醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)：第十四章 細(xì)胞工程

1、第十四章 細(xì)胞工程 細(xì)胞工程（細(xì)胞工程（cell engineering）:也稱(chēng)細(xì)胞技術(shù)。指也稱(chēng)細(xì)胞技術(shù)。指 在細(xì)胞水平上，采用細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、遺在細(xì)胞水平上，采用細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、遺 傳學(xué)及分子生物學(xué)等學(xué)科的理論與方法，按照人們傳學(xué)及分子生物學(xué)等學(xué)科的理論與方法，按照人們 的意愿來(lái)改變細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)或獲得具有產(chǎn)業(yè)化的意愿來(lái)改變細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)或獲得具有產(chǎn)業(yè)化 價(jià)值的細(xì)胞相關(guān)產(chǎn)品的一門(mén)綜合技術(shù)體系價(jià)值的細(xì)胞相關(guān)產(chǎn)品的一門(mén)綜合技術(shù)體系. 廣義細(xì)胞工程廣義細(xì)胞工程 微生物細(xì)胞工程微生物細(xì)胞工程 植物細(xì)胞工程植物細(xì)胞工程 動(dòng)物細(xì)胞工程動(dòng)物細(xì)胞工程 第一節(jié) 主要相關(guān)技術(shù) 基因操作基因操

2、作 細(xì)胞的遺傳修飾細(xì)胞的遺傳修飾 細(xì)胞的表型分析細(xì)胞的表型分析 工程化細(xì)胞的應(yīng)用工程化細(xì)胞的應(yīng)用 1）微載體（）微載體（microcarrier） 基質(zhì)材料：交聯(lián)葡聚糖基質(zhì)材料：交聯(lián)葡聚糖 1g 交聯(lián)葡聚糖提供交聯(lián)葡聚糖提供 6000cm2 附著面積附著面積 l 微載體是大規(guī)模培養(yǎng)方法中最有使用價(jià)值的支持物。微載體是大規(guī)模培養(yǎng)方法中最有使用價(jià)值的支持物。 一、一、 動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù) ( (一一) )基本策略基本策略 1.1.增加培養(yǎng)容積增加培養(yǎng)容積 2.2.增加細(xì)胞的附著面積增加細(xì)胞的附著面積 2）中空纖維（）中空纖維（hollow fiber） 管壁半透性，細(xì)胞附

3、于管外壁，管內(nèi)可供培養(yǎng)液管壁半透性，細(xì)胞附于管外壁，管內(nèi)可供培養(yǎng)液 通過(guò)。通過(guò)。 l 有利于分泌型表達(dá)蛋白的純化，但不易放大培養(yǎng)。有利于分泌型表達(dá)蛋白的純化，但不易放大培養(yǎng)。 3）微膠囊（）微膠囊（microcapsule） 半透性膜囊，細(xì)胞長(zhǎng)于內(nèi)壁。微囊顆粒需要自行半透性膜囊，細(xì)胞長(zhǎng)于內(nèi)壁。微囊顆粒需要自行 制備，無(wú)商業(yè)購(gòu)買(mǎi)途徑。制備，無(wú)商業(yè)購(gòu)買(mǎi)途徑。 l 細(xì)胞密度大、產(chǎn)物在單位體積中濃度高、分離純細(xì)胞密度大、產(chǎn)物在單位體積中濃度高、分離純 化簡(jiǎn)單?；?jiǎn)單。 3 3、抑制細(xì)胞的凋亡、抑制細(xì)胞的凋亡 在生產(chǎn)特定蛋白質(zhì)（如疫苗、抗體等）的大規(guī)模細(xì)胞培在生產(chǎn)特定蛋白質(zhì)（如疫苗、抗體等）的大規(guī)模細(xì)胞

4、培 養(yǎng)中宜用無(wú)血清培養(yǎng)：養(yǎng)中宜用無(wú)血清培養(yǎng)： p 避免血清中的蛋白質(zhì)對(duì)目的蛋白純化的影響。避免血清中的蛋白質(zhì)對(duì)目的蛋白純化的影響。 p 延長(zhǎng)延長(zhǎng)G1期或促使細(xì)胞停于期或促使細(xì)胞停于G0期，使細(xì)胞較長(zhǎng)時(shí)間維持期，使細(xì)胞較長(zhǎng)時(shí)間維持 在高密度狀態(tài)，利于產(chǎn)生更多目的產(chǎn)物。在高密度狀態(tài)，利于產(chǎn)生更多目的產(chǎn)物。 p 降低細(xì)胞死亡率，避免死亡細(xì)胞的蛋白酶釋放至培養(yǎng)降低細(xì)胞死亡率，避免死亡細(xì)胞的蛋白酶釋放至培養(yǎng) 基導(dǎo)致目的蛋白降解?；鶎?dǎo)致目的蛋白降解。 4 4、無(wú)血清培養(yǎng)：、無(wú)血清培養(yǎng)： 延長(zhǎng)延長(zhǎng)G1期，或促使細(xì)胞停于期，或促使細(xì)胞停于G0期，細(xì)胞活力正期，細(xì)胞活力正 常，可有效抑制凋亡。常，可有效抑制凋亡

