藥品微生物限度與無菌檢查

1、Luzhou Institutes for Food and Drug Control 藥品微生物限度與無菌檢查藥品微生物限度與無菌檢查 風(fēng)險管理風(fēng)險管理 風(fēng)險調(diào)查風(fēng)險調(diào)查/ /評估評估 微生物實驗微生物實驗 室技術(shù)能力室技術(shù)能力 藥品微生物控制藥品微生物控制 風(fēng)險管理、風(fēng)險調(diào)查風(fēng)險管理、風(fēng)險調(diào)查/ /評估評估 Luzhou Institutes for Food and Drug Control 藥品微生物檢驗的過程控制藥品微生物檢驗的過程控制 環(huán)境保證培養(yǎng)基保證 無菌性檢查 靈敏度檢查 有效的方法方法驗證SOP操作 有效的結(jié)果 可靠的結(jié)論 結(jié)果判斷 過程控制 Luzhou Institut

2、es for Food and Drug Control Luzhou Institutes for Food and Drug Control USP35USP35部分章節(jié)部分章節(jié)中國藥典中國藥典20152015年版年版 Antimicrobial Effectiveness Testing 抑菌效力檢查法抑菌效力檢查法 Biological Indicators-Resistance Performance Tests 生物指示劑抗性檢查法生物指示劑抗性檢查法 Microbiological Examination of Nonsterile Products: Microbial Enu

3、meration Tests 非無菌產(chǎn)品微生物檢查：微生物計數(shù)法非無菌產(chǎn)品微生物檢查：微生物計數(shù)法 Microbiological Examination of Nonsterile Products: Tests for Specified Microorganisms 非無菌產(chǎn)品微生物檢查：控制菌檢查法非無菌產(chǎn)品微生物檢查：控制菌檢查法 Microbiological Attributes of Nonsterile Pharmaceutical Product 非無菌藥品微生物限度標準非無菌藥品微生物限度標準 Mycoplasma Tests 支原體檢查法支原體檢查法 Sterility

4、 Tests 無菌檢查法無菌檢查法 Biological Indicators for Sterilization 滅菌用生物指示劑指導(dǎo)原則滅菌用生物指示劑指導(dǎo)原則 Aplication of Water Activity Determination to Nonsterile Pharmaceutical Products 水活度檢查法用于非無菌藥品微生物評價水活度檢查法用于非無菌藥品微生物評價 Microbial Characterization, Identification, and Strain Typing 微生物鑒定指導(dǎo)原則微生物鑒定指導(dǎo)原則 Microbiological Ev

5、alution of Clean Rooms and Other Controlled Environments 藥品潔凈實驗室微生物監(jiān)測和控制指導(dǎo)原則藥品潔凈實驗室微生物監(jiān)測和控制指導(dǎo)原則 Microbiological Best Laboratory Practices 藥品微生物實驗室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則藥品微生物實驗室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則 Sterility Testing-Validation of Isolator Systems 無菌檢查用隔離器系統(tǒng)驗證指導(dǎo)原則無菌檢查用隔離器系統(tǒng)驗證指導(dǎo)原則 Sterilization and Sterility Assurance of Compen

6、dial Articles 滅菌法滅菌法 Validation of Alternative Microbiological Methods 藥品微生物檢驗替代方法驗證指導(dǎo)原則藥品微生物檢驗替代方法驗證指導(dǎo)原則 / 非無菌藥品微生物限度檢測指導(dǎo)原則非無菌藥品微生物限度檢測指導(dǎo)原則 /（日本藥典收載）（日本藥典收載） 中藥飲片微生物限度檢查法？中藥飲片微生物限度檢查法？ 藥品微生物檢驗的過程控制藥品微生物檢驗的過程控制 環(huán)境保證培養(yǎng)基保證 無菌性檢查 靈敏度檢查 有效的方法方法驗證 SOP操作 有效的結(jié)果 可靠的結(jié)論 結(jié)果判斷 無菌檢查用隔離系無菌檢查用隔離系 統(tǒng)驗證指導(dǎo)原則統(tǒng)驗證指導(dǎo)原則 藥品

7、微生物實驗室藥品微生物實驗室 質(zhì)量管理指導(dǎo)原則質(zhì)量管理指導(dǎo)原則 藥品潔凈實驗室微生物藥品潔凈實驗室微生物 檢測和控制指導(dǎo)原則檢測和控制指導(dǎo)原則 微生物鑒定微生物鑒定 指導(dǎo)原則指導(dǎo)原則 藥品微生物檢驗替代藥品微生物檢驗替代 方法驗證指導(dǎo)原則方法驗證指導(dǎo)原則 對照培養(yǎng)基 al Institutes for Food and Drug Control 案例案例 陽性結(jié)果與玻璃安瓿表面采樣菌高度相陽性結(jié)果與玻璃安瓿表面采樣菌高度相 似似 Nation Luzhou Institutes for Food and Dr 無菌檢查過程微生物控制無菌檢查過程微生物控制 空氣微生空氣微生 物物 浮游菌 沉降菌

8、 表面微生物表面微生物 樣品包裝表面 操作人員手部 易折方式影響折斷力易折方式影響折斷力 色環(huán)：通過在瓶頸噴涂與玻 璃膨脹系數(shù)不同的色釉產(chǎn)生 應(yīng)力，從而使斷面平整 灌裝工藝落后造成折斷灌裝工藝落后造成折斷 力差力差 為防止灌裝中安瓿斷頭 安瓿折斷后，斷安瓿折斷后，斷 面應(yīng)平整。面應(yīng)平整。 Luzhou Institutes for Food and Drug Control 國家藥用包裝容器國家藥用包裝容器 （材料）標準（材料）標準 YBB00332002YBB00332002 點刻痕易折玻璃安瓿點刻痕易折玻璃安瓿 點刻痕易折安瓿的色點應(yīng)標記在刻痕的上方中心點刻痕易折安瓿的色點應(yīng)標記在刻痕的上

