沙眼衣原體檢測新進(jìn)展

1、衣原體 Chlamydia 一類能通過細(xì)菌濾器，專性真核細(xì)胞內(nèi)寄生，有獨(dú)特發(fā)育周期 的微生物； 體積略大于病毒，光學(xué)顯微鏡下可見，具有DNA、RNA兩種 核酸、核糖體和近似細(xì)胞壁的膜； 以二分裂方式進(jìn)行增值； 能被抗生素抑制，現(xiàn)歸于廣義的細(xì)菌范疇。 沙眼衣原體 C. trachomatis 具有特殊發(fā)育周期，鏡檢可觀察到兩種不同形態(tài)結(jié)構(gòu)： 1.原體（EB）：存在于細(xì)胞外，具有高度感染性 2.始體（RB）：存在于細(xì)胞內(nèi)，繁殖型，代謝活潑，無感染性 衣原體分類 按第九版Bergey細(xì)菌學(xué)分類手冊，衣原體分類上屬于衣原體 目（Chlamydiales）,下有衣原體科（Chlamydiceae）、衣原

2、 體屬(Chlamydia)。 根據(jù)衣原體的抗原結(jié)構(gòu)和DNA同源性特點(diǎn)，衣原體分為四個(gè) 種，包括沙眼衣原體（C. trachomatis）、肺炎衣原體 （C.pneumoniae）、鸚鵡熱衣原體（C.psittaci）和家畜衣原 體（C.pecorum）。前三種對人致病，以沙眼衣原體（CT） 常見。 沙眼衣原體 C. trachomatis 分A、B、Ba、C、D、Da、E、F、G、H、I、Ia、J、K、L1、 L2、L2a、L3等18個(gè)血清型，不同血清型能引起不同疾病。分 3個(gè)生物型，即小鼠生物型、沙眼生物型和性病淋巴肉芽腫型。 后兩者與人類疾病相關(guān)。 CT抗原結(jié)構(gòu) 屬特異性抗原：衣原體胞壁

3、脂多糖（LPS） 識別表位位于2-酮基-3-脫氧辛酸（KDO）三糖 可與腸道菌Re突變株發(fā)生交叉反應(yīng) 種特異性抗原：主要外膜蛋白（MOMP），可進(jìn)行補(bǔ)體結(jié)合 試驗(yàn)和中和試驗(yàn)檢測 型特異性抗原：位于MOMP上 沙眼衣原體(CT)感染 感染眼結(jié)膜引起沙眼，包涵體結(jié)膜炎； 沙眼衣原體是性傳播疾病的主要病原體。在男性主要引起非淋 菌性尿道炎或可合并附睪炎、前列腺炎、性病淋巴肉芽腫等； 在女性可引起尿道炎、宮頸炎、輸卵管炎、盆腔炎等。嚴(yán)重患 者可導(dǎo)致不孕及異位妊娠； 能通過性接觸或非性接觸方式感染新生兒、兒童，引起新生兒 肺炎和新生兒包涵體結(jié)膜炎，給預(yù)防沙眼衣原體感染帶來很大 困難。 沙眼衣原體(CT)

4、感染 沙眼衣原體感染 沙眼衣原體感染 沙眼衣原體(CT)感染 常與淋病奈瑟菌混合感染（50%）。淋病奈瑟菌對衣原體繁殖 起著激活和促進(jìn)作用。衣原體感染能增加人群獲得HIV的概率。 最近有研究提出，CT感染能提高患癌癥風(fēng)險(xiǎn)。CT感染可破壞 p53蛋白，增加突變細(xì)胞存活的風(fēng)險(xiǎn)，最終引發(fā)癌癥。 沙眼衣原體感染流行病學(xué) 傳播途徑：通過性接觸傳播，母嬰垂直傳播，接觸沙眼患者的 毛巾、不潔洗臉?biāo)湍樑鑲鞑ィ?在女性宮頸炎和男性尿道感染中，臨床上常表現(xiàn)為無癥狀，呈 隱性感染，成為攜帶者，更易導(dǎo)致感染傳播。 沙眼衣原體感染流行病學(xué) 據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，每年有9200萬新發(fā)的沙眼衣原體感染病例。 在美國，Dat

