果蠅雜交實驗實驗報告39214

1、果蠅雜交實驗【實驗?zāi)康摹客ㄟ^實驗驗證分離規(guī)律、自山組合規(guī)律、伴性遺傳和連鎖互換規(guī)律，掌握果 蠅雜交的實驗技術(shù)和基因定位的三點測驗方法，在實驗中熟練運用生物統(tǒng)訃的方 法對實驗數(shù)據(jù)進行分析。【實驗原理】1. 果蠅（frui t fly）是雙翅目（Diptera ）昆蟲，屬果蠅屬（genus Drosophila）,約有3000多種，我國已發(fā)現(xiàn)800多種。大部分的物種以腐爛的水 果或植物體為食，少部分則只取用真菌，樹液或花粉為其食物。以果蠅作為遺傳 學(xué)研究的材料，利用突變株研究基因和性狀之間的關(guān)系已近一白年，至今，各種 研究遺傳學(xué)的工具已達完善的地步，果蠅對今日的遺傳學(xué)的發(fā)展有其不可磨滅的 貢獻;從

2、 1980 年初，Drs. C. Nesslein-Volhard 和 E. Weichaus 以果蠅作為發(fā) 育生物學(xué)的模式動物，利用其完備的遺傳研究工具來探討基因是如何調(diào)控動物體 胚胎的發(fā)育，也帶動了其它模式生物（線蟲、斑馬魚、小鼠和擬南芥等）的研究， 且有非常具體的成果。通常用作遺傳學(xué)實驗材料的是黑腹果蠅I Drosophila me 1 anogas ter）。用果 蠅作為實驗材料有許多優(yōu)點：飼養(yǎng)容易。在常溫下，以玉米粉等作飼料就可以生長，繁殖。生長迅速。十天左右就可完成一個世代，每個受精的雌蠅可產(chǎn)卵400500 個，因此在短時間內(nèi)就可獲得大量的子代，便于遺傳學(xué)分析。染色體數(shù)少。只有4對

3、。唾腺染色體制作容易。橫紋清晰，是細胞學(xué)觀察的好材料。突變性狀多，而且多數(shù)是形態(tài)突變，便于觀察。果蠅的生活史：果蠅的生活周期長短與溫度有密切關(guān)系。一般來說，30C以上溫度能使果蠅 不育或死亡，低溫能使生活周期延長，生活力下降，飼養(yǎng)果蠅的最適溫度為20 25Co生活周期長短與飼養(yǎng)溫度的關(guān)系10C15C20 C25 C卵f幼蟲57天18天8天5天幼蟲f成蟲64天果蠅在25C時，從卵到成蠅需10天左右，成蟲可活2633天。果蠅的生 活史如下：雄蠅一減數(shù)分裂第一批成蟲羽化（第八天）（可活2633天）蛹（第四天）雌蠅青子受精產(chǎn)第一批卵第一批卵孵化（第零天）第二次蛻皮（第二天）幼蟲第一次皿（第一天）果蠅的

4、生活周期和各發(fā)育階段的經(jīng)過時間果蠅的性別及突變性狀的鑒別：果蠅的每一體細胞有8個染色體（2n二8）,可配成4對，其中3對在雌雄果 蠅中是一樣的，稱常染色體。另外一對稱性染色體，在雌果蠅中是XX,在雄蠅中是XY。果蠅的雌雄在幼蟲期較難區(qū)別，但到了成蟲期區(qū)別相當(dāng)容易。雄性個體一般 較雌性個體小，腹部環(huán)紋5條，腹尖色深，第一對腳的附節(jié)前端表面有黑色鬃毛 流蘇，稱性梳（Sex combs）o雌性環(huán)紋7條，腹尖色淺，無性梳。實驗中選用的果蠅突變性狀一般都可用肉眼鑒定，例如紅眼與口眼，正常翅與殘翅等。而另一些性狀可在解剖鏡下鑒定，如焦剛毛與直剛毛等。現(xiàn)列表如下:實驗中使用的果蠅突變品系影響部分突變名稱基因

5、符號染色體上座位翅殘翅VgIIR 67.0眼色白眼WX 1.5體色黑體bIIR 48.5剛毛焦剛毛snX 21.0翅形小翅mX 36. 1焦剛毛的基因座為sn3,本文簡寫為sno2. 野生型果蠅為紅眼、灰身、長翅、直剛毛，與這些性狀對應(yīng)的突變性狀 很多，其中灰身（+）與黑身（b）是一對相對性狀，且灰身對黑身為完全顯性， 控制這對相對性狀的基因位于第二號染色體上。用具有這對相對性狀的兩純合親 本雜交，性狀的遺傳行為應(yīng)符合分離定律。3. 黑體果蠅的體色為黑色（b）,與之相對應(yīng)的野生型果蠅的體色為灰色（ + ）, 灰色對黑色為完全顯性，控制這對相對性狀的基因位于第二號染色體上；果蠅另 一突變性狀為焦