9、方中心 與中心線的偏差不得過與中心線的偏差不得過1.0mm1.0mm 刻痕工藝控制不好刻痕工藝控制不好 深淺、長短、高低位置不一 色點和刻痕位置偏離 規(guī)格尺寸不規(guī)范規(guī)格尺寸不規(guī)范 瓶身 外徑精度不夠 刻痕不易控 制 瓶頸壁厚不均勻 折斷后 斷面不平整 玻璃材質(zhì)不佳玻璃材質(zhì)不佳 低 硼硅玻璃：48.6% 中性 硼硅玻璃：7.7% 我國 90%以上低硼硅玻璃 玻璃安瓿表面消毒方案比較玻璃安瓿表面消毒方案比較 Luzhou Institutes for Food and Drug Control 殺孢子劑（過氧乙酸）噴灑后立即（3min、5min、10min）用 75%乙醇鈍化，再用濕棉簽擦拭取樣

10、酒精燈過火1秒鐘（3秒鐘、5秒鐘、10秒鐘）后直接用濕棉簽 擦拭取樣 表面消毒方案表面消毒方案作用時間作用時間殘留菌落數(shù)殘留菌落數(shù)菌屬類型菌屬類型 殺孢子劑立即2cfuBacillus 3min0cfu/ 5min0cfu/ 10min0cfu/ 棉簽擦拭&過火1秒鐘4cfu Bacillus、Brevibacillus 3秒鐘10cfu Bacillus、Paenibacillus、Brevibacillus 5秒鐘0cfu/ 10秒鐘0cfu/ 微生物檢驗的過程控制微生物檢驗的過程控制 環(huán)境保證培養(yǎng)基保證 無菌性檢查 靈敏度檢查 有效的方法方法驗證SOP操作 有效的結(jié)果 可靠的結(jié)論 結(jié)果判

11、斷 過程控制 Luzhou Institutes for Food and Drug Control 微生物實驗室工作流程微生物實驗室工作流程 Luzhou Institutes for Food and Drug Control 環(huán)境保障環(huán)境保障 WHO GPML 各區(qū)域等級 Luzhou Institutes for Food and Drug Control 微生物限度微生物限度 & & 無菌檢查環(huán)境要無菌檢查環(huán)境要 求求 無菌檢查：無菌檢查： 環(huán)境潔凈度環(huán)境潔凈度B B級背景下的局部級背景下的局部A A級潔凈度的單向流空氣區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)中級潔凈度的單向流空氣區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)中 B+A

12、B+Aoror隔離系統(tǒng)隔離系統(tǒng) 中國藥典中國藥典20102010版版 萬級下的百級萬級下的百級 中國藥典中國藥典20152015版版 藥品潔凈藥品潔凈 實驗室微生物監(jiān)測和控制實驗室微生物監(jiān)測和控制 指導(dǎo)原則指導(dǎo)原則 無菌檢查用隔離系統(tǒng)驗證指導(dǎo)原無菌檢查用隔離系統(tǒng)驗證指導(dǎo)原 則則 Luzhou Institutes for Food and Drug Control 92059205 92069206 微生物限度檢查：微生物限度檢查： 受控潔凈環(huán)境下的局部潔凈度不低于受控潔凈環(huán)境下的局部潔凈度不低于B B級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)級的單向流空氣區(qū)域內(nèi) D+BSCD+BSC生物安全柜生物安全柜 潔凈室潔

13、凈室/ /臺工作原理臺工作原理 層流層流 Laminar flowLaminar flow 混流 Conventional (mixed flow) cleanroomConventional (mixed flow) cleanroom Luzhou Institutes for Food and Drug Control Luzhou Institutes for Food and Drug Control 相關(guān)潔凈標準比較相關(guān)潔凈標準比較 ISO 14644討論了潔凈室和受控環(huán)境的設(shè)計與建設(shè) 按ISO 14644的分類分類是建立在環(huán)境中每單位體積的總體粒子數(shù)粒子數(shù)的基礎(chǔ)上 分類不區(qū)分非生

14、物粒子或生物粒子 相關(guān)潔凈標準比較相關(guān)潔凈標準比較 2010版GMP潔凈度級別標準 “靜態(tài)靜態(tài)”百級，百級，“動態(tài)動態(tài)”萬級萬級 Luzhou Institutes for Food and Drug Control 相關(guān)潔凈標準比較相關(guān)潔凈標準比較 20152015版版 建議的潔凈實驗室環(huán)境監(jiān)測頻次及項建議的潔凈實驗室環(huán)境監(jiān)測頻次及項 目目 按ISO 14644的定級定級是建立在環(huán)境中每單位體積的總體粒子數(shù)粒子數(shù)的基礎(chǔ)上 Luzhou Institutes for Food and Drug Control 定級定級不區(qū)分非生物粒子或生物粒子 受控區(qū)域受控區(qū)域潔凈級別潔凈級別采樣頻次采樣頻次

15、檢測項目檢測項目 粒子粒子 相鄰?fù)獠棵堪肽炅Ｗ恿Ｗ?、浮游菌?沉降菌、表面菌 粒子粒子 B級每周粒子粒子、浮游菌、 沉降菌、表面菌 粒子粒子 D級每半年粒子粒子、浮游菌、 沉降菌、表面菌 Luzhou Institutes for Food and Drug C “B級級”與與“C級級”的異同的異同 ontrol 懸浮粒子與環(huán)境微生物懸浮粒子與環(huán)境微生物 Luzhou Institutes for Food and Drug Control 非生物粒子數(shù)量和活的微生物濃度之間的關(guān)系在科學(xué) 上未達成絕對的一致 當操作人員是粒子的來源時，以下的結(jié)論是成立的， 即潔凈室中的粒子越少，空氣中微生物存在

