細胞可來源于骨髓后,從骨髓細胞中鑒定肝干細胞成為近年研究的熱點。目前研究證實從骨髓中分離純化的

15、造血干細胞的多個亞群在一定的微環(huán)境或細胞因子的誘導(dǎo)下可分化為肝干細胞b。目前,在骨髓中已發(fā)現(xiàn)多種細胞亞群具有分化為肝細胞的潛能,如ktls細胞(c-kithighthylowlin-sca-1+)h、2-m-thy-1+細胞12、cd44-cd45-hla-c-kit-的多能成體前體細胞(multipotent adult progenitor cells, mapc)i及c1qrp+細胞(lin-cd45+cd38-cd34+/-)j等。這些細胞均涉及多個不同的表面標(biāo)志,可能代表著骨髓干細胞的不同發(fā)育階段或譜系中的不同分支。這些細胞因子肯定存在于細胞的微環(huán)境中，包括細胞外基質(zhì)中參與粘附過程的

16、信號分子以及參與正常細胞發(fā)育、分化、成熟的細胞因子b e。petersen 等l、theise等m,n和alison等o的研究相繼指出,骨髓干細胞或造血干細胞能夠在鼠肝內(nèi)轉(zhuǎn)化成為肝卵圓細胞甚至成熟的肝細胞和膽管細胞,并同時證明這種現(xiàn)象也存在于人類體內(nèi)。用高濃度的肝細胞生長因子(hgf)誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的大鼠骨髓細胞,rt-pcr檢測到白蛋白及afp的表達,免疫細胞化學(xué)也證實了經(jīng)誘導(dǎo)的細胞出現(xiàn)了afp、白蛋白及ck8/18等肝前體細胞的特征性表達。應(yīng)用磁株細胞篩選法分離人或大鼠骨髓細胞中的2m-thy-1+細胞,能夠表達肝細胞的特征p。這些骨髓來源的肝干細胞(bdhsc)肝內(nèi)移植后很快就整合入肝板,

17、并且分化為成熟的肝細胞,而在體外培養(yǎng)的過程中加入膽汁化血清可促進它們向肝細胞方向分化。蔡云峰等用免疫磁珠法成功分離出骨髓干細胞的多個亞群，并證明大鼠骨髓內(nèi)2微球蛋白陰性(2 m- ) 細胞經(jīng)體外培養(yǎng)誘導(dǎo)后呈多角形細胞表現(xiàn), 白蛋白、afp、 ck8 / 1 8表達陽性，其他干細胞類型未見類似變化。提示該亞群骨髓干細胞有向肝干細胞分化的能力。我們參照他們介紹的方法成功分離了1.5105數(shù)量級的肝干細胞純度為95%，培養(yǎng)7天后可達2106數(shù)量級。經(jīng)免疫組化染色證明其有肝細胞、膽管上皮細胞、血管內(nèi)皮細胞的特異性標(biāo)志，因此推測其可能分化為以上3種細胞（見研究工作基礎(chǔ)）。這些研究結(jié)果都說明骨髓細胞中存在

18、有能分化為肝細胞的干細胞群。肝臟基因治療的一大難題是被用作基因修飾的成熟肝細胞在體外不易擴增和傳代，肝干細胞具有強大的增殖能力，即使經(jīng)過基因修飾仍有可能傳代，這為克服目前基因治療中的主要問題開辟了新的途徑。以肝干細胞作為載體具有一次性介入，永久性治療的特點，且永生化的肝干細胞無致癌的危險性f。基于以上研究成果，我們設(shè)想利用肝干細胞在肝臟匯管區(qū)中央靜脈周圍的靶向定植并在必要時分化補充受損或衰老的血管內(nèi)皮細胞、膽管上皮細胞、肝細胞的生物學(xué)特性，以腺相關(guān)病毒為載體將dcr3基因轉(zhuǎn)入從雄性近交系wistar大鼠骨髓中分離純化的肝干細胞，將雌性近交系wistar大鼠肝臟植入雌性近交系lewis大鼠，同時

