生物化學(xué)第四章蛋白質(zhì)的共價結(jié)構(gòu)

1、一、蛋白質(zhì)通論一、蛋白質(zhì)通論 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)(Protein)(Protein)是生物體的基本組成成份。在人體內(nèi)蛋白是生物體的基本組成成份。在人體內(nèi)蛋白 質(zhì)的含量很多，約占人體固體成分的質(zhì)的含量很多，約占人體固體成分的45%45%，它的分布很廣，它的分布很廣， 幾乎所有的器官組織都含蛋白質(zhì)，并且它又與所有的生命活幾乎所有的器官組織都含蛋白質(zhì)，并且它又與所有的生命活 動密切聯(lián)系。動密切聯(lián)系。 機體新陳代謝過程中的一系列化學(xué)反應(yīng)幾乎都依賴于生物催化劑酶機體新陳代謝過程中的一系列化學(xué)反應(yīng)幾乎都依賴于生物催化劑酶 的作用，而酶的本質(zhì)就是蛋白質(zhì)；調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝的激素有許多也是蛋的作用，而酶的本質(zhì)就是蛋白質(zhì)；

2、調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝的激素有許多也是蛋 白質(zhì)或它的衍生物；其它諸如肌肉的收縮，血液的凝固，免疫功能，白質(zhì)或它的衍生物；其它諸如肌肉的收縮，血液的凝固，免疫功能， 組織修復(fù)以及生長、繁殖等主要功能無一不與蛋白質(zhì)相關(guān)。近代分子組織修復(fù)以及生長、繁殖等主要功能無一不與蛋白質(zhì)相關(guān)。近代分子 生物學(xué)的研究表明，蛋白質(zhì)在遺傳信息的控制、細胞膜的通透性、神生物學(xué)的研究表明，蛋白質(zhì)在遺傳信息的控制、細胞膜的通透性、神 經(jīng)沖動的發(fā)生和傳導(dǎo)以及高等動物的記憶等方面都起著重要的作用。經(jīng)沖動的發(fā)生和傳導(dǎo)以及高等動物的記憶等方面都起著重要的作用。 （一）蛋白質(zhì)的化學(xué)組成和分類（一）蛋白質(zhì)的化學(xué)組成和分類 單純蛋白質(zhì)的元素組成為

3、單純蛋白質(zhì)的元素組成為C 50C 5055%55%、H 6%H 6%7%7%、O 19%O 19%24%24%、 N 13%N 13%19%19%，除此之外還有，除此之外還有S 0S 04%4%。有的蛋白質(zhì)含有。有的蛋白質(zhì)含有P P、I I。 少數(shù)含少數(shù)含F(xiàn)eFe、CuCu、ZnZn、MnMn、CoCo、MoMo等金屬元素。等金屬元素。 各種蛋白質(zhì)的含氮量很接近，平均為各種蛋白質(zhì)的含氮量很接近，平均為16%16%。由于體內(nèi)組織的主。由于體內(nèi)組織的主 要含氮物是蛋白質(zhì)，因此，只要測定生物樣品中的氮含量，要含氮物是蛋白質(zhì)，因此，只要測定生物樣品中的氮含量， 就可以按下式推算出蛋白質(zhì)大致含量：就可以

4、按下式推算出蛋白質(zhì)大致含量： 蛋白質(zhì)含量蛋白氮蛋白質(zhì)含量蛋白氮6.256.25 （凱氏（凱氏(Kjedahl)(Kjedahl)定氮法的計算基礎(chǔ)）定氮法的計算基礎(chǔ)） 單純蛋白質(zhì)（單純蛋白質(zhì)（simple protein)simple protein)：僅由氨基酸組成，：僅由氨基酸組成， 不含其它化學(xué)成分。不含其它化學(xué)成分。 綴合蛋白質(zhì)綴合蛋白質(zhì)(conjugated protein)(conjugated protein)：除含有氨基酸外：除含有氨基酸外 的各種化學(xué)成分作為其結(jié)構(gòu)的一部分。非蛋白質(zhì)部分的各種化學(xué)成分作為其結(jié)構(gòu)的一部分。非蛋白質(zhì)部分 稱為稱為輔基輔基(prosthetic gro

5、up)(prosthetic group)或或配體配體(ligand)(ligand)。 單純蛋白質(zhì)單純蛋白質(zhì) （按溶解度分類）（按溶解度分類） 清蛋白清蛋白 球蛋白球蛋白 谷蛋白谷蛋白 谷醇溶蛋白谷醇溶蛋白 組蛋白組蛋白 魚精蛋白魚精蛋白 硬蛋白硬蛋白 綴合蛋白質(zhì)綴合蛋白質(zhì) （按非氨基酸（按非氨基酸 成分分類）成分分類） 糖蛋白糖蛋白 脂蛋白脂蛋白 核蛋白核蛋白 磷蛋白磷蛋白 金屬蛋白金屬蛋白 血紅素蛋白血紅素蛋白 黃素蛋白黃素蛋白 組組 成成 單純蛋白質(zhì)分類單純蛋白質(zhì)分類 結(jié)合蛋白質(zhì)分類結(jié)合蛋白質(zhì)分類 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) （按生物學(xué)功能分類）（按生物學(xué)功能分類） 酶酶 調(diào)節(jié)蛋白調(diào)節(jié)蛋白 轉(zhuǎn)運蛋白

6、轉(zhuǎn)運蛋白 貯存蛋白貯存蛋白 收縮和游動蛋白收縮和游動蛋白 結(jié)構(gòu)蛋白結(jié)構(gòu)蛋白 支架蛋白支架蛋白 保護和開發(fā)蛋白保護和開發(fā)蛋白 異常蛋白異常蛋白 （二）蛋白質(zhì)的形狀和大?。ǘ┑鞍踪|(zhì)的形狀和大小 形狀形狀 纖維狀纖維狀 球狀球狀 膜蛋白膜蛋白 球狀蛋白質(zhì)球狀蛋白質(zhì)globular proteinglobular protein 分子對稱性佳，外形接分子對稱性佳，外形接 近球形或橢圓形，溶解性較好，能形成結(jié)晶，大多數(shù)蛋白近球形或橢圓形，溶解性較好，能形成結(jié)晶，大多數(shù)蛋白 質(zhì)屬于這一類。質(zhì)屬于這一類。 Eg.Eg.血紅蛋白、血清球蛋白。血紅蛋白、血清球蛋白。 纖維狀蛋白質(zhì)纖維狀蛋白質(zhì)fibrous p