5、。 （二）基本培養(yǎng)系統(tǒng)（二）基本培養(yǎng)系統(tǒng) 傳統(tǒng)懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)：不銹鋼發(fā)酵罐（高度：直徑傳統(tǒng)懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)：不銹鋼發(fā)酵罐（高度：直徑 =1：1 3：1）和攪拌器，產(chǎn)生氣泡易引起機(jī)械）和攪拌器，產(chǎn)生氣泡易引起機(jī)械 損傷。損傷。 旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)：模擬失重狀態(tài)，有效降低機(jī)旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)：模擬失重狀態(tài)，有效降低機(jī) 械損傷，應(yīng)用面廣。械損傷，應(yīng)用面廣。 1. 懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)懸浮培養(yǎng)系統(tǒng) 2. 氣流驅(qū)動(dòng)培養(yǎng)系統(tǒng)氣流驅(qū)動(dòng)培養(yǎng)系統(tǒng) 主要優(yōu)勢(shì)在于簡(jiǎn)化設(shè)計(jì)，因?yàn)椴恍枰獢嚢杵髦械闹饕獌?yōu)勢(shì)在于簡(jiǎn)化設(shè)計(jì)，因?yàn)椴恍枰獢嚢杵髦械?發(fā)動(dòng)機(jī)和攪拌裝置。發(fā)動(dòng)機(jī)和攪拌裝置。 3. 微載體培養(yǎng)系統(tǒng)微載體培養(yǎng)系統(tǒng)：微載體與攪拌懸浮培養(yǎng)相結(jié)

6、合的：微載體與攪拌懸浮培養(yǎng)相結(jié)合的 培養(yǎng)系統(tǒng)。培養(yǎng)系統(tǒng)。 4. 灌注培養(yǎng)系統(tǒng)灌注培養(yǎng)系統(tǒng)：能自動(dòng)地將：能自動(dòng)地將“舊舊”的培養(yǎng)液排除，的培養(yǎng)液排除， 同時(shí)自動(dòng)地將新的培養(yǎng)液以相同速率補(bǔ)入到細(xì)胞生長(zhǎng)同時(shí)自動(dòng)地將新的培養(yǎng)液以相同速率補(bǔ)入到細(xì)胞生長(zhǎng) 的容器中。的容器中。 細(xì)胞的基本生長(zhǎng)特征：細(xì)胞的基本生長(zhǎng)特征： （三）影響大規(guī)模細(xì)胞生長(zhǎng)的因素：（三）影響大規(guī)模細(xì)胞生長(zhǎng)的因素： 潛伏期潛伏期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期平臺(tái)期平臺(tái)期 優(yōu)化大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)量化評(píng)估指標(biāo)：優(yōu)化大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)量化評(píng)估指標(biāo)： 1）考慮細(xì)胞密度、生存能力、有絲分裂指數(shù)、一）考慮細(xì)胞密度、生存能力、有絲分裂指數(shù)、一 般形態(tài)及破碎數(shù)

7、量的信息；般形態(tài)及破碎數(shù)量的信息； 2）采用檢測(cè)生化指標(biāo)來(lái)判斷。）采用檢測(cè)生化指標(biāo)來(lái)判斷。 葡萄糖和乳酸鹽的濃度可以反映培養(yǎng)液的質(zhì)量葡萄糖和乳酸鹽的濃度可以反映培養(yǎng)液的質(zhì)量 情況；乳酸脫氫酶可以判斷細(xì)胞損傷或破碎情情況；乳酸脫氫酶可以判斷細(xì)胞損傷或破碎情 況。況。 利用顯微注射裝置，將一個(gè)細(xì)胞的核移植入另一利用顯微注射裝置，將一個(gè)細(xì)胞的核移植入另一 個(gè)去核細(xì)胞中，已得到重組細(xì)胞。是克隆的關(guān)鍵個(gè)去核細(xì)胞中，已得到重組細(xì)胞。是克隆的關(guān)鍵 技術(shù)。技術(shù)。 二、二、 細(xì)胞核移植（細(xì)胞核移植（nuclear transfer） （一）技術(shù)路線（一）技術(shù)路線 1. 細(xì)胞質(zhì)的選擇：細(xì)胞質(zhì)的選擇： 受精卵、處于