19、將轉(zhuǎn)染dcr3基因的肝干細胞經(jīng)門靜脈注入移植后的肝臟。dcr3基因隨著肝干細胞的定植主要在匯管區(qū)持續(xù)表達，必要時部分隨著肝干細胞的進一步分化而表達在血管內(nèi)皮細胞、膽管上皮細胞、肝細胞，從而在啟動（主要）、攻擊（次要）兩個環(huán)節(jié)抑制排斥反應(yīng)的發(fā)生。dcr3基因強大的免疫抑制作用被局限在肝臟之中，從而誘導(dǎo)出特異針對肝臟的移植耐受狀態(tài)。參考文獻1. arnold b. levels of peripheral t cell tolerance. transplantation immunology. 2002,10(2-3):109-1142. goddard s, adams dh. new app

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31、4根據(jù)y染色體及aav病毒載體自帶的綠色熒光蛋白（gfp）標(biāo)志確定轉(zhuǎn)基因肝干細胞在供肝中的定植、分布情況。2.1.5檢測轉(zhuǎn)入肝干細胞的dcr3基因在供肝中的表達情況。2.1.6觀測肝移植術(shù)后移植排斥反應(yīng)的發(fā)生情況。2.2研究目標(biāo)：本課題擬構(gòu)建攜帶dcr3基因的腺相關(guān)病毒，將其轉(zhuǎn)染雄性近交系wistar大鼠骨髓來源的肝干細胞；將雌性近交系wistar大鼠肝臟植入雌性近交系lewis大鼠，同時將轉(zhuǎn)染dcr3基因的肝干細胞經(jīng)門靜脈注入移植后的肝臟；使dcr3基因在供肝中長期表達，從而誘導(dǎo)特異針對肝臟的移植耐受狀態(tài)。探討：(1)轉(zhuǎn)基因肝干細胞在供肝中的定植、分布情況。(2)轉(zhuǎn)入肝干細胞的dcr3基因在

32、供肝中的表達情況。(3)轉(zhuǎn)基因肝干細胞在供肝中的分布及其基因表達與移植耐受的關(guān)系。2.3擬解決的關(guān)鍵問題2.3.1腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染肝干細胞的效率：干細胞的基因轉(zhuǎn)染難度較大，是本課題的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。本課題成員（刪去）于2001年用腺病毒成功感染了神經(jīng)干細胞，成功率約 80%90%，且經(jīng)傳代培養(yǎng) 12代后仍具干細胞特性。腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染效率高于腺病毒，轉(zhuǎn)染的細胞類型較腺病毒更廣泛。因此本課題組有能力完成腺相關(guān)病毒對肝干細胞的轉(zhuǎn)染。2.3.2轉(zhuǎn)基因肝干細胞在供肝匯管區(qū)中定植的數(shù)量：肝干細胞在匯管區(qū)的定植數(shù)量與肝臟受到的損傷程度有關(guān)。損傷越重，肝干細胞在匯管區(qū)的定植數(shù)量越多，反之亦然。肝移植時肝臟缺血再灌

33、注對肝臟已是一種損傷，為了進一步提高肝干細胞在匯管區(qū)的定植數(shù)量，可在冷保存時切除大鼠肝臟的一葉，然后完成肝移植。3.擬采取的研究方案及可行性分析。（包括有關(guān)方法、技術(shù)路線、實驗手段、關(guān)鍵技術(shù)等說明）3.1研究方案3.1.1 dcr3基因的克隆，參照pitti rm等介紹的方法進行。3.1.2構(gòu)建攜帶dcr3基因的腺相關(guān)病毒載體，并用其感染aav293細胞進行體外表達鑒定、收集aav病毒顆粒備用。3.1.3從雄性近交系wistar大鼠股骨、脛骨抽取骨髓，分離肝干細胞并進行純化、鑒定，參照itzhak avital等介紹的方法進行。3.1.4腺相關(guān)病毒載體轉(zhuǎn)染肝干細胞，采用直接感染方法。3.1.5