7、roteinfibrous protein 對稱性差，分子類似對稱性差，分子類似 纖維或細棒。它又可分為纖維或細棒。它又可分為可溶性纖維狀蛋白質(zhì)可溶性纖維狀蛋白質(zhì)肌球蛋肌球蛋 白。白。和不溶性纖維狀蛋白質(zhì)和不溶性纖維狀蛋白質(zhì)膠原、彈性蛋白膠原、彈性蛋白 膜蛋白質(zhì)膜蛋白質(zhì)membrane proteinmembrane protein細胞的各種膜系統(tǒng)結(jié)合而細胞的各種膜系統(tǒng)結(jié)合而 存在，與膜內(nèi)的非極性相相互作用，疏水側(cè)鏈伸向外側(cè)，存在，與膜內(nèi)的非極性相相互作用，疏水側(cè)鏈伸向外側(cè)， 親水氨基酸殘基較胞質(zhì)少。親水氨基酸殘基較胞質(zhì)少。 分子大小分子大小 蛋白質(zhì)的相對分子量從大約蛋白質(zhì)的相對分子量從大約6

8、00060001 110106 6或更大一些?；蚋笠恍?。 單體蛋白質(zhì)單體蛋白質(zhì)(monomeric(monomeric protein)protein)：僅由一條多肽鏈組成。：僅由一條多肽鏈組成。 其相對分子量除以其相對分子量除以110110估計氨基酸殘基的數(shù)目。估計氨基酸殘基的數(shù)目。 寡聚蛋白質(zhì)寡聚蛋白質(zhì)(oligomeric(oligomeric protein)protein)：由兩條或多條多肽鏈：由兩條或多條多肽鏈 組成。每條多肽鏈稱為亞基組成。每條多肽鏈稱為亞基(subunit)(subunit)。 多酶體系多酶體系 l蛋白質(zhì)分子量的上下蛋白質(zhì)分子量的上下 限是人為規(guī)定的，因限是人

9、為規(guī)定的，因 為這決定于蛋白質(zhì)和為這決定于蛋白質(zhì)和 分子量概念的定義。分子量概念的定義。 l有些寡聚蛋白質(zhì)的分有些寡聚蛋白質(zhì)的分 子量可高達數(shù)百萬甚子量可高達數(shù)百萬甚 至數(shù)千萬。至數(shù)千萬。 （三）蛋白質(zhì)構(gòu)象和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的組織層次（三）蛋白質(zhì)構(gòu)象和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的組織層次 一級結(jié)構(gòu)一級結(jié)構(gòu)(primary structure)(primary structure)：多肽鏈的氨基酸序列。多肽鏈的氨基酸序列。 二級結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)(secondary structure)(secondary structure)：多肽鏈中主鏈原子的局多肽鏈中主鏈原子的局 部空間排布即構(gòu)象，不涉及側(cè)鏈部分的構(gòu)象。部空間排布即

10、構(gòu)象，不涉及側(cè)鏈部分的構(gòu)象。 三級結(jié)構(gòu)三級結(jié)構(gòu)(tertiary structure)(tertiary structure)：蛋白質(zhì)的多肽鏈在各種二蛋白質(zhì)的多肽鏈在各種二 級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上再進一步盤曲或折迭形成具有一定規(guī)律的三級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上再進一步盤曲或折迭形成具有一定規(guī)律的三 維空間結(jié)構(gòu)。維空間結(jié)構(gòu)。 四級結(jié)構(gòu)四級結(jié)構(gòu)(quarternary structure)(quarternary structure)：具有二條或二條以上具有二條或二條以上 獨立三級結(jié)構(gòu)的多肽鏈組成的蛋白質(zhì)，其多肽鏈間通過次級獨立三級結(jié)構(gòu)的多肽鏈組成的蛋白質(zhì)，其多肽鏈間通過次級 鍵相互組合而形成的空間結(jié)構(gòu)。鍵相互組合而

11、形成的空間結(jié)構(gòu)。 四、蛋白質(zhì)功能的多樣性四、蛋白質(zhì)功能的多樣性 蛋白質(zhì)的序列異構(gòu)現(xiàn)象是蛋白質(zhì)生物功能多樣性和物種蛋白質(zhì)的序列異構(gòu)現(xiàn)象是蛋白質(zhì)生物功能多樣性和物種 特異性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。特異性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。 蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能：蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能： 1.1.催化；催化；2.2.調(diào)節(jié)；調(diào)節(jié)；3.3.轉(zhuǎn)運；轉(zhuǎn)運；4.4.貯存；貯存；5.5.運動；運動；6.6.結(jié)構(gòu)成分；結(jié)構(gòu)成分； 7.7.支架作用；支架作用；8.8.防御與進攻；防御與進攻；9.9.異常功能；異常功能； 蛋白質(zhì)（蛋白質(zhì)（proteinprotein）是生活細胞內(nèi)含量最豐富、功能最）是生活細胞內(nèi)含量最豐富、功能最 復(fù)雜的生物大分子，并參與了幾

12、乎所有的生命活動和生命過復(fù)雜的生物大分子，并參與了幾乎所有的生命活動和生命過 程。因此，研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能始終是生命科學(xué)最基本程。因此，研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能始終是生命科學(xué)最基本 的命題。的命題。 生物體最主要的特征是生命活動，而蛋白質(zhì)是生命活動生物體最主要的特征是生命活動，而蛋白質(zhì)是生命活動 的體現(xiàn)者，具有以下主要功能：的體現(xiàn)者，具有以下主要功能： 二、肽二、肽 肽是氨基酸的線性聚合物，常稱多肽鏈（肽是氨基酸的線性聚合物，常稱多肽鏈（peptide chainpeptide chain）。）。 蛋白質(zhì)是由一條或多條具有確定的氨基酸序列的多肽鏈構(gòu)成蛋白質(zhì)是由一條或多條具有確定的氨基酸序列的