8、受精卵、處于M II期的卵母細(xì)胞，可以使植入細(xì)胞期的卵母細(xì)胞，可以使植入細(xì)胞 核的基因組行為發(fā)生重編程（核的基因組行為發(fā)生重編程（regrogramming），）， 從而去分化恢復(fù)全能性狀態(tài)。從而去分化恢復(fù)全能性狀態(tài)。 2. 供核細(xì)胞的選擇供核細(xì)胞的選擇： 胚胎細(xì)胞、未分化的原始生殖細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、胚胎細(xì)胞、未分化的原始生殖細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、 胎兒體細(xì)胞、成體體細(xì)胞。胎兒體細(xì)胞、成體體細(xì)胞。 分化程度分化程度 ，克隆效率，克隆效率 。 3. 去核：去核： （1）紫外線照射去核）紫外線照射去核 通過(guò)破壞通過(guò)破壞DNA去核。損傷較大，基本棄用。去核。損傷較大，基本棄用。 （2）盲吸法去核）盲吸法

9、去核 依據(jù)依據(jù)M II期卵母細(xì)胞中第一極體與細(xì)胞核的期卵母細(xì)胞中第一極體與細(xì)胞核的 對(duì)位關(guān)系，用去核針吸去第一極體及其附近胞質(zhì)，對(duì)位關(guān)系，用去核針吸去第一極體及其附近胞質(zhì)， 成功率約成功率約80%。 （3）蔗糖高滲處理去核法）蔗糖高滲處理去核法 先經(jīng)高滲蔗糖（先經(jīng)高滲蔗糖（0.30.9mol/L）處理，使核）處理，使核 微凸，以去核針去除。微凸，以去核針去除。 （4）透明帶打孔去核法）透明帶打孔去核法 先以顯微針在透明帶打孔，以細(xì)胞松弛素處先以顯微針在透明帶打孔，以細(xì)胞松弛素處 理后去核，提高卵母細(xì)胞存活率。理后去核，提高卵母細(xì)胞存活率。 （5）超速離心法）超速離心法 4. 重構(gòu)胚的構(gòu)建：重構(gòu)

10、胚的構(gòu)建： 直接將供核細(xì)胞移植到直接將供核細(xì)胞移植到 M II 期卵母細(xì)胞期卵母細(xì)胞/受精卵透明帶下受精卵透明帶下 ，經(jīng)細(xì)胞融合實(shí)現(xiàn)重組，經(jīng)細(xì)胞融合實(shí)現(xiàn)重組已已 應(yīng)用于多種家畜。應(yīng)用于多種家畜。 取供核細(xì)胞核直接注入已去取供核細(xì)胞核直接注入已去 核的受體細(xì)胞質(zhì)核的受體細(xì)胞質(zhì)多用于克多用于克 隆小鼠。隆小鼠。 5. 重構(gòu)胚的激活重構(gòu)胚的激活 （1）化學(xué)激活）化學(xué)激活 （2）電激活）電激活 p 處理后能夠卵裂則表明激活成功。處理后能夠卵裂則表明激活成功。 6. 重構(gòu)胚的培養(yǎng)與移植重構(gòu)胚的培養(yǎng)與移植 培養(yǎng)發(fā)育至囊胚或桑葚胚期后，方移植入子宮。培養(yǎng)發(fā)育至囊胚或桑葚胚期后，方移植入子宮。 （二）不同供核

11、細(xì)胞的核移植（二）不同供核細(xì)胞的核移植 1. 胚胎細(xì)胞核移植：胚胎細(xì)胞核移植： 童第周（童第周（1902-1979） 中國(guó)的中國(guó)的“克隆先驅(qū)克隆先驅(qū)” Megan & Morag from English 目前核移植已成功：兩棲類(lèi)、魚(yú)類(lèi)、昆蟲(chóng)、哺乳動(dòng)物目前核移植已成功：兩棲類(lèi)、魚(yú)類(lèi)、昆蟲(chóng)、哺乳動(dòng)物 目前核移植未成功：爬行類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)目前核移植未成功：爬行類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi) 2. 體細(xì)胞核移植：體細(xì)胞核移植： 1962，非洲爪蟾，非洲爪蟾 Dolly，1997， Roslin Institute 體細(xì)胞核移植的成功，證明高度分化的成體細(xì)胞體細(xì)胞核移植的成功，證明高度分化的成體細(xì)胞 核仍具發(fā)育全能性，能在成熟卵