34、體外試驗：表達dcr3基因的肝干細胞抑制fasl誘導(dǎo)淋巴細胞凋亡試驗；表達dcr3基因的肝干細胞抑制fasl誘導(dǎo)的淋巴細胞趨化試驗3.1.6動物實驗：大鼠肝移植采用袖套法，移植完成時將轉(zhuǎn)染dcr3基因的肝干細胞經(jīng)門靜脈注入肝臟；分別于術(shù)后3天、7天、14天、21天、28天取血液及肝臟標(biāo)本，采用常規(guī)生化法檢測肝功能，northern blot、western blot檢測dcr3基因在肝臟中的表達情況，免疫組化法檢測受體cd4+、cd8+淋巴細胞在供肝中的浸潤情況，tunel法檢測供肝中細胞凋亡情況，常規(guī)石蠟切片he染色觀察移植排斥反應(yīng)的發(fā)生情況。3.2技術(shù)路線構(gòu)建攜帶dcr3基因的腺相關(guān)病毒載

35、體載體體外表達鑒定、收集aav病毒顆粒轉(zhuǎn)染從雄性近交系wistar大鼠股骨、脛骨抽取骨髓，分離、純化hsc體外試驗：表達dcr3基因的肝干細胞抑制fasl誘導(dǎo)淋巴細胞凋亡試驗、抑制fasl誘導(dǎo)的淋巴細胞趨化試驗植入雌性近交系lewis大鼠 動物實驗：分別于術(shù)后3天、7天、14天、21天、28天取血液及肝臟標(biāo)本，采用常規(guī)生化法檢測肝功能，northern blot、western blot檢測dcr3基因在肝臟中的表達情況，免疫組化法檢測受體cd4+、cd8+淋巴細胞在供肝中的浸潤情況，tunel法檢測供肝中細胞凋亡情況，常規(guī)石蠟切片he染色觀察移植排斥反應(yīng)的發(fā)生情況切取雌性近交系wistar大

36、鼠 肝臟經(jīng)門靜脈注入供肝3.3可行性分析3.3.1理論上，骨髓來源的肝干細胞是肝臟匯管區(qū)卵圓細胞、嗜堿性小肝細胞的前體細胞。研究證明經(jīng)門靜脈注入的肝干細胞定植的肝臟匯管區(qū)的hering小管，可分化為血管內(nèi)皮細胞、膽管上皮細胞、肝細胞。匯管區(qū)是肝移植排斥反應(yīng)時ctl細胞首先浸潤的區(qū)域，血管內(nèi)皮細胞、膽管上皮細胞、肝細胞是ctl細胞攻擊的靶細胞。因此肝干細胞將轉(zhuǎn)染的免疫抑制基因帶入肝臟并匯管區(qū)及血管內(nèi)皮細胞、膽管上皮細胞、肝細胞中持續(xù)表達，從而誘導(dǎo)特異針對肝臟的移植耐受狀態(tài)在理論上是可行的。3.3.2本研究所涉及的技術(shù)均為成熟的免疫學(xué)技術(shù)；本研究所擁有本研究所需的設(shè)備和條件。4.本項目的特色與創(chuàng)新

37、之處。本研究利用了肝干細胞在肝臟定植、分化的靶向性，將其作為免疫抑制分子的載體，使非特異性的免疫抑制分子的作用局限于肝臟之中，克服了免疫抑制分子作用范圍過大的缺點，從而誘導(dǎo)特異針對肝臟的移植耐受狀態(tài)。5.年度研究計劃及預(yù)期研究結(jié)果。（包括擬組織的重要學(xué)術(shù)交流活動、國際合作與交流計劃等）年度研究計劃2005.01-2005.09dcr3基因的克隆，構(gòu)建攜帶dcr3基因的腺相關(guān)病毒載體備用。2005.10-2006.06分離、純化、鑒定雄性近交系大鼠骨髓來源的肝干細胞，并用腺相關(guān)病毒進行轉(zhuǎn)染；dcr3基因的體外表達鑒定；所轉(zhuǎn)染的dcr3基因的體外功能實驗。2006.07-2007.06完成肝移植的