13、多肽鏈構(gòu)成 的大分子。的大分子。 （一）肽和肽鍵的結(jié)構(gòu)（一）肽和肽鍵的結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)分子中氨基酸連接的基本方式是肽鍵。蛋白質(zhì)分子中氨基酸連接的基本方式是肽鍵。 CCNCCNCCNCCNC CH2CHCH2CH2CH2 COO - OHCO2HCH2 CONH2 OH CH3 H3N + OOOO HHHHH HHHH SerValTyrAsp Gln CH3 N-端 C-端 肽鍵 肽鏈寫法肽鏈寫法：游離：游離-氨基在左，游離氨基在左，游離-羧基在右，氨基酸之間用羧基在右，氨基酸之間用 “-”表示肽鍵。表示肽鍵。 H2N-絲氨酸絲氨酸-纈氨酸纈氨酸-酪氨酸酪氨酸-天冬氨酸天冬氨酸-谷氨酰氨谷氨酰氨

14、-COOH Ser-Val-Tyr-Asp-Gln（ （S-V-Y-D-Q） 肽鍵的特點是氮原子上的孤對電子與羰基具有肽鍵的特點是氮原子上的孤對電子與羰基具有 明顯的共軛作用。明顯的共軛作用。 組成肽鍵的原子處于同一平面。組成肽鍵的原子處于同一平面。 由于羰基碳由于羰基碳- -氧雙鍵的靠攏，允許存在共振結(jié)構(gòu)（氧雙鍵的靠攏，允許存在共振結(jié)構(gòu)（resonance structureresonance structure），）， 碳與氮之間的肽鍵有部分雙鍵性質(zhì)，由碳與氮之間的肽鍵有部分雙鍵性質(zhì)，由CO-NHCO-NH構(gòu)成的肽單元呈現(xiàn)相對的剛性構(gòu)成的肽單元呈現(xiàn)相對的剛性 和平面化，肽鍵中的和平面化，肽

15、鍵中的4 4個原子和它相鄰的兩個個原子和它相鄰的兩個-碳原子多處于同一個平面碳原子多處于同一個平面 上。上。 多肽鏈可以看成由多肽鏈可以看成由C C 串聯(lián)起來的無數(shù)個酰胺平面組成 串聯(lián)起來的無數(shù)個酰胺平面組成 肽鍵中的肽鍵中的C-NC-N鍵具有部分雙鍵具有部分雙 鍵性質(zhì)，不能自由旋轉(zhuǎn)。鍵性質(zhì)，不能自由旋轉(zhuǎn)。 在大多數(shù)情況下，以反式在大多數(shù)情況下，以反式 結(jié)構(gòu)存在。結(jié)構(gòu)存在。 共振產(chǎn)生的重要結(jié)果：共振產(chǎn)生的重要結(jié)果： 限制繞肽鍵的自由旋轉(zhuǎn)限制繞肽鍵的自由旋轉(zhuǎn) 形成酰胺平面形成酰胺平面 產(chǎn)生鍵的平均化產(chǎn)生鍵的平均化 肽鍵呈反式構(gòu)型肽鍵呈反式構(gòu)型 sp2 sp2 sp2 sp3 共振雜化體共振雜化體

16、 （二）肽的物理和化學(xué)性質(zhì)（二）肽的物理和化學(xué)性質(zhì) 短肽的晶體是離子品格，在水溶液中以偶極離子存在。在短肽的晶體是離子品格，在水溶液中以偶極離子存在。在 pH0-14pH0-14范圍內(nèi)，肽鍵中的亞氨基不能解離。范圍內(nèi)，肽鍵中的亞氨基不能解離。 小肽的滴定曲線和氨基酸的滴定曲線很相似。小肽的滴定曲線和氨基酸的滴定曲線很相似。 肽的化學(xué)反應(yīng)也和氨基酸一樣，游離的肽的化學(xué)反應(yīng)也和氨基酸一樣，游離的氨基、氨基、羧羧 基和基和R R基可以發(fā)生與氨基酸中相應(yīng)的基團類似的反反應(yīng)。雙基可以發(fā)生與氨基酸中相應(yīng)的基團類似的反反應(yīng)。雙 縮脲反應(yīng)是肽和蛋白質(zhì)所特有的，而為氨基酸所沒有的一縮脲反應(yīng)是肽和蛋白質(zhì)所特有的，

17、而為氨基酸所沒有的一 個顏色反應(yīng)。個顏色反應(yīng)。 一般短肽的旋光度約等于組成該肽中各個氨基酸的旋光度一般短肽的旋光度約等于組成該肽中各個氨基酸的旋光度 的總和，但較長的肽或蛋白質(zhì)的旋光度則不能這樣簡單相的總和，但較長的肽或蛋白質(zhì)的旋光度則不能這樣簡單相 加。加。 （三）天然存在的活性肽（三）天然存在的活性肽 生物體內(nèi)游離存在著很多活性肽，具有各種特殊的生物生物體內(nèi)游離存在著很多活性肽，具有各種特殊的生物 學(xué)功能。學(xué)功能。 激素：腦啡肽、催產(chǎn)素、加壓素、舒緩激肽激素：腦啡肽、催產(chǎn)素、加壓素、舒緩激肽 抗生素：短桿菌肽、多粘菌素抗生素：短桿菌肽、多粘菌素E E、放線菌素、放線菌素D D 蕈的劇毒毒素

18、：蕈的劇毒毒素：鵝膏蕈堿鵝膏蕈堿 還原型谷胱甘肽還原型谷胱甘肽 鵝肌肽、肌肽鵝肌肽、肌肽 天然肽中含有蛋白質(zhì)中不存在的天然肽中含有蛋白質(zhì)中不存在的-肽鍵、肽鍵、丙氨酸和丙氨酸和D D 型氨基酸。型氨基酸。 Met-Met-腦啡肽腦啡肽 + +H H3 3N-Tyr-Gly-Gly-Phe- N-Tyr-Gly-Gly-Phe-MetMet-COO-COO- - Leu-Leu-腦啡肽腦啡肽 + +H H3 3N-Tyr-Gly-Gly-Phe- N-Tyr-Gly-Gly-Phe-LeuLeu-COO-COO- - Cys Tyr ILe Gln Asn Cys Pro Leu GlyNH2

19、S S 牛催產(chǎn)素 Cys Tyr Gln Asn Cys Pro S S Phe Arg GlyNH2 牛加壓素 牛催產(chǎn)素牛催產(chǎn)素 牛加壓素牛加壓素 N H C O CH2NHC O CHNHC O CH3 CH CH OH CH2OH CHHNCNHCHCNHCH2C CO CH N H HO CH2NH NH CHCH CH3 CH2CH3 CO O OO CH2 CH2 SO OH 鵝膏覃堿的化學(xué)結(jié)構(gòu) L-Leu-D-Phe-L-Pro-L-Val L-Orn L-Orn L-Val-L-Pro-D-Phe-L-Leu 短桿菌肽短桿菌肽S(S(環(huán)十肽環(huán)十肽) ) 由細菌分泌的多肽，有時也

