臨床樣本的采集運(yùn)輸和保存及核酸提取課件

1、臨床標(biāo)本的采集、處理、運(yùn)送與臨床標(biāo)本的采集、處理、運(yùn)送與 保存及保存及DNA/RNADNA/RNA提取提取 研究背景研究背景 l 樣本的采集、處理樣本的采集、處理 l 樣本的保存樣本的保存 l 樣本的運(yùn)輸樣本的運(yùn)輸 l DNADNA的提取的提取 l RNARNA的提取的提取 研究背景研究背景 一、樣本的采集、處一、樣本的采集、處 理、保存及運(yùn)輸理、保存及運(yùn)輸 （一）、樣本的采集（一）、樣本的采集 地貧檢測(cè)樣品采集：地貧檢測(cè)樣品采集： l 外周血外周血: 5mL l 臍帶血臍帶血: 0.51mL l 羊羊 水：水：2030mL l 絨絨 毛：毛：15mg l 唾唾 液液 l 組組 織織 研究背景

2、研究背景 二、核酸的提取二、核酸的提取 細(xì)胞破碎方法細(xì)胞破碎方法 應(yīng)用應(yīng)用 機(jī)械法機(jī)械法 1.1.勻漿法勻漿法機(jī)體軟組織機(jī)體軟組織 2.2.搗碎法搗碎法動(dòng)物韌性組織動(dòng)物韌性組織 3.3.研磨法研磨法細(xì)菌、酵母細(xì)菌、酵母 物理法物理法 1.1.超聲法超聲法細(xì)胞混懸液細(xì)胞混懸液 2.2.反復(fù)凍融法反復(fù)凍融法培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞 3.3.冷熱交替法冷熱交替法細(xì)菌、病毒細(xì)菌、病毒 4.4.低滲裂解低滲裂解紅細(xì)胞紅細(xì)胞 化學(xué)法化學(xué)法 1.1.有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑細(xì)菌、酵母、血液細(xì)菌、酵母、血液 2.2.去垢劑去垢劑組織、培養(yǎng)細(xì)胞、組織、培養(yǎng)細(xì)胞、 血液血液 3.3.酶解法酶解法細(xì)菌、酵母、血液細(xì)菌、酵母、血液

3、(A值等于1時(shí)，相當(dāng)于50g/ml雙鏈DNA， 40g/ml單鏈DNA或RNA， 20g/ml單鏈寡核苷酸） EB與DNA的結(jié)合 A260/A280比值是純度檢測(cè)的重要指標(biāo)！比值是純度檢測(cè)的重要指標(biāo)！ 注：注：測(cè)定吸光值，稀釋液應(yīng)使用測(cè)定吸光值，稀釋液應(yīng)使用 DNA完整性鑒定：完整性鑒定： 正常時(shí)，正常時(shí)，28S RNA的熒光強(qiáng)度的熒光強(qiáng)度 約為約為18S RNA的的 2倍，否則提示倍，否則提示 RNA的降解的降解 RNA完整性鑒定：完整性鑒定： 抗凝劑處理血 肝素檸檬酸*EDTA* -80 保存2個(gè)月，第10天收率90% 4 第四天收率90% 第10天提取效 果差 第十天收率85% 室溫 提

4、取效果差第四天收率90% 第十天提取效果差 酚酚 抽抽 提提 法法 提提 取取 步步 驟：驟： DNA酚抽提法示意圖 影響影響DNA質(zhì)量的因素質(zhì)量的因素 組織材料組織材料起始樣品量起始樣品量Total RNA提取量提取量 blood1ml1520g leukocytes110107 7個(gè)個(gè)約約100 g Liver tissue1g約約5000 g Culture cells110107 7個(gè)個(gè)約約100g Renal tissue1g約約3000g Skeleton tissue1g約約1500g Cerebral tissue1g約約1500g 1. 內(nèi)源性內(nèi)源性RNA酶（酶（intrinsic RNase） O C-CH2-CH3 O C-CH2-CH3 O = DEPC水制備：0.1%DEPC 在37C處理1h，并高壓 滅菌15min。 玻璃制品和塑料制品應(yīng)浸 泡在0.1%的DEPC水溶液 中， 37C處理1h或室溫 下過(guò)夜。 DEPC非選擇性的修飾蛋白質(zhì)和非選擇性