6、剛毛（sn）,與之對應(yīng)的野生型性狀為直剛毛（ + ）,控制這對相 對性狀的基因位于第一號染色體上，直剛毛對焦剛毛為完全顯性。用具有這兩對 相對性狀的純合親本雜交，其性狀的遺傳行為應(yīng)符合自由組合定律。4. 生物某些性狀的遺傳常與性別聯(lián)系在一起，這種現(xiàn)象稱為伴性遺傳 （sex-linked inheritance）,這是山于支配某些性狀的基因位于性染色體上。果蠅屬XY型生物，共有四對染色體，第一對為性染色體，其余三對為常染色體。 雌果蠅的性染色體構(gòu)型為XX,、雄果蠅為XY?？刂乒壯凵幕蛭挥赬染色體 上，在Y染色體則沒有與之相應(yīng)的等位基因。將紅眼（+ ）果蠅和白眼（w）果蠅 雜交，其后代眼色的

7、表現(xiàn)與性別有關(guān)。而且，正反交的結(jié)果不同。5. 不完全連鎖基因在形成配子時，隨同源染色體非姊妹染色體單體之間發(fā) 生交換而交換，產(chǎn)生一定頻度的重組型配子，在子代中表現(xiàn)一定比例的重組性狀， 通過觀察和統(tǒng)計測交子代各種表型的個體數(shù)，可佔算出連鎖基因間的交換率，山 此確定基因在染色體上的相對位置，繪制出連鎖遺傳圖。已知果蠅（Drosophila me 1 anogas ter的紅眼（+ ）對口眼（w）是顯性，直剛毛（+ ）對焦剛毛（sn） 是顯性，長翅（+）對小型翅（m）是顯性，控制這三對相對性狀的基因都位于X 染色體上，若將白眼（w）.焦剛毛（sn）、小型翅（m）三隱性突變體雌蠅（XX 心）與紅眼（

8、+ ）、直剛毛（ + ）、長翅（+ ）野生型雄蠅（XY）雜交，則Fi可產(chǎn) 生三雜合體雌蠅（f 之亠）和三隱性雄蠅（f =Y）。由于Y染色體上不攜帶相 應(yīng)的等位基因，因而表現(xiàn)出X染色體上三個隱性基因所控制的性狀，相當(dāng)于一個 三隱性純合體。用幾代朵交（相當(dāng)于測交），幾代表現(xiàn)出的8種表型及數(shù)與Fi 雌蠅產(chǎn)生的8種配子及數(shù)LI 一致，通過觀察和統(tǒng)計氏代（相當(dāng)于測交子代）8種 表型的個體數(shù)，就可佔算出這三對基因間的交換率，山此確定這三對基因其在染 色體上的相對位置，繪制出連鎖遺傳圖。【實驗材料】不同品系的黑腹果蠅；黑身果蠅（b）：黑體、紅眼、長翅、直剛毛（bb +卄+）品系； 三隱果蠅：灰體、口眼、小翅

9、、焦剛毛（+ ww snsn mm）品系。實驗用具、藥品：雙筒解剖鏡，鐵子，解剖針，毛筆，白瓷板，吸水紙，培養(yǎng)箱，飼養(yǎng)瓶（指 管），麻醉瓶，棉花，乙醛，酒精，丙酸，培養(yǎng)基等。【實驗操作】（-）果蠅實驗技術(shù)1. 麻醉：對果蠅進行檢查時，用乙醍麻醉，使果蠅處于昏迷狀態(tài)。使用時 將乙醍（23滴）滴到麻醉瓶的棉花球上（注意不要讓乙醴流進瓶內(nèi)），麻醉瓶 要保持干燥，否則會粘住果蠅翅膀，影響觀察。麻醉果蠅時，先將長有果蠅的培 養(yǎng)瓶在海棉墊上敲，使果蠅全部震落在培養(yǎng)瓶底部，然后迅速打開培養(yǎng)瓶的棉塞, 把果蠅倒入去蓋的麻醉瓶中，并立即蓋好麻醉瓶，待果蠅全部昏迷后，倒在口瓷 板上進行觀察。果蠅的麻醉程度看實驗要