20、都含有由細菌分泌的多肽，有時也都含有D-D-氨基酸氨基酸 和一些不常見氨基酸，如鳥氨酸（和一些不常見氨基酸，如鳥氨酸（Ornithine, Ornithine, 縮寫為縮寫為 OrnOrn）。）。 三、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定三、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定 蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)指多肽鏈中的氨基酸序列。蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)指多肽鏈中的氨基酸序列。 （一）蛋白質(zhì)測序的策略（一）蛋白質(zhì)測序的策略 (1) (1)測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目。測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目。 (2)(2)拆分蛋白質(zhì)分子的多肽鏈。拆分蛋白質(zhì)分子的多肽鏈。 (3)(3)測定多肽鏈的氨基酸組成。測定多肽鏈的氨基酸組成。 (4)(4)分析多肽鏈的

21、分析多肽鏈的N N末端和末端和C C末端殘基。末端殘基。 (5)(5)斷裂多肽鏈內(nèi)的二硫鍵。斷裂多肽鏈內(nèi)的二硫鍵。 (6)(6)多肽鏈斷裂成肽段。多肽鏈斷裂成肽段。 (7)(7)測定各個肽段的氨基酸順序。測定各個肽段的氨基酸順序。 (8)(8)確定肽段在多肽鏈中的次序。確定肽段在多肽鏈中的次序。 (9)(9)確定原多肽鏈中二硫鍵的位置。確定原多肽鏈中二硫鍵的位置。 將肽段順序進行疊聯(lián)以確定完整的順序?qū)㈦亩雾樞蜻M行疊聯(lián)以確定完整的順序 將肽段分離并測出順序?qū)㈦亩畏蛛x并測出順序 專一性裂解專一性裂解 末端氨基酸測定末端氨基酸測定 二硫鍵拆開二硫鍵拆開 純蛋白質(zhì)純蛋白質(zhì) （二）（二）N-N-末端和末

22、端和C-C-末端氨基酸殘基的鑒定末端氨基酸殘基的鑒定 1.N-1.N-末端分析末端分析 （1 1）DNFBDNFB法；法； （2 2）DNSDNS法法 （3 3）PITCPITC法法 （4 4）氨肽酶法）氨肽酶法 2.C-2.C-末端分析末端分析 （1 1）肼解法；）肼解法； （2 2）還原法）還原法 （3 3）羧肽酶法）羧肽酶法 SangerSanger法。法。2,4-2,4-二硝基氟苯在堿性條件下，能夠與二硝基氟苯在堿性條件下，能夠與 肽鏈肽鏈N-N-端的游離氨基作用，生成二硝基苯衍生物端的游離氨基作用，生成二硝基苯衍生物 （DNPDNP）。）。 在酸性條件下水解，得到黃色在酸性條件下水解

23、，得到黃色DNP-DNP-氨基酸。該產(chǎn)物氨基酸。該產(chǎn)物 能夠用乙醚抽提分離。不同的能夠用乙醚抽提分離。不同的DNP-DNP-氨基酸可以用色氨基酸可以用色 譜法進行鑒定。譜法進行鑒定。 O2NF NO2 + H2NCHC RO HNCHC RO O2N NO2 H+ H2O O2N NO2 HNCHC RO OH + 氨基酸 DNFB N-端氨基酸DNP衍生物 DNP-氨基酸 在堿性條件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以與在堿性條件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以與N-N-端氨端氨 基酸的游離氨基作用，得到丹磺酰氨基酸。基酸的游離氨基作用，得到丹磺酰氨基酸。 此法的優(yōu)點是丹磺酰此法的優(yōu)點是

24、丹磺酰- -氨基酸有很強的熒光性質(zhì)，檢測靈敏度氨基酸有很強的熒光性質(zhì)，檢測靈敏度 可以達到可以達到1 1 1010-9 -9mol mol。 N(CH3)2 SO2Cl H2NCHC RO HNCHC RO SO2 N(CH3)2 + 水解 N(CH3)2 SO2 HNCHC RO OH + 氨基酸 丹磺酰氯 多肽N-端 丹磺酰N-端氨基酸 丹磺酰氨基酸 氨肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽氨肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽 鏈的鏈的N-N-端逐個的向里水解。端逐個的向里水解。 根據(jù)不同的反應(yīng)時間測出酶水解所釋放根據(jù)不同的反應(yīng)時間測出酶水解所釋放 出的氨基酸種類和數(shù)量，按反應(yīng)時間和出的氨基酸種類

25、和數(shù)量，按反應(yīng)時間和 氨基酸殘基釋放量作動力學(xué)曲線，從而氨基酸殘基釋放量作動力學(xué)曲線，從而 知道蛋白質(zhì)的知道蛋白質(zhì)的N-N-末端殘基順序。末端殘基順序。 最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解 以亮氨酸殘基為以亮氨酸殘基為N-N-末端的肽鍵速度最大。末端的肽鍵速度最大。 此法是多肽鏈C-C-端氨基酸分析法端氨基酸分析法。多肽與肼在無水 條件下加熱，C-端氨基酸即從肽鏈上解離出來，其 余的氨基酸則變成肼化物。肼化物能夠與苯甲醛縮肼化物能夠與苯甲醛縮 合成不溶于水的物質(zhì)合成不溶于水的物質(zhì)而與C-端氨基酸分離。 H2NCH C RO HNCH C ROORn CCHHN

26、OH n-1 N-端氨基酸 C-端氨基酸 ORn CCHH2NOHH2NCH C RO NHNH2+ H + NH2NH2 氨基酸酰肼 C-端氨基酸 此法是多肽鏈此法是多肽鏈C-C-末端氨基酸分析法。末端氨基酸分析法。 多肽與多肽與LiBHLiBH4 4在無水條件下加熱，在無水條件下加熱，C-C-端端 氨基酸被還原為醇即從肽鏈上解離出氨基酸被還原為醇即從肽鏈上解離出 來，其余的氨基酸則不變。醇很容易來，其余的氨基酸則不變。醇很容易 與其余氨基酸分離。與其余氨基酸分離。 羧肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的羧肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的 C-C-端逐個的水解端逐個的水解AAAA。根據(jù)不