12、母細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)重核仍具發(fā)育全能性，能在成熟卵母細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)重 編程，發(fā)育為完整個(gè)體。編程，發(fā)育為完整個(gè)體。 M II 期的卵母細(xì)胞中含大量期的卵母細(xì)胞中含大量MPF，可誘導(dǎo)供體核，可誘導(dǎo)供體核 發(fā)生一系列早熟變化，尤其易使發(fā)生一系列早熟變化，尤其易使S期細(xì)胞核出現(xiàn)期細(xì)胞核出現(xiàn) 染色體異常，對(duì)染色體異常，對(duì)G1期染色體損害較小。期染色體損害較小。 選取選取G0或或G1期細(xì)胞為核供體，選期細(xì)胞為核供體，選MPF水平低時(shí)水平低時(shí) 的卵母細(xì)胞為受體。的卵母細(xì)胞為受體。 三、三、 基因轉(zhuǎn)移基因轉(zhuǎn)移 目的基因需通過(guò)特目的基因需通過(guò)特 定載體（如質(zhì)粒、定載體（如質(zhì)粒、 病毒載體等）攜帶病毒載體等）攜帶 進(jìn)入細(xì)胞

13、。進(jìn)入細(xì)胞。 （1）電穿孔法）電穿孔法：以脈沖電場(chǎng)使細(xì)胞膜產(chǎn)生細(xì)小空：以脈沖電場(chǎng)使細(xì)胞膜產(chǎn)生細(xì)小空 洞，使外源洞，使外源DNA進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。 （2）顯微注射法）顯微注射法：將：將DNA直接注入細(xì)胞，多用于直接注入細(xì)胞，多用于 制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：不含病毒基因組片段：不含病毒基因組片段 缺點(diǎn)缺點(diǎn)：基因隨機(jī)整合于染色體，易導(dǎo)致受體細(xì)胞：基因隨機(jī)整合于染色體，易導(dǎo)致受體細(xì)胞 基因滅活或轉(zhuǎn)化基因不表達(dá)?；驕缁罨蜣D(zhuǎn)化基因不表達(dá)。 1. 物理轉(zhuǎn)化法物理轉(zhuǎn)化法 2. 化學(xué)轉(zhuǎn)化法化學(xué)轉(zhuǎn)化法 （1）脂質(zhì)體包埋法）脂質(zhì)體包埋法 脂質(zhì)體包裹脂質(zhì)體包裹DNA，通過(guò)與受體細(xì)胞膜融合使

14、，通過(guò)與受體細(xì)胞膜融合使 DNA片段進(jìn)入細(xì)胞。片段進(jìn)入細(xì)胞。 （2）磷酸鈣共沉淀法）磷酸鈣共沉淀法 DNA與磷酸鈣形成共沉淀顆粒，吸附于細(xì)胞表與磷酸鈣形成共沉淀顆粒，吸附于細(xì)胞表 面，通過(guò)胞飲作用進(jìn)入細(xì)胞。面，通過(guò)胞飲作用進(jìn)入細(xì)胞。 （3）DEAE-葡聚糖吸附法葡聚糖吸附法 通過(guò)病毒感染的方式導(dǎo)入外源基因。通過(guò)病毒感染的方式導(dǎo)入外源基因。 病毒載體為缺陷型病毒，感染后將基因組轉(zhuǎn)入細(xì)病毒載體為缺陷型病毒，感染后將基因組轉(zhuǎn)入細(xì) 胞，無(wú)法產(chǎn)生包裝的病毒顆粒。胞，無(wú)法產(chǎn)生包裝的病毒顆粒。 常用：腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。常用：腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。 3. 生物學(xué)方法生物學(xué)方法 第二節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞

15、工程的應(yīng)用 一一. 醫(yī)用蛋白質(zhì)的生產(chǎn)醫(yī)用蛋白質(zhì)的生產(chǎn) 1. 單克隆抗體單克隆抗體 一種一種B淋巴細(xì)胞能接受一種抗原決定簇的刺激，淋巴細(xì)胞能接受一種抗原決定簇的刺激， 分化繁殖成為可分泌相應(yīng)抗體的克隆系。大量分化繁殖成為可分泌相應(yīng)抗體的克隆系。大量B 淋巴細(xì)胞可分泌出識(shí)別許多抗原決定簇的抗體。淋巴細(xì)胞可分泌出識(shí)別許多抗原決定簇的抗體。 單克隆抗體單克隆抗體：來(lái)源于單個(gè)：來(lái)源于單個(gè)B淋巴細(xì)胞的抗體，只能淋巴細(xì)胞的抗體，只能 識(shí)別一種特定抗原決定簇。識(shí)別一種特定抗原決定簇。 單克隆抗體制備技術(shù)（單克隆抗體制備技術(shù)（B 淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)）淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)） ：將骨髓瘤細(xì)胞與：將骨髓瘤細(xì)胞與B淋巴細(xì)