38、動物模型，將轉(zhuǎn)染后的肝干細胞經(jīng)門靜脈注入肝臟。按期取肝臟標(biāo)本，根據(jù)y染色體標(biāo)志染色及gfp，確定轉(zhuǎn)基因肝干細胞在供肝中的定植、分布情況；檢測轉(zhuǎn)入肝干細胞的基因在肝臟中的表達情況；移植排斥反應(yīng)的發(fā)生情況。2007.07-2007.12補充實驗遺漏，整理實驗資料，統(tǒng)計處理實驗數(shù)據(jù)，撰寫論文。預(yù)期研究結(jié)果1.證明轉(zhuǎn)染dcr3基因的肝干細胞能在供肝匯管區(qū)及部分血管內(nèi)皮細胞、膽管上皮細胞、肝細胞中持續(xù)表達，同時誘導(dǎo)出長期的肝移植免疫耐受。2.在國外學(xué)術(shù)期刊上發(fā)表論文2-3篇，在國內(nèi)核心期刊發(fā)表論文6-8篇，并在國內(nèi)學(xué)術(shù)會議交流。(二）研究基礎(chǔ)與工作條件1.工作基礎(chǔ)（與本項目相關(guān)的研究工作積累和已取得的研

39、究工作成績）2月底至3月初出結(jié)果。2.工作條件（包括已具備的實驗條件，沿缺少的實驗條件和擬解決的途徑，包括利用國家重點實驗室和部門開放實驗室的計劃與落實情況。）刪去3.申請人簡歷（包括申請者和項目組主要成員的學(xué)歷和研究工作簡歷，近期已發(fā)表與本項目有關(guān)的主要論著目錄和獲得學(xué)術(shù)獎勵情況及在本項目中承擔(dān)的任務(wù)。）刪去（三）經(jīng)費申請說明（要求按照國家自然科學(xué)基金經(jīng)費管理辦法認(rèn)真填寫，購置5萬元以上固定資產(chǎn)及設(shè)備等，須逐項說明與項目研究的直接相關(guān)性及必要性。）（四）其他附件清單（附件材料復(fù)印后隨紙質(zhì)申請書一并上交）（隨紙質(zhì)申請書一同報送的附件清單，如：具有中級技術(shù)職稱申請者的推薦信或在職研究生申請項目的

40、導(dǎo)師推薦信等。）登記序號： 項目編號：中醫(yī)藥、中西醫(yī)結(jié)合科研項目課題設(shè)計書課題名稱：痛痹顆粒對骨關(guān)節(jié)炎細胞凋亡和增殖的機理研究申報單位： 江蘇省中醫(yī)院課題負責(zé)人： 朱萱萱計劃年限：郵政編碼： 210029 聯(lián)系電話： 8661714130306申報日期：江蘇省中醫(yī)藥局制填寫提綱一、立項依據(jù)：與選題直接相關(guān)的國內(nèi)外現(xiàn)狀、水平和發(fā)展趨勢；選題的理論和實踐依據(jù)；研究目的、意義；本研究達到的科學(xué)技術(shù)水平，預(yù)期社會經(jīng)濟效益和應(yīng)用推廣前景。二、科研假說或技術(shù)構(gòu)思，主要研究內(nèi)容、關(guān)鍵技術(shù)、目標(biāo)（達到的主要技術(shù)指標(biāo)或技術(shù)經(jīng)濟指標(biāo)），技術(shù)特征及創(chuàng)新之處，開發(fā)項目應(yīng)說明開發(fā)規(guī)模。三、研究試驗方法及技術(shù)路線（工藝路

41、線）。四、現(xiàn)有工作條件和基礎(chǔ)：開展本項研究的技術(shù)優(yōu)勢，現(xiàn)有的主要儀器設(shè)備及應(yīng)用合格實驗動物的基本條件等；已有工作基礎(chǔ)，預(yù)試驗情況。五、計劃進度：根據(jù)總的研究期限、年度計劃進度，分別列出具體的目標(biāo)和進度的考核指標(biāo)。六、參加（協(xié)作）單位意見及具體分工（附協(xié)議書）。七、經(jīng)費概算（包括其他部門的撥款、貸款、自籌記憶取得的自主）和核算依據(jù)，以及分年度使用計劃。填寫說明一、內(nèi)容填寫自備附頁，用紙大小和封頁一致，字跡清楚，裝訂整齊后按申報要求上報。二、填寫提綱所列內(nèi)容，要全面詳細、如實填寫。三、封面上“登記序號”“項目編號”請勿填寫。1、 立項依據(jù)1.1 研究目的、意義骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis

42、，oa）又稱退行性關(guān)節(jié)病，以關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生彌漫性龜裂、纖維化和脫失及因骨組織增生性變化為特征的一組臨床征候群，是多見于中年以后的慢性進行性關(guān)節(jié)疾患。該病發(fā)病率隨年齡增長而升高，據(jù)調(diào)查，在美國目前2億多人口中，就有骨關(guān)節(jié)炎4500萬，發(fā)病率占總?cè)丝诘?0%，在老年人中所占比例更高，50歲以上人群中，oa的患病率僅次于心血管疾病，位居第二位。在我國，根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，5564歲的人群中發(fā)病率達40%，而65歲以上人群的患病率達60%90%。隨著計劃生育政策的長久實施及經(jīng)濟發(fā)展，我國已進入老齡化社會，oa的發(fā)病率還將越來越高，這不僅嚴(yán)重危害人民的生活、健康，對社會也將造成很大負擔(dān)。同時世界其他國家

43、也面臨著同樣的問題，因而oa引起了國際、國內(nèi)醫(yī)學(xué)界的相當(dāng)重視。近年來對oa的研究頗多，在發(fā)病機制、檢測手段以及治療方法上均取得較大進步，但總的來說還缺乏令人滿意的突破性進展。西藥治療oa的主要手段是非甾體藥，但存在副作用大、作用單一及有較多禁忌癥等缺點。雖然中藥治療oa也取得了一些經(jīng)驗，但對其具體的作用機制有深入研究的卻很少，因此在中醫(yī)理論的指導(dǎo)下，運用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)，對療效確切的中藥復(fù)方進行深入的機理研究，使中藥治療oa的療效在國際先進行列中占一席之地，是擺在我們面前非常重要的課題。1.2 國內(nèi)外現(xiàn)狀水平和發(fā)展趨勢近十年來，國內(nèi)外對oa進行了較深入地研究，大致歸納如下：1.2.1 流行病學(xué)研究

44、已廣泛開展在近100種不同類型的關(guān)節(jié)疾病中，oa是影響人類健康最常見的關(guān)節(jié)疾患之一，沒有明顯的種族和地域差異，本病的患病率隨年齡增加而增高，故隨著人類平均壽命的延長，患病率也有增高的趨勢。felson等報道70歲以下人群膝oa患病率為7%（男6.4%，女11.4%），80歲以上為11.2%（男5.4%，女15.8%）；而放射學(xué)膝oa70歲以上為27.4%（男30.4%，女25.1%），80歲以上為43.7%。butter等報道，44歲以下、4559歲、60歲以上人群中，放射血oa 患病率各為6.2%、21.6%和42.0%。國內(nèi)陳順樂等隊13541名鋼鐵工人的調(diào)查結(jié)果顯示，癥狀性oa患病率2.

45、2%；無癥狀性oa患病率53%，其中3039、4049、5059歲患病率各為11%、27%和62%。汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院統(tǒng)計551例，結(jié)果40歲以下、4049、5059和60歲以上各占12.2%、17.4%、26.1%和44.3%。另外不同關(guān)節(jié)oa易感性不同。美國在衛(wèi)生統(tǒng)計中心調(diào)查結(jié)果，oa患病率以手最高，以下依次為足、膝、髖。國內(nèi)陳順樂等調(diào)查結(jié)果oa是頸椎最多，以下依次為腰椎、膝、手和腕。本病性別差異在脊柱差別不大，但手、膝、髖oa均以女性較多，且女性骨關(guān)節(jié)炎的遺傳易感性較男性高。在framingham的研究中，felaon等發(fā)現(xiàn)女性體重減少11磅，骨關(guān)節(jié)炎形成的風(fēng)險相應(yīng)減少50%。 saase等