27、同的反應(yīng)時間測。根據(jù)不同的反應(yīng)時間測 出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量，從出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量，從 而知道蛋白質(zhì)的而知道蛋白質(zhì)的C-C-末端殘基順序。末端殘基順序。 目前常用的羧肽酶有四種：目前常用的羧肽酶有四種：A,B,CA,B,C和和Y Y；A A和和B B 來自胰臟；來自胰臟；C C來自柑桔葉；來自柑桔葉；Y Y來自面包酵母。來自面包酵母。 羧肽酶羧肽酶A A能水解除能水解除Pro,ArgPro,Arg和和LysLys以外的所有以外的所有C-C- 末端氨基酸殘基；末端氨基酸殘基；B B只能水解只能水解ArgArg和和LysLys為為C-C-末末 端殘基的肽鍵。端殘基的肽鍵

28、。 （三）二硫橋的斷裂（三）二硫橋的斷裂 斷裂二硫橋的主要方法是過甲酸氧化法和巰基化合物還原斷裂二硫橋的主要方法是過甲酸氧化法和巰基化合物還原 法。法。 s s s s HCOOOHHCOOOH SOSO3 3H H SOSO3 3H H S SS S S S S S S S S S 胰島素胰島素 HO-CHHO-CH2 2-CH-CH2 2-SH-SH SHSH SHSH SHSH SHSHSHSH SHSH SCHSCH2 2C00HC00H SCHSCH2 2C00HC00H SCHSCH2 2C00HC00HSCHSCH2 2C00HC00H SCHSCH2 2C00HC00HSCHS

29、CH2 2C00HC00H ICHICH2 2COOHCOOH 作用：作用：這些反應(yīng)可用于巰基的保護這些反應(yīng)可用于巰基的保護。 -OOC CHCH2SH NH3+ CH2OCCl O -OOC CHCH2S NH3+ OCCH2 O CH2 -OOC CHCH2S NH3+ CH2Cl ICH2CNH2 O CH2CNH2 O -OOC CHCH2S NH3+ 還可用碘乙酸還可用碘乙酸ICHICH2 2COOCOO- - 保護， 保護， 在多肽鏈中引入負電荷。亦可用在多肽鏈中引入負電荷。亦可用 碘乙酰胺碘乙酰胺ICHICH2 2CONHCONH2 2 保護。保護。 如用乙撐亞胺保護巰基，生成氨

30、如用乙撐亞胺保護巰基，生成氨 乙基半胱氨酸乙基半胱氨酸AECysAECys，在肽鏈中引，在肽鏈中引 入胰蛋白酶的酶切位點。入胰蛋白酶的酶切位點。 （四）氨基酸組（四）氨基酸組 成的分析成的分析 用于蛋白的氨基酸用于蛋白的氨基酸 組成測定的水解方組成測定的水解方 法主要是酸水解，法主要是酸水解， 同時輔以堿水解。同時輔以堿水解。 氨基酸分析儀圖譜氨基酸分析儀圖譜 常用常用6 mol/L6 mol/L的鹽酸或的鹽酸或4 mol/L4 mol/L的硫酸在的硫酸在 105-110105-110條件下進行水解，反應(yīng)時間約條件下進行水解，反應(yīng)時間約2020 小時。小時。 此法的優(yōu)點是不容易引起水解產(chǎn)物的消

31、旋此法的優(yōu)點是不容易引起水解產(chǎn)物的消旋 化。缺點是化。缺點是色氨酸色氨酸被沸酸完全破壞；被沸酸完全破壞； 含有羥基的氨基酸如絲氨酸或蘇氨酸有一含有羥基的氨基酸如絲氨酸或蘇氨酸有一 小部分被分解；小部分被分解；門冬酰胺和谷氨酰胺門冬酰胺和谷氨酰胺側(cè)鏈側(cè)鏈 的酰胺基被水解成了羧基。的酰胺基被水解成了羧基。 一般用一般用5 mol/L5 mol/L氫氧化鈉煮沸氫氧化鈉煮沸10-2010-20小時。小時。 由于水解過程中許多氨基酸都受到不同程由于水解過程中許多氨基酸都受到不同程 度的破壞，產(chǎn)率不高。度的破壞，產(chǎn)率不高。 部分的水解部分的水解產(chǎn)物發(fā)生消旋化產(chǎn)物發(fā)生消旋化。 主要用來測定色氨酸含量主要用來

32、測定色氨酸含量 （五）多肽鏈的部分裂解和肽段混合物的分離（五）多肽鏈的部分裂解和肽段混合物的分離 純化純化 1.1.酶裂解法酶裂解法 目前用于蛋白質(zhì)肽鏈斷裂的蛋白水解酶目前用于蛋白質(zhì)肽鏈斷裂的蛋白水解酶 （proteolytic enzymeproteolytic enzyme）或稱蛋白酶（）或稱蛋白酶（proteinaseproteinase） 已有十多種。如：已有十多種。如：胰蛋白酶胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶， 嗜熱菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶嗜熱菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶 應(yīng)用酶水解多肽，不會破壞氨基酸，也不會發(fā)生消應(yīng)用酶水解多肽，不會破壞氨基酸，也不會發(fā)生消 旋化，旋化

33、，色氨酸色氨酸在水解中也不受破壞。水解的產(chǎn)物為在水解中也不受破壞。水解的產(chǎn)物為 較小的較小的肽肽段。段。 最常見的蛋白水解酶有以下幾種：最常見的蛋白水解酶有以下幾種： 胰蛋白酶胰蛋白酶(trypsin)(trypsin) 這是最常用的蛋白這是最常用的蛋白 水解酶，專一性強，水解酶，專一性強， 只斷裂賴氨酸或精只斷裂賴氨酸或精 氨酸的羧基參與形氨酸的羧基參與形 成的肽鍵。得到的成的肽鍵。得到的 是以是以ArgArg或或LysLys為為C-C- 末端殘基的肽段，末端殘基的肽段， 肽段數(shù)目等于多肽肽段數(shù)目等于多肽 鏈中鏈中ArgArg和和LysLys總數(shù)總數(shù) 加加1 1。 為了減少胰蛋白酶的作用位點