16、胞融合形成雜交瘤細(xì)淋巴細(xì)胞融合形成雜交瘤細(xì) 胞，用于制備單克隆抗體。胞，用于制備單克隆抗體。 所獲得的雜交瘤細(xì)胞既具有腫瘤細(xì)胞所獲得的雜交瘤細(xì)胞既具有腫瘤細(xì)胞無(wú)限生長(zhǎng)無(wú)限生長(zhǎng)的的 特性，又具有特性，又具有B淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞分泌抗體分泌抗體的能力。的能力。 單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)：?jiǎn)慰寺】贵w的優(yōu)點(diǎn)：專(zhuān)一性、均質(zhì)性、靈敏性專(zhuān)一性、均質(zhì)性、靈敏性以以 及及無(wú)限量制備無(wú)限量制備的可能性。的可能性。 單克隆抗體的制備過(guò)程單克隆抗體的制備過(guò)程 應(yīng)用價(jià)值：應(yīng)用價(jià)值： 作為體外診斷試劑。作為體外診斷試劑。 作為體內(nèi)診斷試劑，作為體內(nèi)診斷試劑， 用作腫瘤定位等。用作腫瘤定位等。 作為導(dǎo)向藥物的載體作為導(dǎo)向藥物的載體

17、：?jiǎn)慰寺】贵w上連接：?jiǎn)慰寺】贵w上連接 抗癌藥物等抗癌藥物等,特異地治特異地治 療癌癥等疾病。療癌癥等疾病。 -生物導(dǎo)彈生物導(dǎo)彈 p 由于微生物缺乏蛋白質(zhì)翻譯后的加工修飾系統(tǒng)，由于微生物缺乏蛋白質(zhì)翻譯后的加工修飾系統(tǒng)， 因此許多復(fù)雜人體蛋白必須用真核動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)。因此許多復(fù)雜人體蛋白必須用真核動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)。 如：如： 溶血栓藥物溶血栓藥物-組織型纖溶酶原激活劑組織型纖溶酶原激活劑（tPA） 血友病藥物血友病藥物凝血因子凝血因子 VIII 促紅細(xì)胞生成素促紅細(xì)胞生成素治療腫瘤化療或腎臟疾病導(dǎo)致的治療腫瘤化療或腎臟疾病導(dǎo)致的 紅細(xì)胞減少癥紅細(xì)胞減少癥 2. 復(fù)雜人體蛋白質(zhì)復(fù)雜人體蛋白質(zhì) 二二. 基因

18、工程動(dòng)物的產(chǎn)生基因工程動(dòng)物的產(chǎn)生 基因工程動(dòng)物基因工程動(dòng)物 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 （transgenic animal） 基因剔除動(dòng)物基因剔除動(dòng)物 （gene knockout animal） 1、疾病動(dòng)物模型、疾病動(dòng)物模型 目前已有多種遺傳疾病的模型小鼠，是研究人類(lèi)疾病目前已有多種遺傳疾病的模型小鼠，是研究人類(lèi)疾病 的有利工具。的有利工具。 2、動(dòng)物生物反應(yīng)器（、動(dòng)物生物反應(yīng)器（bioreactor） 主要用于生產(chǎn)目的蛋白質(zhì)，如：乳腺生物反應(yīng)器主要用于生產(chǎn)目的蛋白質(zhì)，如：乳腺生物反應(yīng)器 3、人類(lèi)移植用器官、人類(lèi)移植用器官 通過(guò)遺傳改造減少排斥。通過(guò)遺傳改造減少排斥。 三三. 基于細(xì)胞的組織工程基于細(xì)胞的組織工程 組織工程皮膚組織工程皮膚 組織工程膀胱組織工程膀胱 將體外培養(yǎng)的功能細(xì)胞植入患者體內(nèi)，以代償將體外培養(yǎng)的功能細(xì)胞植入患者體內(nèi)，以代償 病變細(xì)胞所喪失的功能。病變細(xì)胞所