16、的可能性就潔凈室中的粒子越少，空氣中微生物存在的可能性就 越小越小。 實驗設(shè)備運行時大量產(chǎn)生的粒子污染和人員產(chǎn)生的粒 子污染之間是無法明確區(qū)分的 大量的藥物除了微生物以外還有粒子限度的要求 幾乎肯定的是，部分懸浮粒子與微生物有關(guān) 因此，潔凈室監(jiān)測應(yīng)包括微生物微生物與粒子粒子數(shù)兩方面 潔凈室使用次數(shù)與浮游菌數(shù)關(guān)系潔凈室使用次數(shù)與浮游菌數(shù)關(guān)系 4 16#浮游菌數(shù) 2 0 1月2月3月4月5月6月7月8月9月10月 11月 12月 6 8 10 16 14 12 13#使用次數(shù) 13#浮游菌數(shù) 16#使用次數(shù) Luzhou Institutes for Food and Drug Control 近

17、近8 8年無菌室年無菌室C C級浮游菌高限圖級浮游菌高限圖 9090 8080 7070 6060 5050 4040 3030 2020 1010 0 0 2007200720082008200920092010201020112011201220122013201320142014 7 7月月 8 8月月 9 9月月 硬件差異 軟件差異 Luzhou Institutes for Food and Drug Control 潔凈區(qū)微生物監(jiān)測水平 USP35USP35 15 cfu 15 cfu 信息性，信息性， 非標準性非標準性 Luzhou Institutes for Food and

18、 Drug Control 監(jiān)控基于風(fēng)險評估監(jiān)控基于風(fēng)險評估 120 100 80 60 40 20 0 法規(guī)標準 OOT行動限 OOE警戒限 常規(guī)波動 WHO good practices for pharmaceutical microbiology laboratories Appendix 4 Examples of equipment qualification and monitoring Luzhou Institutes for Food and Drug Control 環(huán)境微生物歸屬環(huán)境微生物歸屬 Luzhou Institutes for Food and Drug Co

19、ntrol Luzhou Institutes for Food and Drug Control 欣弗事件欣弗事件 欣弗培養(yǎng)物 潔凈環(huán)境常見菌： 頭狀葡萄球菌（Staphylococcus capitis） 溶血葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus） 緩癥鏈球菌（Streptococcus mitis） 科氏葡萄球菌（Staphylococcus cohnii） 藤黃微球菌（Micrococcus luteus） 山羊葡萄球菌 （Staphylococcus caprae） 肺炎克雷伯巨大芽孢桿菌粘質(zhì)沙雷菌 奪命的欣弗 編號鑒定結(jié)果 0206L1、肺炎克雷伯（K.

20、pneumoniae ）； 2、粘質(zhì)沙雷菌（S.marcescens） 0206G1、肺炎克雷伯（K.pneumoniae ）； 2、粘質(zhì)沙雷菌（S.marcescens） 298L； 298G 1、肺炎克雷伯（K. pneumoniae ）； 2、粘質(zhì)沙雷菌（S.marcescens） 303L； 303G 1、肺炎克雷伯（K.pneumoniae ）； 2、陰溝腸桿菌（Enter. cloacae） 305L； 305G 1、肺炎克雷伯（K. pneumoniae ）； 2、粘質(zhì)沙雷菌（S.marcescens） 306L/6G肺炎克雷伯（K.pneumoniae ） 307G肺炎克雷伯（

21、K.pneumoniae ） 308L糞產(chǎn)堿桿菌（Al.faecalis） 309L糞產(chǎn)堿桿菌（Al.faecalis） 304G嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌（S.maltophilia） 不同生物安全水平對設(shè)施的要求不同生物安全水平對設(shè)施的要求 Luzhou Institutes for Food and Drug Control 不同保護類型及生物安全柜的選擇不同保護類型及生物安全柜的選擇 Luzhou Institutes for Food and Drug Control I級安全柜適用于一級，二級和三級安全實驗室， II級和III級安全柜則適用于所有級別安全實驗室。 保護類型生物安全柜的選擇 個

22、體防護，針對生物危險等級13級微生物級、級生物安全柜 個體防護，針對生物危險等級4級微生物， 手套箱型實驗室 級生物安全柜 個體防護，針對生物危險等級4級微生物， 防護服型實驗室 級、級生物安全柜 實驗對象保護級生物安全柜，柜內(nèi)氣流是層 流的級生物安全柜 少量揮發(fā)性放射性核素化學(xué)品的防護級B1型生物安全柜，外排風(fēng)式 級A2型生物安全柜 揮發(fā)性放射性核素化學(xué)品的防護級、級B2型、級生物安全 柜 Luzhou Institutes for Food and Drug Control Class I 生物安全柜生物安全柜 適用于樣品不需保護的工作適用于樣品不需保護的工作 1、從前窗口吸入的負壓氣流，

23、 用以保護人員的安全； 2、排出 的氣流經(jīng)HEPA過濾器過 濾，用 以保護環(huán)境，不受污染； 3、對 受試樣本，不能提供切實 可靠 的保護。 無外接風(fēng)道有外接風(fēng)道 Contaminated air under negative pressure Contaminated air under positive pressure HEPA-filtered air Room air Luzhou Institutes for Food and Drug Control II級級A2型生物安全柜型生物安全柜 前窗進風(fēng)氣流平均流速 0.50m/s 生物安全柜排風(fēng)管道接 口 與建筑物排風(fēng)系統(tǒng)相連 接 可以