34、，可以通過化學(xué)修飾將其側(cè)鏈為了減少胰蛋白酶的作用位點，可以通過化學(xué)修飾將其側(cè)鏈 基因保護起來。用馬來酸酐可以保護基因保護起來。用馬來酸酐可以保護LysLys殘基側(cè)鏈上的殘基側(cè)鏈上的 NHNH2 2，胰蛋白酶就不會水解，胰蛋白酶就不會水解LysLys竣基參與形成的肽鍵，只能斷竣基參與形成的肽鍵，只能斷 裂裂ArgArg羧基所形成的肽鍵；反之，如果用羧基所形成的肽鍵；反之，如果用1 1，2 2環(huán)己二酮修飾環(huán)己二酮修飾 ArgArg的胍基，則胰蛋白面只能裂解的胍基，則胰蛋白面只能裂解LysLys羧基所形成的肽鍵。羧基所形成的肽鍵。 如果想增加多肽鏈中胰蛋白酶的斷裂點，可以用丫丙啶處理如果想增加多肽鏈

35、中胰蛋白酶的斷裂點，可以用丫丙啶處理 多肽鏈樣品，這時多肽鏈樣品，這時CysCys殘基側(cè)鏈被修飾成類似殘基側(cè)鏈被修飾成類似LysLys的側(cè)鏈，也的側(cè)鏈，也 具有具有NHNH2 2。這樣胰蛋白酶便能斷裂。這樣胰蛋白酶便能斷裂CysCys羧基端的肽鍵。羧基端的肽鍵。 NHCHC O R4 NHCHC O R3 NHCHC O R2 NHCHC O R1 R R1 1=Lys=Lys和和ArgArg側(cè)鏈（專一性較強，水解速度快）。側(cè)鏈（專一性較強，水解速度快）。R R2 2=Pro =Pro 水水 解受抑。解受抑。 糜蛋白酶糜蛋白酶(chymotrypin)(chymotrypin)或胰凝乳蛋白酶或

36、胰凝乳蛋白酶( (C Chymotrypsin)hymotrypsin)： 它斷裂它斷裂PhePhe、TrpTrp和和TyrTyr等疏水氨基酸的羧基參與形成的肽鍵。等疏水氨基酸的羧基參與形成的肽鍵。 斷裂鍵鄰近的基團是堿性的，裂解能力增加；是酸性的，裂斷裂鍵鄰近的基團是堿性的，裂解能力增加；是酸性的，裂 解能力將減弱。解能力將減弱。 NHCHC O R4 NHCHC O R3 NHCHC O R2 NHCHC O R1 肽鏈水解位點水解位點 R R1 1=Phe, Trp,Tyr=Phe, Trp,Tyr時水解快時水解快; R; R1 1= = LeuLeu，MetMet和和HisHis水解稍

37、慢。水解稍慢。 R R2 2=Pro =Pro 水解受抑。水解受抑。 NHCHC O R4 NHCHC O R3 NHCHC O R2 NHCHC O R1 肽鏈水解位點水解位點 胃蛋白酶胃蛋白酶(pepsin)(pepsin) 它要求被斷裂鍵兩側(cè)的殘基都是疏水它要求被斷裂鍵兩側(cè)的殘基都是疏水 性氨基酸，如性氨基酸，如Phe-PhePhe-Phe。此外與糜蛋白酶不同的是酶作用的。此外與糜蛋白酶不同的是酶作用的 最適最適pHpH，前者是，前者是pH2pH2，后者是，后者是pH8-9pH8-9，由于二硫鍵在酸性條件，由于二硫鍵在酸性條件 下穩(wěn)定，因此確定二硫鍵位置時，常用胃蛋白酶來水解。下穩(wěn)定，因

38、此確定二硫鍵位置時，常用胃蛋白酶來水解。 R R1 1和和R R2 2Phe, Trp, Tyr; LeuPhe, Trp, Tyr; Leu以及以及 其它疏水性氨基酸水解速度較快。其它疏水性氨基酸水解速度較快。 R R1 1=Pro =Pro 水解受抑。水解受抑。 NHCHC O R4 NHCHC O R3 NHCHC O R2 NHCHC O R1 肽鏈水解位點水解位點 嗜熱菌蛋白酶（嗜熱菌蛋白酶（thermolysinthermolysin）: :常用于斷裂較短的多肽鏈。常用于斷裂較短的多肽鏈。 R R2 2=Phe, Trp, Tyr; Leu=Phe, Trp, Tyr; Leu，I

39、le, MetIle, Met以及其它疏水性強的氨以及其它疏水性強的氨 基酸水解速度較快。基酸水解速度較快。 R R2 2=Pro=Pro或或Gly Gly 水解受抑。水解受抑。 R R1 1或或R R3 3=Pro =Pro 水解受抑。水解受抑。 葡萄球菌蛋白酶（葡萄球菌蛋白酶（Staphylococcal protease)Staphylococcal protease) 當(dāng)裂解在當(dāng)裂解在 磷酸緩沖液磷酸緩沖液(pH7.8)(pH7.8)中進行的，它能在中進行的，它能在GluGlu殘基和殘基和AspAsp殘基的殘基的 羧基側(cè)斷裂肽鍵。如果改用碳酸氫銨緩沖液羧基側(cè)斷裂肽鍵。如果改用碳酸氫銨緩

40、沖液(pH7.8)(pH7.8)或醋酸或醋酸 銨緩沖液銨緩沖液(pH4.0)(pH4.0)時，則只能斷裂時，則只能斷裂GluGlu殘基的羧基側(cè)肽鍵。殘基的羧基側(cè)肽鍵。 梭菌蛋白酶（梭菌蛋白酶（clostripainclostripain） 專門裂解專門裂解ArgArg殘基的羧基所形殘基的羧基所形 成的肽鍵。即使在成的肽鍵。即使在6mol/L6mol/L尿素中尿素中2020小時內(nèi)仍具活力，這樣對小時內(nèi)仍具活力，這樣對 不溶性蛋白質(zhì)的長時間裂解將是很有效的。不溶性蛋白質(zhì)的長時間裂解將是很有效的。 （Phe.Tyr.Trp）（Arg.Lys） （脂肪族）（脂肪族） 胰凝乳胰凝乳 蛋白酶蛋白酶 胃蛋白

41、酶胃蛋白酶彈性蛋白酶彈性蛋白酶 羧肽酶羧肽酶 胰蛋白酶胰蛋白酶 氨肽酶氨肽酶羧肽酶羧肽酶 （Phe. Trp） 2. 2. 化學(xué)裂解法化學(xué)裂解法 溴化氰溴化氰只斷裂由只斷裂由MetMet殘基的羧基參加形成的肽鍵。殘基的羧基參加形成的肽鍵。 CH3S： CH2 CH2 CHNHCNHCHC OOR +BrC+N Br- CH3S+ CH2 CH2 CHNHCNHCHC OOR CN CH3SC N CH 2 CHNHCNHCHC OOR CH2 + H2O + CH2 CHNHC O CH2 OH3N + CHC OR 高絲氨酸內(nèi)酯 羥胺羥胺能專一性地斷裂能專一性地斷裂Asn-GlyAsn-Gl