5、ta SD 等調(diào)查顯示，14歲-39歲的群體中，沙眼衣原體 的感染率約為4.6%； 在歐洲，Redmond S等的一項(xiàng)大規(guī)模調(diào)查顯示，18歲-26歲之間有 過性經(jīng)驗(yàn)的群體中，沙眼衣原體的感染率約為3.6%； Peters R等統(tǒng)計(jì)指出，在非洲一些國家的的鄉(xiāng)下，女性沙眼衣原體 的感染率可達(dá)16%以上； 沙眼衣原體感染流行病學(xué) 在中國 Li CL等于2012年湖北省的一項(xiàng)婚前篩查報(bào)告顯示，有3.6%的 婚前女性感染沙眼衣原體； Chen XS 等2013年一份針對女性性工作者的研究顯示，在女性 性工作者中，衣原體感染率高達(dá)17.3%； 有調(diào)查統(tǒng)計(jì)顯示，深圳地區(qū)非淋球菌性尿道炎患者中，男性患 者沙眼

6、衣原體的檢出率為30.57%，女性為21.19%。 沙眼衣原體感染防治 沙眼衣原體對阿奇霉素、強(qiáng)力霉素、喹諾酮類抗生素敏感，確 診后容易治療。 防治沙眼衣原體感染和傳播的主要難點(diǎn)在于準(zhǔn)確準(zhǔn)確、及時(shí)找到病及時(shí)找到病 原菌原菌。 CT標(biāo)本采集及運(yùn)送 標(biāo)本采集： 1.沙眼及包涵體結(jié)膜炎患者：擦凈膿性分泌物，用拭子在結(jié)膜上穹 窿或下穹窿用力涂擦，或取眼結(jié)膜刮片； 2.泌尿生殖系統(tǒng)感染患者：男性患者用無菌棉拭子插入尿道口2cm 出旋轉(zhuǎn)35秒后取出；女性患者選取宮頸移行部位采樣。 3.小兒肺炎患者：用拭子在鼻咽后部或咽部采集。 4.性病肉芽腫標(biāo)本：采集淋巴結(jié)膿汁。 標(biāo)本運(yùn)送：置于2SP培養(yǎng)基運(yùn)送，2SP培

7、養(yǎng)基含蔗糖、磷酸鹽緩 沖液、胎牛血清、抗生素等成分。 標(biāo)本采樣后5天內(nèi)檢驗(yàn)，標(biāo)本應(yīng)暫存于4。 沙眼衣原體的檢測技術(shù) 直接涂片鏡檢：檢測包涵體 細(xì)胞培養(yǎng) 抗原檢測： 直接熒光抗體測定、酶免疫測定、膠體金法 抗體檢測 核酸檢測： 核酸探針檢測、PCR、熒光定量PCR、PCR產(chǎn)物直接測序 直接涂片染色鏡檢 CT寄生于細(xì)胞內(nèi)形成包涵體，通過碘染色或吉姆薩染色可見細(xì) 胞內(nèi)包涵體 直接涂片染色鏡檢 方法學(xué)評價(jià)： 直接涂片染色鏡檢，操作簡便；包涵體的檢出對急性、嚴(yán)重的 新生兒包涵體性結(jié)膜炎的診斷價(jià)值大； 泌尿生殖道內(nèi)完整細(xì)胞少，細(xì)胞內(nèi)包涵體脆性較大，造成敏感 性較低。 細(xì)胞培養(yǎng)法 由于CT專性細(xì)胞內(nèi)寄生，可