46、調(diào)查結(jié)果，膝oa患病率男、女峰值分別為24.7%和54.6%。根據(jù)1994年統(tǒng)計，在美國，骨關(guān)節(jié)炎的消耗為155億美元，約為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的3倍，其中一半以上消耗緣于工作喪失。在我國雖未作全國大范圍的普查，但隨著老齡化社會進程的不斷加快，oa的發(fā)病率會越來越高，這必將給家庭、社會帶來沉重負擔(dān)。1.2.2 病因、發(fā)病機制有了巨大突破目前基礎(chǔ)研究認(rèn)為軟骨的損傷與退變是oa的根本，隨著分子生物學(xué)免疫學(xué)的發(fā)展，近年來眾多學(xué)者對oa關(guān)節(jié)軟骨退行性改變的原因從不同角度進行了大量研究，其發(fā)病機制仍未完全明了，又提出了許多學(xué)說，如軟骨下骨內(nèi)高壓學(xué)說：由于骨血液動力學(xué)的改變，在骨髓腔容積不變的前提下增加內(nèi)容物引起

47、壓力增高，即表現(xiàn)為骨內(nèi)壓力增高。骨內(nèi)高壓持續(xù)增高存在下關(guān)節(jié)滑液ph值下降，成分改變，干擾并破壞了軟骨細胞的正常代謝導(dǎo)致細胞變性壞死，膠原纖維解聚，蛋白多糖分解，軟骨下骨破壞、修復(fù)，最終產(chǎn)生骨性關(guān)節(jié)炎。自由基學(xué)說：認(rèn)為自由基對軟骨細胞dna和pg的合成具有抑制作用。自由基作用軟骨細胞后，引發(fā)膜脂質(zhì)過氧化，使脂質(zhì)過氧化代謝產(chǎn)物丙二醛增多，丙二醛可與dna發(fā)生交聯(lián)，自由基也可直接攻擊軟骨細胞dna即合成dna所需的酶，使dna鏈斷裂、堿基損傷從而影響了dna的合成，也造成前列腺（pg）合成障礙。骨關(guān)節(jié)炎時，滑膜、滑液、血管翳內(nèi)常有中性白細胞、巨嗜細胞浸潤，其表面受免疫復(fù)合物、補體等作用能釋放大量o2

48、-和h2o2；細胞因子學(xué)說：細胞因子對骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展起了重要作用，如白細胞介素-1（il-1）、白細胞介素-6(il-6)、腫瘤壞死因子（tnf）等在oa中水平明顯增高。il-1具有刺激軟骨細胞分泌一氧化氮、前列腺e和il-6的作用，引起滑膜炎癥和疼痛，同時il-1也是軟骨基質(zhì)降解的主要驅(qū)動因子；軟骨酶降解學(xué)說：oa軟骨細胞的基質(zhì)降解酶類的合成與分泌率明顯增加，并與關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。參與降解基質(zhì)大分子的降解酶類可以增加達到幾倍。酸性和中性蛋白酶可以降解蛋白多糖的核心蛋白。基質(zhì)金屬蛋白酶，尤其是基質(zhì)溶素和膠原酶，參與關(guān)節(jié)軟骨的降解過程，這些酶類可以降解細胞外基質(zhì)的所有成分，與循環(huán)系

49、統(tǒng)中的纖維蛋白溶酶和局部合成的纖溶酶原一起，快速降解軟骨。在滑膜細胞和軟骨細胞產(chǎn)生的il-1和tnf的作用下，軟骨細胞以酶原的形式分泌大量的基質(zhì)金屬蛋白酶，而對金屬蛋白酶組織抑制劑無影響，使二者失衡從而增加對軟骨主要成分型膠原和蛋白聚糖合成的抑制作用，使軟骨進行性破壞；一氧化氮學(xué)說：no是一種細胞間信使分子，可介導(dǎo)許多生物學(xué)現(xiàn)象。nos可催化重要炎性介質(zhì)no的產(chǎn)生，oa患者血清、滑液中no含量明顯高于正常。no可通過抑制軟骨細胞增殖，促進軟骨細胞凋亡，改變蛋白多糖和膠原蛋白的合成與分泌功能，同時使軟骨細胞分泌透明質(zhì)酸減少，滑膜粘蛋白解聚，抑制軟骨細胞合成軟骨基質(zhì)，促進軟骨細胞糖酵解，使軟骨破壞