42、y之間的肽鍵。但專一性不之間的肽鍵。但專一性不 很強，如很強，如Asn-LeuAsn-Leu及及Asn-AlaAsn-Ala鍵也能部分裂解。鍵也能部分裂解。 肽段的分離提純肽段的分離提純 多肽鏈用上述方法斷裂后，所得的肽段混多肽鏈用上述方法斷裂后，所得的肽段混 合物通常使用凝膠過濾、凝膠電泳、離子交換纖維素和離子合物通常使用凝膠過濾、凝膠電泳、離子交換纖維素和離子 交換萄聚糖柱層析、高效液相色譜、高效薄層層析等方法進交換萄聚糖柱層析、高效液相色譜、高效薄層層析等方法進 行分離提純。行分離提純。 1.Edman1.Edman化學(xué)降解化學(xué)降解 （六）肽段氨基酸序列的測定（六）肽段氨基酸序列的測定

43、2.2.酶降解法酶降解法 蛋 白 水 解 酶 中 有 一 類 是 肽 鏈 外 切 酶 或 稱 外 肽 酶蛋 白 水 解 酶 中 有 一 類 是 肽 鏈 外 切 酶 或 稱 外 肽 酶 （exopeptidases)exopeptidases)，例如氨肽酶和羧肽酶，它們分別從肽鏈的，例如氨肽酶和羧肽酶，它們分別從肽鏈的 N N端和端和C C端逐個地向里切。因此，原則上只要能跟隨酶水解的過端逐個地向里切。因此，原則上只要能跟隨酶水解的過 程分別定量測出釋放的氨基酸，便能確定肽的順序。然而這種程分別定量測出釋放的氨基酸，便能確定肽的順序。然而這種 方法實際上有許多困難，局限性很大，它只能用來測定末端

44、附方法實際上有許多困難，局限性很大，它只能用來測定末端附 近很少幾個殘基的順序。近很少幾個殘基的順序。 二肽氨肽酶可從肽鏈的二肽氨肽酶可從肽鏈的N N端開始，每隔二個切斷肽鍵，得到一端開始，每隔二個切斷肽鍵，得到一 系列二肽片段，利用部分重迭法，拼湊出整條肽鏈的氨基酸順系列二肽片段，利用部分重迭法，拼湊出整條肽鏈的氨基酸順 序。序。 ab cd ef gh ij kl mn op qr st uv wx yzab cd ef gh ij kl mn op qr st uv wx yz a bc de fg hi jk lm no pq rs tu vw xy z a bc de fg hi j

45、k lm no pq rs tu vw xy z abcdefghijklmnopqrstuvwxyz abcdefghijklmnopqrstuvwxyz 4.4.根據(jù)核苷酸序列的推定法根據(jù)核苷酸序列的推定法 推定的依據(jù)是推定的依據(jù)是“中心法則中心法則”。 推定法仍需與直接的氨基酸序列分析相配合，如果沒有必需推定法仍需與直接的氨基酸序列分析相配合，如果沒有必需 的部分氨基酸序列分析，就不可能找到正確的密碼讀框。的部分氨基酸序列分析，就不可能找到正確的密碼讀框。 3.3.質(zhì)譜法質(zhì)譜法 質(zhì)譜法一次能測的氨基酸殘基一般質(zhì)譜法一次能測的氨基酸殘基一般1010個左右，但質(zhì)譜法具有個左右，但質(zhì)譜法具有

46、樣品用量少，分析速度快的優(yōu)點。樣品用量少，分析速度快的優(yōu)點。 （七）肽段在多肽鏈中次序的決定（七）肽段在多肽鏈中次序的決定 A A法水解得到四個小肽：法水解得到四個小肽： A A1 1 Ala-Phe Ala-Phe A A2 2 Gly-Lys-Asn-Tyr Gly-Lys-Asn-Tyr A A3 3 Arg-Tyr Arg-Tyr A A4 4 His-Val His-Val B B法水解得到四個小肽：法水解得到四個小肽： B B1 1 Ala-Phe-Gly-Lys Ala-Phe-Gly-Lys B B2 2 Asn-Tyr-Arg Asn-Tyr-Arg B B3 3 Tyr-

47、His-Val Tyr- His-Val 重疊法：重疊法： Ala-Phe-Gly-LysAla-Phe-Gly-LysAsn-Tyr-ArgAsn-Tyr-ArgTyr-His-ValTyr-His-Val （八）二硫橋位置的確定（八）二硫橋位置的確定 一般采用胃蛋白酶處理含有二硫鍵的多肽鏈一般采用胃蛋白酶處理含有二硫鍵的多肽鏈( (切點多；酸性環(huán)境切點多；酸性環(huán)境 下防止二硫鍵發(fā)生交換下防止二硫鍵發(fā)生交換) )。 將所得的肽段利用將所得的肽段利用BrownBrown及及HartlayHartlay的對角線電泳技術(shù)進行分離。的對角線電泳技術(shù)進行分離。 + +- - + + - - 第二向第二

48、向 第一向第一向 a a b b BrownBrown和和HartlayHartlay對角線電泳圖解對角線電泳圖解 pH6.5pH6.5 圖中圖中a a、b b兩個斑點是由兩個斑點是由 一個二硫鍵斷裂產(chǎn)生的一個二硫鍵斷裂產(chǎn)生的 肽段肽段 對角線電泳對角線電泳 對對 角角 線線 電電 泳泳 （九）蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫（九）蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫 由于測定克隆基因的核苷酸序列比測定蛋白質(zhì)氨基酸的序由于測定克隆基因的核苷酸序列比測定蛋白質(zhì)氨基酸的序 列更快、更有效，現(xiàn)在大多數(shù)蛋白質(zhì)序列是從核苷酸序列列更快、更有效，現(xiàn)在大多數(shù)蛋白質(zhì)序列是從核苷酸序列 翻譯成氨基酸序列。要確定一個新序列，研究者所作的第翻譯成氨基