8、用68天齡雞胚卵黃囊及各種傳代 細(xì)胞培養(yǎng)。在適宜條件下，將含CT的標(biāo)本接種于經(jīng)放線菌酮 處理過的單層小鼠成纖維細(xì)胞（McCoy）或人宮頸癌細(xì)胞 （Hela-299），孵育后染色，鏡下檢測包涵體。 衣原體細(xì)胞培養(yǎng)法 細(xì)胞培養(yǎng)步驟： 制備致密單層細(xì)胞。以Hela-299細(xì)胞為例，六孔板每孔接種75 萬細(xì)胞，孵育24小時(shí)； 以30ug/ml DEAE-葡聚糖處理細(xì)胞30min，提高細(xì)胞膜內(nèi)吞能 力； 棄掉DEAE-葡聚糖，換5ml未加血清的培養(yǎng)液，加入菌液。菌 液的量要根據(jù)菌液濃度而定，過高會(huì)造成細(xì)胞病變過快，提前 大量死亡，過少會(huì)造成陽性率過低，無法觀察或計(jì)數(shù)； 六孔板3000rpm 1238g

9、離心。通過物理作用加速促進(jìn)衣原體 進(jìn)入細(xì)胞。有文獻(xiàn)報(bào)道，通過離心可以提高感染效率100倍； 衣原體細(xì)胞培養(yǎng)法 孵箱中孵育兩小時(shí)，提供衣原體進(jìn)一步感染的時(shí)間，也給細(xì)胞 一個(gè)回復(fù)狀態(tài)的時(shí)間。 更換感染液：細(xì)胞培養(yǎng)液+1g/mL放線菌酮。 4872小時(shí)碘染色或Giemsa染色或Macchavello染色觀察結(jié)果。 衣原體細(xì)胞培養(yǎng)法 衣原體細(xì)胞培養(yǎng)法 特異性100%和敏感性80%90%。被認(rèn)為是CT檢測的“金標(biāo) 準(zhǔn)” 分離培養(yǎng)操作復(fù)雜，技術(shù)要求高，所需時(shí)間長 標(biāo)本敏感性受標(biāo)本采集、運(yùn)送、保存等的影響較大 各實(shí)驗(yàn)室技術(shù)水平不同，標(biāo)準(zhǔn)化難度大 多用于科研和臨床疑難病例的最終鑒定 膠體金法 膠體金法 衣原體

10、標(biāo)本預(yù)處理后與膠體金標(biāo)記抗體及二抗結(jié)合 優(yōu)點(diǎn)：快速簡單，半小時(shí)內(nèi)出結(jié)果，易于觀察判斷； 缺點(diǎn)：敏感性低、不能定量檢測；不同公司試劑和同一公司試 劑批間差異大。 酶免疫測定（EIA） 用ELISA方法，使用酶標(biāo)記的單克隆或多克隆抗體檢測CT的可 溶性抗原。常用脂多糖（LPS）單克隆抗體或多克隆抗體進(jìn)行檢 測。 酶免疫測定（EIA） 敏感性為64%98%，特異性為93%98% 簡便。適用于自動(dòng)化。適于短時(shí)間內(nèi)大批量標(biāo)本的檢測 與其它微生物感染偶有交叉反應(yīng)，如金黃色葡萄球菌、淋病奈 瑟菌、A群、B群鏈球菌等。 微量熒光免疫法抗體檢測 檢測患者血清中有無CT抗體。 性病性淋巴肉芽腫、附睪炎、輸卵管炎患

11、者血清中CT水平明 顯升高，該方法有助于診斷。 部分患者感染CT后并不產(chǎn)生或僅產(chǎn)生少量抗體，此時(shí)檢測容 易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。 檢測重復(fù)性差，目前并無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。不建議單獨(dú)用于CT感染 診斷。 直接熒光抗體測定（DFA） 用熒光物標(biāo)記CT單克隆或多克隆抗體（多為抗沙眼衣原體 MOMP單克隆抗體），與相應(yīng)抗原結(jié)合反應(yīng)，直接進(jìn)行觀察。 直接熒光抗體測定（DFA） 在男性和女性樣本中敏感性分別為70%100%和68%100%，特 異性分別為87%99%和82%100%； 檢測快速簡便； 不像培養(yǎng)法必須有活力的CT。對子宮內(nèi)膜和輸卵管樣本，DFA法 敏感性高于培養(yǎng)法，且適用于直腸樣本； 敏感性與特異性取決于