50、。細胞凋亡學(xué)說：細胞凋亡是細胞死亡的形式之一，許多正常組織均可發(fā)現(xiàn)凋亡，但凋亡亢進與不足則會引起相關(guān)疾病，在骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨中軟骨細胞的凋亡有異常表現(xiàn)，且凋亡細胞數(shù)目與骨關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度明顯相關(guān)。凋亡小體存在于軟骨細胞小孔或間隙內(nèi)，其產(chǎn)生的焦磷酸鹽能從溶液中沉積鈣，有ntpph（nucleosid triphosphate pyrophos phohydrolase）和堿性磷酸酶作用,造成余下軟骨細胞修復(fù)過程失敗，而逐漸發(fā)展成關(guān)節(jié)軟骨的完全丟失。oa軟骨細胞凋亡主要通過兩種相互獨立的途徑完成，一種是同滑膜炎癥無關(guān)的途徑,由no介導(dǎo);另一種是同滑膜炎癥相關(guān)的途徑,由fas介導(dǎo)。典型的oa不存在明顯

51、的炎癥反應(yīng),此時軟骨細胞凋亡以no途徑為主;當(dāng)產(chǎn)生炎癥反應(yīng)時,則通過as途徑加劇軟骨細胞凋亡和關(guān)節(jié)破壞。no通過兩種方式造成組織及細胞損傷。一是高濃度的no能抑制多種與線粒體呼吸傳遞系統(tǒng)及檸檬酸循環(huán)有關(guān)的酶,從而抑制線粒體呼吸,造成組織損傷;二是no與超氧化陰離子2-反應(yīng),生成氧化亞硝基陰離子onoo-,在酸性條件下(如病理條件)迅速分解為oh-和no2自由基,這兩種自由基具有很強的細胞毒性,可造成組織細胞損傷。在oa患者中,受損區(qū)軟骨細胞的凋亡比例明顯高于未受損區(qū)。fas表達的結(jié)果與其相符,oa受損區(qū)的fas表達遠高于未受損區(qū),提示fas表達可誘導(dǎo)軟骨細胞凋亡。除no途徑和fas途徑外,還有

52、一些因素可導(dǎo)致軟骨細胞凋亡、關(guān)節(jié)破壞,如il-1、il-8、tnf-、pge2、aggrecan g1區(qū)等。1.2.3 治療方面有了不少新方法目前中西醫(yī)治療oa的藥物較多，西藥治療oa主要有三大類，第一類為快作用藥，即非甾體藥，特點是發(fā)揮作用快，但副作用較大，對胃腸、肝腎、血小板均有較大影響，oa多為老年人，長期服用此類藥尤其不能耐受，且部分藥物價格不菲，而且由于過分的鎮(zhèn)痛，導(dǎo)致病人失去警惕過分運動，以致出現(xiàn)“消炎痛髖”，從長期療效來看反而不佳，最新觀點認(rèn)為乙酰氨基酚應(yīng)作為治療oa的首選藥，但尚有一定爭議，且同樣存在上述副作用；第二類為慢作用藥，發(fā)揮作用慢，療效不確切，價格昂貴，臨床上尚未廣泛

53、運用；第三類為軟骨保護劑，尚未問世。關(guān)節(jié)清理術(shù)、膝關(guān)節(jié)置換術(shù)，適應(yīng)癥較少，費用高，創(chuàng)傷大，病人難以接受。中哦藥治療oa的研究取得了可喜的進步，但中藥治療仍存在較多共性的問題：多屬臨床經(jīng)驗，無對照組，特別是西藥對照組觀察，處方不固定。缺乏用客觀的最新的國際公認(rèn)的、量化的臨床觀察指標(biāo)及療效判斷標(biāo)準(zhǔn)為手段來尋找治療oa的中藥。未針對oa發(fā)病機制進行臨床及動物試驗從生化、免疫、病理、細胞分子水平來探討中藥的藥物作用機理。缺乏高效的、作用綜合、副作用小的新藥。中醫(yī)認(rèn)為oa屬痹癥中的痹、痛痹、骨痹，認(rèn)為其病因與年老體衰、長期勞損、外感風(fēng)寒濕邪有關(guān)，明確指出肝腎虧虛、氣血不足、筋骨失養(yǎng)為oa的發(fā)病基礎(chǔ)，而寒