24、從事少量的的揮發(fā) 性 有毒化學(xué)物質(zhì)或放射性 的 工作。 Luzhou Institutes for Food and Drug Control 在生物安全柜上工作在生物安全柜上工作 干凈的物品 工作臺擺放 被污染的區(qū)域 廢棄物托盤 垃圾袋 Luzhou Institutes for Food and Drug Control 無菌隔離系統(tǒng)與傳統(tǒng)潔凈技術(shù)的對比無菌隔離系統(tǒng)與傳統(tǒng)潔凈技術(shù)的對比 Luzhou Institutes for Food and Drug Control 項目項目消毒消毒/ /滅菌方滅菌方 法法 潔凈環(huán)境的潔凈環(huán)境的 控制控制 對操作人員對操作人員 的防護的防護 物料傳送

25、方物料傳送方 式式 人員進出人員進出運行所需能運行所需能 耗耗 誤操作導(dǎo)致誤操作導(dǎo)致 的無菌環(huán)境的無菌環(huán)境 污染的風(fēng)險污染的風(fēng)險 傳統(tǒng) 潔凈 技術(shù) 消毒劑擦拭/ 熏蒸/紫外線 照射等方法受 空間等諸多因 素影響效果難 以驗證 易受人員、 物料等諸多 因素影響， 易受污染， 難以控制； 取決于操作 人員自身技 術(shù)和熟練程 度； 傳統(tǒng)的傳遞 窗，易導(dǎo)致 無菌室環(huán)境 破壞和物料 的污染； 需復(fù)雜的換 鞋/工作服 更換等步驟 帶來額外工 作量； 高 ， 誤操作可能 性大，與操 作人員有較 大相關(guān)性 無菌 隔離 器技 術(shù) 自動氣體滅菌 省時省力， 氣 體分布均勻 效 果較好，容 易 驗證； ， 與外界完

26、 全 隔離，僅 通 ， 過HEPA進 行 空氣交換 并 可恒定艙 內(nèi) 壓力以阻 絕 外界污染； 安全系數(shù)高雙門快速傳 遞系統(tǒng)保證 在無菌環(huán)境 中傳遞，無 菌保證程度 高； 僅通穿戴手 套/半身工 作服即可； 低可能性極小 Na 隔離器隔離器 2x3-glove Isotest H2O2溶液被泵入蒸發(fā)器 液態(tài)H2O2 氣態(tài)H2O2 10 SAL表面殺滅效率 -6 tional Institutes for Food and Drug Control 隔離器隔離器 9209206 6 無菌檢查用隔離系統(tǒng)驗證指導(dǎo)原則無菌檢查用隔離系統(tǒng)驗證指導(dǎo)原則 1.操作驗證 3.滅菌驗證 4.滅菌循環(huán)驗證 2.完

27、整性驗證 5.內(nèi)部潔凈度驗證 6.儀器儀表驗證 Luzhou Institutes for Food and Drug Control Luzhou Institutes forFood and Drug Control 三種主要設(shè)備比較三種主要設(shè)備比較 生物安全柜生物安全柜層流柜層流柜無菌隔離器無菌隔離器 人員保護 環(huán)境要求 樣品保護 處理樣品靈活性 操作難度 運行維護難度 微生物檢驗的過程控制微生物檢驗的過程控制 環(huán)境保證培養(yǎng)基保證培養(yǎng)基保證 無菌性檢查無菌性檢查 靈敏度檢查靈敏度檢查 有效的方法方法驗證SOP操作 有效的結(jié)果 可靠的結(jié)論 結(jié)果判斷 過程控制 Luzhou Institut

28、es for Food and Drug Control ChPChP無菌檢查培養(yǎng)基與無菌檢查培養(yǎng)基與USPUSP、BPBP的比較的比較 Luzhou Institutes for Food and Drug Control 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（Fluid Thioglycollate Medium） 藥典藥典USPUSPBPBP中國藥典中國藥典-2015-2015 名稱名稱Fluid Thioglycollate Fluid Thioglycollate Medium Medium 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng) 基基 Fluid Thioglycollate Fluid Thiog

29、lycollate Medium Medium 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng) 基基 Fluid Thioglycollate Fluid Thioglycollate Medium Medium 硫乙醇酸鹽流體培硫乙醇酸鹽流體培 養(yǎng)基養(yǎng)基 目的目的培養(yǎng)需氧、厭氧和微需氧微培養(yǎng)需氧、厭氧和微需氧微 生物生物（主要是厭氧菌）（主要是厭氧菌） 培養(yǎng)需氧、厭氧和微需氧微培養(yǎng)需氧、厭氧和微需氧微 生物生物（主要是厭氧菌）（主要是厭氧菌） 培養(yǎng)需氧、厭氧微生物培養(yǎng)需氧、厭氧微生物 培養(yǎng)條件培養(yǎng)條件1414天于天于30-35 30-35 C C及及20-25 20-25 C C 配方配方 Pancr

30、eatic Digest of Casein(Pancreatic Digest of Casein(胰酪蛋白胨胰酪蛋白胨).15.0 g Yeast ).15.0 g Yeast Extract(Extract(酵母浸出粉酵母浸出粉) .5.0 g) .5.0 g Dextrose(Dextrose(葡萄糖葡萄糖).5.5 g).5.5 g Sodium Chloride(Sodium Chloride(氯化鈉氯化鈉).2.5 g).2.5 g L-Cystine( L-L-Cystine( L-胱氨酸胱氨酸) .0.5 g) .0.5 g Sodium Thioglycollate (So

31、dium Thioglycollate (硫乙醇酸鈉硫乙醇酸鈉).0.5 g Agar( ).0.5 g Agar( 瓊瓊 脂脂).0.75 g).0.75 g Resazurin( Resazurin( 刃天青刃天青) .1.0 mg) .1.0 mg ChPChP無菌檢查培養(yǎng)基與無菌檢查培養(yǎng)基與USPUSP、BPBP的比較的比較 Luzhou Institutes for Food and Drug Control 大豆胰酪胨培養(yǎng)基(TSB) & 改良馬丁培養(yǎng)基 藥典藥典USP36BP-2013中國藥典中國藥典2010版版中國藥典中國藥典2015版版 名稱名稱Tryptic Soy Bro