12、單克隆或多克隆抗體； 熒光容易淬滅，結(jié)果判斷有主觀性和經(jīng)驗(yàn)性，不適合于大批量樣 本檢測。 核酸雜交法 用125I標(biāo)記CT rDNA探針檢測宮頸拭子。敏感性與特異性分別 為細(xì)胞培養(yǎng)法的82.8%和99.4%。 用吖啶酯標(biāo)記單鏈DNA探針，與標(biāo)本中 CT rRNA雜交，用化 學(xué)發(fā)光法測定。敏感性與特異性分別為60%93%和95.8% 98.8%。 PCR檢測 提取DNA，設(shè)計(jì)引物及探針，擴(kuò)增特定DNA片段 1.普通PCR：易污染引起假陽性，不能定量檢測。 2.熒光定量PCR：全閉管擴(kuò)增系統(tǒng)，避免污染；以參照物為標(biāo) 準(zhǔn)，能對拷貝數(shù)進(jìn)行定量分析。 熒光定量PCR檢測 PCR檢測 特異性高，敏感性好。熒

13、光定量PCR無電泳所致的交叉污染 定量檢測。目前有研究認(rèn)為泌尿生殖系統(tǒng)中CT的感染量與患者 的臨床表現(xiàn)有關(guān)。CT定量檢測有助于臨床診斷與療效判斷。 男性可以以尿標(biāo)本代替?zhèn)鹘y(tǒng)的尿道拭子，方便收集樣本，容易為 患者接受。 可以設(shè)計(jì)同一病原體不同DNA片段的二重PCR技術(shù)，有效檢測某 一目的基因發(fā)生突變的標(biāo)本。 可以檢測不同病原體的二重PCR，如雅培公司CT/NG試劑盒。 較傳統(tǒng)檢測方法通量高，適用于大規(guī)模流行病學(xué)研究。 EIA、PCR、DFA三種方法比較 PCR產(chǎn)物直接測序 CT MOMP基因經(jīng)過PCR擴(kuò)增后，再將PCR產(chǎn)物測序，可以完 成對CT的分型檢測。 單血清型CT感染檢測的金標(biāo)準(zhǔn)。 適于單

14、血清型CT感染分型檢測及大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查。 測序方法不適于雙重或多重感染。而CT雙重或多重感染率為 5%15% CT檢測技術(shù)的應(yīng)用 在STI流行病學(xué)研究中的應(yīng)用 不同地區(qū)，不同人群，CT基因分型不同。瑞典E型（47%）為 主，西班牙D型為主（45.3%），深圳F、E、J各占20%左右。 澳大利亞女性和男性同性戀：女性E型感染率高于男性（17% vs3%），而D型低于女性（ 7% vs54% ）。CT檢測技術(shù)即分型 技術(shù)，有利于CT的防治。 CT檢測的臨床應(yīng)用 研究發(fā)現(xiàn)，E型感染易出現(xiàn)無癥狀感染；F型和G型下腹痛癥狀 嚴(yán)重。 謝謝！ 沙眼衣原體感染流行病學(xué) 傳播途徑：通過性接觸傳播，母嬰垂直傳

15、播，接觸沙眼患者的 毛巾、不潔洗臉?biāo)湍樑鑲鞑ィ?在女性宮頸炎和男性尿道感染中，臨床上常表現(xiàn)為無癥狀，呈 隱性感染，成為攜帶者，更易導(dǎo)致感染傳播。 沙眼衣原體感染流行病學(xué) 在中國 Li CL等于2012年湖北省的一項(xiàng)婚前篩查報(bào)告顯示，有3.6%的 婚前女性感染沙眼衣原體； Chen XS 等2013年一份針對女性性工作者的研究顯示，在女性 性工作者中，衣原體感染率高達(dá)17.3%； 有調(diào)查統(tǒng)計(jì)顯示，深圳地區(qū)非淋球菌性尿道炎患者中，男性患 者沙眼衣原體的檢出率為30.57%，女性為21.19%。 膠體金法 核酸雜交法 用125I標(biāo)記CT rDNA探針檢測宮頸拭子。敏感性與特異性分別 為細(xì)胞培養(yǎng)法的82.8%和99.4%。 用吖啶酯標(biāo)記單鏈DNA探針，與標(biāo)本中 CT rRNA雜交，用化 學(xué)發(fā)光法測定。敏感性