54、濕、痰瘀為病理因素及病理產(chǎn)物。周尊謙等人在傳統(tǒng)中醫(yī)理論基礎(chǔ)上，闡述了膝oa骨內(nèi)高壓血瘀證氧自由基之間的密切關(guān)系；謝林等論述了膝oa與血瘀證之間的內(nèi)在聯(lián)系，旨在為運用活血化淤藥治療oa提供理論依據(jù)。治療方面從古到今絕大部分醫(yī)家皆針對其病因病機采用益肝腎、強筋骨、補氣血治其本；散寒通絡(luò)、化痰勝濕治其標(biāo)。獨活寄生湯是用于治療風(fēng)寒濕痹、關(guān)節(jié)疼痛和腦血管后遺癥的傳統(tǒng)固防，具有補肝腎、活血通絡(luò)之功，臨床常見本方加減治療oa，療效比較肯定。朱健兒以本方加味治療262例，總有效率94.7%。單文龍等用本方加減治療骨關(guān)節(jié)炎24例，有效率為87.5%。陸智報道用本方加減治療104例，總有效率91.3%。1.2.4

55、 實驗研究方面有了較大的進展隨著對oa發(fā)病機理的不斷深入認(rèn)識，對oa的實驗研究方面也開始了向多層次多角度的方向發(fā)展。動物實驗不再只局限于微循環(huán)和一般抗炎、鎮(zhèn)痛試驗，現(xiàn)已使用針對oa的動物實驗，并采用相關(guān)的指標(biāo)進行檢測。目前實驗研究內(nèi)容主要有以下幾個方面，研究最多的是oa的血液流變學(xué)、氧自由基及一氧化氮含量等，這些試驗一般均可通過建立骨關(guān)節(jié)炎的模型來完成，也可通過使用其它相似的模型檢測相關(guān)指標(biāo)來進行，如可建立急性血淤模型來檢查血液流變學(xué)指標(biāo)，使用老齡動物通過檢測體內(nèi)sod及mda含量推斷藥物的抗氧自由基的能力等。在no對oa影響的實驗中，一般采用硝酸還原酶法來測定no含量，運用pt-pcr技術(shù)測

56、定nos基因表達。il-1、il-6、tnf等細胞因子、軟骨降解酶尤其是基質(zhì)金屬蛋白酶、誘導(dǎo)關(guān)節(jié)滑膜炎癥的物質(zhì)如纖溶酶原/纖溶酶原激活物和前列腺素pge2、軟骨細胞的細胞凋亡及增殖情況、性激素水平等也越來越多地被作為檢測指標(biāo)使用到實驗研究中來。1.3 選題的理論和實踐依據(jù)祖國醫(yī)學(xué)并無骨關(guān)節(jié)炎的病名，從歷代文獻來看本病應(yīng)歸屬于“骨痹”、“痛痹”范疇。我們認(rèn)為oa病人除了肝腎虧虛，寒濕痹阻外，一般oa病人體重超重較多，也即為痰濕偏盛之體，另外脾虛生濕及寒濕痹阻日久濕聚成痰，痰淤交阻是引起膝關(guān)節(jié)腫脹畸形、活動受限的重要因素，所謂頑癥怪病皆質(zhì)之于痰淤?；诂F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對oa發(fā)病機理的深入研究，我們在補益肝腎、活血通絡(luò)基礎(chǔ)上，結(jié)合中藥對緩解軟骨降解，增加軟骨細胞功能，抑制滑膜增生及炎癥的研究成果，于1995年即對備急千金要方中的獨活寄生湯進行化裁，重用活血化淤，加用化痰清熱之品，總結(jié)制定出了高效、藥源廣泛、安全可行的痛痹顆粒，并于1999年采用痛痹顆粒的組方治療膝oa，方中以獨活為君藥，以祛下焦與筋骨間風(fēng)寒濕邪；威靈仙舒筋通絡(luò)止痹痛；淫羊藿、懷牛膝補肝腎，強筋骨，通經(jīng)絡(luò)，其中懷牛膝