32、th (Soybean casein Soybean casein digest medium)digest medium)大豆胰酪大豆胰酪 胨培養(yǎng)胨培養(yǎng) 基基 改良馬丁培養(yǎng)基改良馬丁培養(yǎng)基胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基 配方配方 胰酪蛋白胨胰酪蛋白胨.7.0g 大豆木瓜蛋白酶消化物大豆木瓜蛋白酶消化物 .3.0g 氯化鈉氯化鈉.5.0g 磷酸氫二鉀磷酸氫二鉀.2.5g 一水葡萄糖一水葡萄糖.2.5g 蛋白胨蛋白胨.5.0g 酵酵 母浸出粉母浸出粉.2.0g 葡萄糖葡萄糖.20.0g 磷磷 酸氫二鉀酸氫二鉀.1.0g 硫酸鎂硫酸鎂 (MgSO4.7H2O).0.5g 胰酪胨胰酪胨 1

33、7.0g 17.0g 大豆木大豆木 瓜蛋白酶水解物瓜蛋白酶水解物 3.0g3.0g 氯化鈉氯化鈉 5.0g5.0g 磷酸氫二鉀磷酸氫二鉀2.5g2.5g 葡萄糖葡萄糖/ /無水葡萄糖無水葡萄糖 2.5g /2.3g2.5g /2.3g 目的目的支持廣泛微生物的生長支持廣泛微生物的生長, ,包括需氧菌包括需氧菌 專性和兼性厭氧菌、專性和兼性厭氧菌、真菌（主要是真菌（主要是 需氧菌）需氧菌） 、用于培養(yǎng)、用于培養(yǎng)真菌真菌支持廣泛微生物的生長支持廣泛微生物的生長, ,包包 括需氧菌、專性和兼性厭氧括需氧菌、專性和兼性厭氧 菌、菌、真菌（主要是需氧菌）真菌（主要是需氧菌） 培養(yǎng)培養(yǎng) 條件條件 14天于

34、天于30-35 C及及20-25 C14天于天于20-25 C14天于天于30-35 C及及20-25 C 微生物實驗室常用菌株微生物實驗室常用菌株 銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) CMCC(B B) 10104 大腸埃希菌（Escherichia coli） CMCC(B B) 44102 金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) CMCC(B B) 26003 生孢梭菌(Clostridium sporogenes) CMCC(B B) 64941 枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)G+芽孢桿菌 CMCC(B B) 63

35、501 G-桿菌 G+球菌 酵母菌 霉菌 兼性需氧菌 專性厭氧菌 專性需氧菌 白色念珠菌 (Candida albicans) CMCC(F F) 98001 黑曲霉 (Aspergillus niger) CMCC(F F) 98003 Luzhou Institutes for Food and Drug Control Luzhou Institutes for Food and Drug Control 在硫乙中生長差異在硫乙中生長差異 僅僅 在在 厭厭 氧氧 層層 生生 長長 需需 氧氧 層層 厭厭 氧氧 層層 均均 生生 長長 銅綠假銅綠假 單胞菌單胞菌 ( (PseudomPse

36、udom onas onas aeruginoaerugino sasa) ) 僅僅 在在 需需 氧氧 層層 生生 長長 CMCC(B) 10104CMCC(B) 10104 大腸埃希菌（大腸埃希菌（Escherichia coliEscherichia coli） CMCC(B) 44102CMCC(B) 44102 金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌 ( (Staphylococcus aureusStaphylococcus aureus) ) CMCC(B) 26003CMCC(B) 26003 生孢梭菌生孢梭菌( (Clostridium sporogenesClostridium spo

37、rogenes) ) CMCC(B) 64941CMCC(B) 64941 枯草芽孢桿菌枯草芽孢桿菌 ( (Bacillus subtilisBacillus subtilis) ) CMCC(B) 63501CMCC(B) 63501 方法適用性內(nèi)容修訂方法適用性內(nèi)容修訂 Luzhou Institutes for Food and Drug Control Luzhou Institutes for Food and Drug Control 微生物計數(shù)定義變化 修訂前修訂后內(nèi)容 細菌數(shù) 營養(yǎng)瓊脂 霉菌和酵母菌數(shù) 玫瑰紅鈉瓊脂 （1）需氧菌總數(shù)（TAMC）。 （2）霉菌和酵母菌總數(shù)（TYM

38、C）。 （3）需氧菌總數(shù)：生長在胰酪大豆胨瓊脂（TSA）上所 有菌落(包括霉菌和酵母菌)。 （4）霉菌和酵母菌總數(shù)：一般指生長在沙氏葡萄糖瓊 脂（SDA）上的所有菌落(包括細菌)。如果由于細菌 的 生長而使霉菌和酵母菌的計數(shù)結(jié)果不符合微生物 限度要 求，可使用含有抗生素的SDA重新計數(shù)。 對照培養(yǎng)基 培養(yǎng)基質(zhì)量控制：培養(yǎng)基質(zhì)量控制： USP之前驗證過的 中國藥典對照培養(yǎng)基對照培養(yǎng)基 單劑量免稱量獨立包裝 專利號： ZL200920108836.8 回收率 待測培養(yǎng)基平均菌落數(shù)（cfu ） *100% 對照培養(yǎng)基平均菌落數(shù)（cfu） Luzhou Institutes for Food and

39、Drug Control 50%200% Luzhou Institutes for Food and Drug Control 培養(yǎng)基適用性檢查 范圍液體、固體培養(yǎng)基 加菌量不大于100cfu 培養(yǎng) 溫度 胰酪大豆胨瓊脂：3035 培養(yǎng)； 胰酪大豆 胨肉湯：3035 培養(yǎng)； 沙氏葡萄糖瓊脂： 2025 培養(yǎng)。 培養(yǎng) 時間 細菌不大于72h，真菌不大于5天。 可接受 標準 固體培養(yǎng)基：50200（0.52） 液體培養(yǎng)基：生長良好。 Luzhou Institutes for Food and Drug Control 培養(yǎng)基適用性檢查 培養(yǎng)基名稱胰酪大豆胨肉湯（TSB） 無菌性檢查取已滅菌的T