10、求而定，對仍需培養(yǎng)的果蠅，以輕度麻醉為宜。但 對不再培養(yǎng)，單單進行性狀觀察的果蠅可以深度麻醉，甚至致死也無妨（果蠅翅 膀外展45角，說明死亡）。檢查完畢后，把不需要的果蠅倒入盛有煤油或酒精 或水的瓶中（死蠅盛留器）。2. 果蠅交配：將雌雄果蠅放在一起培養(yǎng)，雌蠅的生殖器中有貯精囊，可保 留交配所得的大量精子，雌蠅一次交配所得的精子，足夠它多次排出的卵受精， 因此在做雜交試驗時，雌蠅必須選用處女蠅（沒有交配過的雌蠅）。雌蠅孵出后 12小時內(nèi)不會交配，這個時間內(nèi)把果蠅全部倒出，分出雌雄蠅，單獨飼養(yǎng)，這 時收集的雌蠅是處女蠅。雜交時把所需品系的雄蠅直接放到處女蠅培養(yǎng)瓶中，貼 好標(biāo)簽，注明兩親本的基因型

11、及交配日期，進行培養(yǎng)。78天后倒掉親本（一 定要倒干凈，以免親代和子代混淆），待F1成蠅羽化后開始計算，觀察性狀?？?靠的計數(shù)及觀察是培養(yǎng)開始的20天以內(nèi)（再晚F2也可能有了）。若須繼續(xù)實驗, 觀察F2,可在F1內(nèi)挑出雌雄數(shù)對，另外培養(yǎng)，因為這次是用F1作親本，進行 個體間互交，所以這時不是處女蠅也可以。但如要把F1雌蠅與另一品系雄蠅雜 交時，還要嚴(yán)格地選取處女蠅，方法同上。3. 原種培養(yǎng)在作新的留種培養(yǎng)時，應(yīng)事先檢查一下果蠅有沒有混雜，以防原種丟失。親 本的數(shù)U 般每瓶510對，移入新瓶時，須將培養(yǎng)瓶橫臥，然后用毛筆將麻醉 的果蠅從白瓷板上輕輕掃入，待果蠅醒過來后再把培養(yǎng)瓶豎起，以防果蠅粘在

12、飼 料上。原種每24周換一次培養(yǎng)基（依溫度而定，1015C約4周換一次，20 25C約二周換一次）。每一原種培養(yǎng)至少保留兩套，培養(yǎng)瓶的標(biāo)簽上要寫明突變 名稱，培養(yǎng)日期等。作原種培養(yǎng)溫度可控制在1015C,培養(yǎng)時避免曰光直射。果蠅在適宜條件下會產(chǎn)子代，在肉眼能看到幼蟲時就可把親本倒掉，兒天以 后，新的成蠅便產(chǎn)生。待成蠅有了足夠保種的數(shù)量后，要調(diào)換培養(yǎng)瓶，作為下一 代的親本，繼續(xù)培養(yǎng)。原種果蠅培養(yǎng)遇到的麻煩是飼料發(fā)霉。發(fā)霉的原因很多，如用具沒有滅菌， 空氣污染，親本不及時倒掉，都會引起飼料發(fā)霉。嚴(yán)重的靄菌污染會影響果蠅的 生長。飼料中加丙酸可以抑制霉菌，但并不能完全制止。發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶中有少量霉 點時

13、可用燒過的解剖針挑出。若大量霉菌污染，可把果蠅全部倒在一個消毒過的 空指管中，讓它活動23小時，換一支指管，再活動12小時，而后倒入一支 新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，這樣可以防止霉菌污染。精品原種保存遇到的另一個問題是混雜，兒個不同品系的果蠅在一起培養(yǎng)，一定 要防止混雜。培養(yǎng)瓶的塞子要做得緊些，不使果蠅逃出。調(diào)換培養(yǎng)瓶時，要防止 果蠅飛散。外逃的果蠅要打死。發(fā)現(xiàn)了混雜的原種，要根據(jù)原種果蠅的全部特征, 挑出數(shù)對雌雄蠅飼養(yǎng)，進行篩選直到完全沒有分離為止。這樣做，費時費力，只 是在不得已時才釆用。一般混雜時，只要方便，可以重新引種，將混雜種棄去。（二）果蠅雜交實驗（1）果蠅的性狀觀察、性別鑒定及飼養(yǎng)。（

14、2）選取雜交親本中所用的母本必須是處女蠅。剛羽化的雌蠅在12h內(nèi)一般 無交配能力。在雜交前放出親本培養(yǎng)瓶中的所有成蠅，每隔1012h收集一次羽 化的成蠅，并將雌雄蠅分開飼養(yǎng)。收集處女蠅數(shù)量的多少根據(jù)需要而定。（3）麻醉接種 用黑身果蠅與三隱果蠅雜交，正反交同時進行。即三隱2X 黑身黑身早X三隱正交2 BBX 日期： 姓名:KxbbXY b將所選處女蠅按品系分別麻醉，按不同雜交組合分別選取雌、雄蠅各610 只移入雜交瓶中，為了防止昏迷果蠅被培養(yǎng)基粘住，可將培養(yǎng)瓶放倒，將果蠅置 于瓶壁，待其蘇醒后再將培養(yǎng)瓶直立，貼上標(biāo)簽：反交 bbx BBX:r-Y $日期：姓名:將雜交瓶放在20C25C恒溫箱內(nèi)