40、SB，于30-35培養(yǎng)不少于3天，培養(yǎng)基應(yīng)澄清。 試驗用菌株枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌 接種方法 分別接種各試驗用菌懸液于該培養(yǎng)基中，接種量不大于100cfu， 搖勻，培養(yǎng)。 適用性檢查接種試驗用菌株后，30-35培養(yǎng)不超過72小時，與對照培養(yǎng)基比 較，試驗菌應(yīng)生長良好。（建議：培養(yǎng)基呈混濁的液體，或劃線 于相應(yīng)的分離平板上，培養(yǎng)后呈現(xiàn)典型菌落） 備注：該培養(yǎng)基同時用于稀釋液的制備和控制菌檢查時，需要考慮同時滿足計數(shù)和 控制菌檢查培養(yǎng)基適用性檢查控制要求。 Luzhou Institutes for Food and Drug Control 培養(yǎng)基適用性檢查 培養(yǎng)基名稱胰酪大

41、豆胨瓊脂（TSA） 無菌性檢查取已滅菌TSA注皿，于30-35培養(yǎng)35天，應(yīng)無菌落生長。 試驗用菌種枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、 白色念珠菌、黑曲霉 接種方法涂布法：表面接種不大于100cfu試驗用菌懸液于TSA平板表面； 傾注法：接種不大于100cfu試驗用菌懸液于無菌平皿，傾注該培 養(yǎng)基，輕輕搖勻。 適用性檢查 枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌于30-35培養(yǎng)不 超過3天；白色念珠菌、黑曲霉于30-35培養(yǎng)不超過5天。 與對照培養(yǎng)基比較，恢復(fù)率在50200之間。 Luzhou Institutes for Food and Drug Control 培養(yǎng)基適用性檢

42、查 培養(yǎng)基名稱沙氏葡萄糖瓊脂（SDA） 無菌性檢查取已滅菌的SDA注皿，于20-25培養(yǎng)57天，應(yīng)無菌落生長。 試驗用菌種白色念珠菌、黑曲霉 接種方法 涂布法：表面接種不大于100cfu試驗用菌懸液于SDA平板表面。 傾注法：接種不大于100cfu試驗用菌懸液于無菌平皿中,傾注該培 養(yǎng)基，輕輕搖勻。 適用性檢查 白色念珠菌、黑曲霉于20-25培養(yǎng)不大于5天。 與對照培養(yǎng)基比較，恢復(fù)率在50200之間。 備注：如該培養(yǎng)基用于控制菌白色念珠菌的檢查時，同時需要滿足控制菌項 下培養(yǎng)基適用性檢查要求。 Luzhou Institutes for Food and Drug Control 培養(yǎng)基適用性

43、檢查 培養(yǎng)基名稱沙氏葡萄糖瓊脂+抗生素 （當細菌超標引起霉菌和酵母菌總數(shù)超標用） 無菌性檢查取已滅菌的SDA注皿，于20-25培養(yǎng)57天，應(yīng)無菌落生長。 試驗用菌種抑菌性檢查：枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌 促生長能力：白色念珠菌、黑曲霉 常用抗生素 1、慶大霉素：廣譜。對G-，G+菌有較好的抗菌作用。 2、氯霉素：廣譜。對G-菌作用強；對G+菌作用不及青霉素與四環(huán)素。 接種方法 抑菌性：接種不少于100cfu試驗用菌。 促生長能力：接種不大于 100cfu試驗用菌。 適用性檢查白色念珠菌、黑曲霉于20-25培養(yǎng)不大于5天。與對照培養(yǎng)基比 較，恢復(fù)率在50200之間。 枯草芽孢桿菌

44、、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌應(yīng)不得生長。 Luzhou Institutes for Food and Drug Control 樣品：烏雞白鳳丸 烏雞白鳳丸烏雞白鳳丸 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基 玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基 疑似菌落做革蘭染色 革蘭陽 性桿菌 不屬于霉菌或酵母菌。 將無菌硫酸慶大霉素將無菌硫酸慶大霉素 （相當于相當于20mg20mg慶大霉素慶大霉素） 胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基 玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基。玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基。 Luzhou Institutes for Food and Drug Control 選擇性培養(yǎng)基適用性選擇性培養(yǎng)基適用性 控制菌檢查控制菌檢查培養(yǎng)基培養(yǎng)

45、基特性特性試驗菌株試驗菌株 大腸菌大腸菌群群乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基促生長能力促生長能力E.coliE.coli 乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基抑制能力抑制能力S.aureusS.aureus 促生長能促生長能力力+指示能力指示能力E.coliE.coli EMB或麥康凱瓊脂或麥康凱瓊脂促生長能力促生長能力+指示能力指示能力E.coliE.coli 大腸埃希菌大腸埃希菌膽鹽乳糖培養(yǎng)基膽鹽乳糖培養(yǎng)基促生長能力促生長能力E.coliE.coli MUG、EMB或麥康凱瓊脂或麥康凱瓊脂抑制能力抑制能力S.aureusS.aureus 促生長能力促生長能力+指示能力指示能力E.coliE.c

46、oli 沙門菌沙門菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基促生長能力促生長能力S S paratyphparatyphi i B B 四硫磺酸鹽亮綠培養(yǎng)基四硫磺酸鹽亮綠培養(yǎng)基促生長能力促生長能力S S paratyphparatyphi i B B DHL或或SS瓊脂、瓊脂、EMB或麥康凱瓊脂或麥康凱瓊脂抑制能力抑制能力S.aureusS.aureus 促生長能力促生長能力+指示能力指示能力S S paratyphparatyphi i B B 三糖鐵瓊脂三糖鐵瓊脂指示能力指示能力S S paratyphparatyphi i B B Luzhou Institutes for Food and Dru

47、g Control 選擇性培養(yǎng)基適用性選擇性培養(yǎng)基適用性 控制菌檢查控制菌檢查培養(yǎng)基培養(yǎng)基特性特性試驗菌株試驗菌株 銅綠假單胞菌銅綠假單胞菌膽鹽乳糖培養(yǎng)基膽鹽乳糖培養(yǎng)基促生長能力促生長能力P.aeruginosaP.aeruginosa 溴化十六烷基三甲銨瓊脂溴化十六烷基三甲銨瓊脂抑制能力抑制能力S.aureusS.aureus 促生長能力促生長能力P.aeruginosaP.aeruginosa 綠膿菌素測定用培養(yǎng)基綠膿菌素測定用培養(yǎng)基抑制能力抑制能力E.coliE.coli 促生長能力促生長能力+指示能力指示能力P.aeruginosaP.aeruginosa 金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌

48、亞碲酸鹽肉湯培養(yǎng)基亞碲酸鹽肉湯培養(yǎng)基促生長能力促生長能力S.aureusS.aureus 甘露醇高鹽瓊脂或卵黃氯化甘露醇高鹽瓊脂或卵黃氯化鈉鈉瓊脂瓊脂抑制能力抑制能力E.coliE.coli 促生長能力促生長能力+指示能力指示能力S.aureusS.aureus 抑制能力抑制能力E.coliE.coli 梭菌梭菌梭菌增菌培養(yǎng)基梭菌增菌培養(yǎng)基促生長能力促生長能力ClCl. . sporogenessporogenes 哥倫比亞瓊脂哥倫比亞瓊脂促生長能力促生長能力ClCl. . sporogenessporogenes 白色念珠菌白色念珠菌沙氏葡萄糖肉湯沙氏葡萄糖肉湯促生長能力促生長能力C.alb

49、icansC.albicans 沙氏葡萄糖瓊脂沙氏葡萄糖瓊脂促生長能力促生長能力+指示能力指示能力C.albicansC.albicans 念珠菌顯色培養(yǎng)基念珠菌顯色培養(yǎng)基促生長能力促生長能力+指示能力指示能力C.albicansC.albicans 1%聚山梨酯聚山梨酯80-玉米瓊脂培養(yǎng)基玉米瓊脂培養(yǎng)基抑制能力抑制能力E.coliE.coli 促生長能力促生長能力+指示能力指示能力C.albicansC.albicans 微生物檢驗的過程控制微生物檢驗的過程控制 環(huán)境保證培養(yǎng)基保證 無菌性檢查 靈敏度檢查 有效的方法方法驗證方法驗證SOP操作 有效的結(jié)果 可靠的結(jié)論 結(jié)果判斷 過程控制 Lu

50、zhou Institutes for Food and Drug Control 檢測方法驗證 標準（藥典）檢測方法標準（藥典）檢測方法 實驗室在進行常規(guī)檢測前應(yīng)證明該實驗室可以滿足標準檢測方法 中的某些性能指標（即方法確認），并證明某一方法適用于某產(chǎn) 品的檢測（方法適用性包括陽性對照和陰性對照）。 新建方法方法驗證與方法適用性 藥典方法 （其他成熟方法） 方法轉(zhuǎn)移與方法確認 （部分菌株的驗證） 有案可查、溯源性 ； 建立實驗室自身的方法依據(jù)體 系 其他其他 準確度、精密度、專屬性、檢測限、定量限、線性、粗放性 Luzhou Institutes for Food and Drug Cont

51、rol 驗證的一般程序與環(huán)節(jié)驗證的一般程序與環(huán)節(jié) 需前處理需前處理 不需前處理不需前處理 無抑菌作用無抑菌作用 樣品樣品 檢查檢查 驗證前處理方法對污染菌生長、檢出的影響。驗證前處理方法對污染菌生長、檢出的影響。 驗證抑菌活性去除的有驗證抑菌活性去除的有 效性，以及去除方法對污效性，以及去除方法對污 染菌生長、檢出的影響。染菌生長、檢出的影響。 可以通過驗可以通過驗 證實驗判斷證實驗判斷 藥品微生物檢查方法驗證的一般程序與環(huán)節(jié)藥品微生物檢查方法驗證的一般程序與環(huán)節(jié) 利用供試品與微生物的差異，降低或消除供試品的影響 通過模擬實驗對降低或消除效果加以檢驗。 Luzhou Institutes fo

52、r Food and Drug Control 有抑菌作用有抑菌作用去除抑菌作用去除抑菌作用 吐溫吐溫8080結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu) 乳化劑降低了混合體系中各組分的界乳化劑降低了混合體系中各組分的界 面張力，并在微滴表面形成較堅固的面張力，并在微滴表面形成較堅固的 薄膜薄膜 由于乳化劑給出的電荷而在微滴表面由于乳化劑給出的電荷而在微滴表面 形成雙電層，阻止微滴彼此聚集，而形成雙電層，阻止微滴彼此聚集，而 保持均勻的乳狀液。保持均勻的乳狀液。 Luzhou Institutes for Food and Drug Control 分裝5份 9.9ml 供試液 + 0.1ml金黃色葡萄球菌液+ 0.1ml金黃色