15、培養(yǎng)。（4）培養(yǎng)78d,倒掉雜交親本（倒掉的果蠅最好處死）。（5）再過45d, FM弋成蠅出現(xiàn)，觀察F：代性狀是否和預(yù)期結(jié)果一致。（6）收集610對F代果蠅放入一新培養(yǎng)瓶，在20C25C恒溫箱內(nèi)繼續(xù) 培養(yǎng)，以便觀察F,代（正反交作相同處理）。（7）繼續(xù)培養(yǎng)78d后，移去Fi代。（8）再45d,氏代成蠅出現(xiàn)，開始觀察并統(tǒng)計F：代的性狀表現(xiàn)類型及數(shù)口?！窘Y(jié)果統(tǒng)計分析】（-）數(shù)據(jù)記錄正交灰體黑體合計早$早$紅、長、直+ + +162212475614263856白、小、焦118511543973623098白、長、直一 + +30926111377760紅、小、焦+ 一2642599996718紅、

16、長、焦+ + 63492217151白、小、直一一 +81972636240紅、小、直+ +311315127128881白、長、焦一 + 一34124513175792體色合計78032693性別合計417636271476121710496性別合計256524844反交灰體黑體合計22古紅、長、直+ + +3558143711534816629白、小、焦1459141223131494白、長、直一 + +462052774352紅、小、焦+ 一731952662356紅、長、焦+ + 41883141201白、小、直一一 、小、直+ +15731896125696

17、白、長、焦一 + 一612742677438體色合計7598270110299性別合計4094350414931208性別合計55874712（二）統(tǒng)計分析1. 分離定律 圖譜分析XTBbBb 刀 B ( Bbb （黑體）自交bb理論比值:實際正交數(shù)量:比值: 反交數(shù)量:比值:灰體黑體3:1780326932.90:1759827012.81 :1X檢驗正交基因體色基因（B/b）F,表型灰體黑體合計實得數(shù)07803269310496預(yù)期數(shù)E7872262410496八X2.4192P （n二1）0. 100. 50 （0. 05）（差異不顯著）反交基因體色基因（A/&）表型灰體黑體合計實得數(shù)7

18、598270110299預(yù)期數(shù)7724.252574. 75102998. 2540P （n=l）【分析及討論】1分離定律的驗證：果蠅的體色是一對獨立遺傳的常染色體基因。對于這對 基因來說，自身遵守分離定律，且正反交表型比率相同。但是針對實驗得到表型 比率來看，相差比較大。單因子適合度測驗主要是來驗證分離定律。在適合 度檢驗中我們發(fā)現(xiàn)，正交的結(jié)果P值0.05,說明實驗得到的數(shù)據(jù)與理論的數(shù)據(jù) 相差不大，支持最初的假設(shè)。但是對于反交來說，得到的P值0.01,說明與孟 德爾分離定律相差很大，不能夠用基因的回交來說明。2.自山組合定律的驗證：果蠅的體色和剛毛是兩對獨立遺傳的基因，剛毛基 因位于X染色體

19、上。因此，對于這兩對基因來說，自身遵守自山組合定律，且 F2正反交表型比率不同，通過圖譜分析，我們得到正交表型比率（灰體直剛毛: 灰體焦剛毛：黑體直剛毛：黑體焦剛毛）分別為3:3:1:1和9:3:3:1。在雙因子 x 適合度檢驗中，正反交的結(jié)果P值均0. 01,與孟德爾自由組合定律相差很大。針對于以上單因子及雙因子X適合度檢驗發(fā)生的現(xiàn)象，我認為主要有以下 兩個方面的原因：1）選取的實驗方案本身存在問題。這兩對基因并不是完全獨立遺傳，由反 交型的單因子適合度測驗可以看出，體色分離比不符合3:1,可能兩個基因存在 于某些有關(guān)于性別方面的連鎖。2）實驗的隨機誤差較大。實驗操作的不到位以及對果蠅性別、表型特征分 辨錯誤使結(jié)果出現(xiàn)誤差。3. 伴性遺傳規(guī)律：果蠅的眼色是UJX染色體控制的遺傳性狀，其基因僅位于 果蠅的X染色體上。對于這