53、葡萄球菌液+ 0.1ml金黃色葡萄球菌液 + 0.1ml銅綠假單胞菌液 + 0.1ml枯草芽孢桿菌液 + 0.1ml白色念珠菌液 + 0+.01m.1lm黑l黑曲曲 霉霉菌菌液液 + 0.1ml銅綠假單胞菌液 + 0.1ml金黃色葡萄球菌液 + 0.1ml銅綠假單胞菌液 + 0.1ml枯草芽孢桿菌液 + 0.1ml金黃色葡萄球菌液 + 0.1ml銅綠假單胞菌液 + +00.1.1mml白l白色色 念念珠珠菌菌液液 + 00.11mmll枯枯草草 芽芽孢孢桿桿菌菌液液 +00.1.m1mll金金黃黃色色 葡葡萄萄球球菌菌液液 + 00.11mmll銅銅綠綠 假假單單胞胞菌菌液液根據(jù)供試品的理化

54、特性與生物學(xué)特性 ，采取適宜的方法 制備合適的供試液。 稀釋度依據(jù)樣品特稀釋度依據(jù)樣品特 性，質(zhì)量標準制定性，質(zhì)量標準制定 計數(shù)方法適用性試驗 保證平皿中的菌數(shù)不大于100cfu Luzhou Institutes for Food and Drug Control 微生物檢驗的過程控制微生物檢驗的過程控制 環(huán)境保證培養(yǎng)基保證 無菌性檢查 靈敏度檢查 有效的方法有效的方法方法驗證SOP操作 有效的結(jié)果 可靠的結(jié)論 結(jié)果判斷 過程控制 Luzhou Institutes for Food and Drug Control 微生物限度案例 某板藍根沖劑，標準為細菌數(shù)不得過1000cfu/g，某藥檢

55、所細菌數(shù) 結(jié)論1200cfu/g，送中檢院仲裁。 (1)方法適用性 合格合格 Luzhou Institutes for Food and Drug Control 不合格不合格 Luzhou Institute Drug Control 菌種傳代保藏流程菌種傳代保藏流程 1 BioBall 3 推薦方式 2 自動稀釋 s for Food and Luzhou Institutes for Food and Drug Control 試驗用菌株的傳代次數(shù)不得超 過5代（從菌種保存中心獲得的冷 凍干燥菌種為第0 代）。 代的定義：每接種一次即為一 代（有在新鮮的培養(yǎng)基上生長過程) 傳代示意圖：

56、 干燥菌種（0代） QC CV1CV2CV3 液體培養(yǎng)基復(fù)蘇（1代） 工作菌株傳代保藏規(guī)程 菌種傳代流程 S1S2 S3 QC S1S2 S3 第二代工作菌懸液 冷藏（零下20） cv1 CV cv2 cv3 cv4QC Cycle 1第一代儲備管 凍存（零下30或70 ） 凍干菌種 第二代工作菌斜面 冷藏（28） 鑒別 cv11cv2cv3cv36 Cycle 2第二代儲備管 凍存（零下30或70 ） QC TSB QC 工作菌株傳代保藏流程示意圖 Luzhou Institutes for Food and Drug Control。 微生物檢驗的過程控制微生物檢驗的過程控制 環(huán)境保證培養(yǎng)

57、基保證 無菌性檢查 靈敏度檢查 有效的方法方法驗證SOP操作操作 有效的結(jié)果 可靠的結(jié)論 結(jié)果判斷 過程控制 Luzhou Institutes for Food and Drug Control 實驗操作實驗操作 物料進場物料進場 消毒液搽拭消毒液搽拭 物品外表面物品外表面 潔凈傳遞潔凈傳遞 （風(fēng)淋、紫外照射）（風(fēng)淋、紫外照射） 核心區(qū) 外圍消毒劑清潔外表面外圍消毒劑清潔外表面 Luzhou Institutes for Food and Drug Control 雙層無菌包裝雙層無菌包裝 外圍 實驗操作實驗操作 人員進場人員進場 一更 Luzhou Institutes for Food

58、and Drug Control 二更 Luzhou Institutes for Food and Drug Control 硫乙 陰性 090423 馬丁 陰性 090423 馬丁 樣品 090423 硫乙 樣品 090423 馬丁 陽性 090423 硫乙 陽性 090423 監(jiān)控平板 樣品沉降菌手指 無菌檢驗框架示意圖無菌檢驗框架示意圖 Luzhou Institutes for 無菌三針單聯(lián)管無菌三針單聯(lián)管 Food and Drug Control 實驗過程監(jiān)控實驗過程監(jiān)控 表面監(jiān)控 手部監(jiān)控 環(huán)境菌監(jiān) 控 Luzhou Institutes for Food and Drug C

59、ontrol 無菌程序保障無菌程序保障 無菌檢查樣品前處理無菌檢查樣品前處理 分批消毒、實驗（混合） 統(tǒng)一消毒，統(tǒng)一實驗 嚴格遵守外表面消毒程序嚴格遵守外表面消毒程序 一般環(huán)境酚類 （phenylphenol/ tertiary amylphenol ） 潔凈環(huán)境過氧乙酸+75%乙醇（無菌級） （苯式苯酚/三級戊基苯酚） 增加過程監(jiān)控力度增加過程監(jiān)控力度 表面菌采樣、手部采樣（每批）、動態(tài)浮游菌采樣（下風(fēng)口） Luzhou Institutes for Food and Drug Control Luzhou Institutes for Food a nd Drug Control 明確標識

60、 Paper labels are preferred over marker pens. 原始記錄原始記錄 樣品信息&方法信息 儀器信息&狀態(tài) 檢驗結(jié)論前置 方便核驗 校對&復(fù)核信息前置 Luzhou Institutes for Food and Drug Control 原始記錄原始記錄 樣品信息一致 材料信息&試劑信 息 Luzhou Institutes for Food and Drug Control 檢驗方法描述 檢驗結(jié)果記錄 原始記錄原始記錄 樣品信息一致 過程監(jiān)控信息 包括監(jiān)控方案 培養(yǎng)條件 培 養(yǎng)結(jié)果 及培 養(yǎng)基信息 是否啟動偏差調(diào)查記錄 Luzhou Institute