49、酸序列。要確定一個新序列，研究者所作的第 一件事就是將它與數(shù)據(jù)庫中的其它已知的序列進行比較，一件事就是將它與數(shù)據(jù)庫中的其它已知的序列進行比較， 確定其中是否存在同源性。確定其中是否存在同源性。 四、蛋白質(zhì)的氨基酸序列四、蛋白質(zhì)的氨基酸序列 與生物功能與生物功能 （一）同源蛋白質(zhì)的物種差異與生物進化（一）同源蛋白質(zhì)的物種差異與生物進化 1.1.同源蛋白質(zhì)同源蛋白質(zhì) 在不同生物體中行使相同或相似功能的蛋白質(zhì)稱為在不同生物體中行使相同或相似功能的蛋白質(zhì)稱為同源蛋同源蛋 白質(zhì)白質(zhì)。 同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列具有明顯的相似性稱為同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列具有明顯的相似性稱為序列同源序列同源 性性。 2021-

50、7-8 同源蛋白質(zhì)一般具有幾乎相同長度的多肽鏈，它同源蛋白質(zhì)一般具有幾乎相同長度的多肽鏈，它 們的氨基酸序列與那些提取它們的物種的親緣關(guān)們的氨基酸序列與那些提取它們的物種的親緣關(guān) 系具有同一性。系具有同一性。 14 10 6 100 1 34 32 30 29 27 18 17 67 59 52 51 48 45 41 38 87 84 82 80 70 68 91 Gly Gly Phe Cys Gly Gly Gly Arg Lys Gly Cys Lys Phe His Pro Leu Gly Arg Tyr Ala Asn Trp Tyr 70 75 80 Lys Lys Lys Pr

51、o Pro Tyr Ile Gly Thr Met Asn Leu 血紅素血紅素 細胞色素細胞色素c c分子的空間結(jié)構(gòu)分子的空間結(jié)構(gòu) 不變不變的的 AAAA殘基殘基 35個不變的個不變的AA殘基，是殘基，是Cyt C 的生物功能所不的生物功能所不 可缺少的。其中有的可能參加維持分子構(gòu)象；有的可缺少的。其中有的可能參加維持分子構(gòu)象；有的 可能參與電子傳遞；有的可能參與可能參與電子傳遞；有的可能參與“識別識別”并結(jié)合并結(jié)合 細胞色素還原酶和氧化酶。細胞色素還原酶和氧化酶。 不同種屬不同種屬氨基酸殘基的差異數(shù)目氨基酸殘基的差異數(shù)目分歧時間分歧時間(百萬年百萬年) 人人-猴猴150-60 人人-馬馬1

52、270-75 人人-狗狗1070-75 豬豬-牛牛-羊羊0 馬馬-牛牛360-65 哺乳類哺乳類-雞雞10-15280 哺乳類哺乳類-猢猢17-21400 脊椎動物脊椎動物-酵母酵母43-481,100 細胞色素細胞色素C C分子中氨基酸殘基的差異數(shù)目及分歧時間分子中氨基酸殘基的差異數(shù)目及分歧時間 細胞色素細胞色素c c肽鏈中肽鏈中2727個位置的氨基酸殘基對所有已測試的種個位置的氨基酸殘基對所有已測試的種 屬都是相同的，表明這些殘基是規(guī)定細胞色素屬都是相同的，表明這些殘基是規(guī)定細胞色素c c的生物活性的生物活性 所必需。例如第所必需。例如第1414和第和第1717位置上的位置上的CysCys

53、殘基可能保證與輔基殘基可能保證與輔基 血紅素連接的必要位置，第血紅素連接的必要位置，第7070到到8080位置上的不變肽段可能是位置上的不變肽段可能是 細胞色素細胞色素c c與酶相結(jié)合的部分。肽鏈中的可變殘基可能是一與酶相結(jié)合的部分。肽鏈中的可變殘基可能是一 些些“填充填充”或間隔的區(qū)域，氨基酸的變換不影響蛋白質(zhì)的功或間隔的區(qū)域，氨基酸的變換不影響蛋白質(zhì)的功 能。能。 在不同種屬來源的細胞色素在不同種屬來源的細胞色素c c中，可以變換的氨基酸殘基數(shù)中，可以變換的氨基酸殘基數(shù) 目與這些種屬在系統(tǒng)發(fā)生上的位置有密切關(guān)系，即在進化位目與這些種屬在系統(tǒng)發(fā)生上的位置有密切關(guān)系，即在進化位 置上相距愈遠，

54、則氨基酸順序之間的差別愈大。細胞色素置上相距愈遠，則氨基酸順序之間的差別愈大。細胞色素c c 的氨基鼓順序分析資料已被用來核對各個物種之間的分類學(xué)的氨基鼓順序分析資料已被用來核對各個物種之間的分類學(xué) 關(guān)系，以及繪制進化樹關(guān)系，以及繪制進化樹(evolutionary tree)(evolutionary tree)即系統(tǒng)發(fā)生樹即系統(tǒng)發(fā)生樹 (phylogenetic tree)(phylogenetic tree)。根據(jù)進化樹不僅可以研究從單細胞。根據(jù)進化樹不僅可以研究從單細胞 有機體到多細胞有機體的生物進化過程，而且可以粗略估計有機體到多細胞有機體的生物進化過程，而且可以粗略估計 現(xiàn)存的各類

55、種屬生物的分歧現(xiàn)存的各類種屬生物的分歧(divergence)(divergence)時間。時間。 生物生物 與人不同的與人不同的AAAA數(shù)目數(shù)目 黑猩猩黑猩猩 0 恒河猴恒河猴 1 兔兔 9 袋鼠袋鼠 10 牛、豬、羊、狗牛、豬、羊、狗 11 馬馬 12 雞、火雞雞、火雞 13 響尾蛇響尾蛇 14 海龜海龜 15 金槍魚金槍魚 21 角餃角餃 23 小蠅小蠅 25 蛾蛾 31 小麥小麥 35 粗早鏈孢霉粗早鏈孢霉 43 酵母酵母 44 根據(jù)細胞色素根據(jù)細胞色素 C的的 順序種屬差異建立順序種屬差異建立 起來的進化樹起來的進化樹 圓圈代表進化中的圓圈代表進化中的 分歧點，支干旁的分歧點，支干旁

56、的 數(shù)字是結(jié)定有機體數(shù)字是結(jié)定有機體 譜系的細胞色素譜系的細胞色素c c 與其祖先差異的殘與其祖先差異的殘 基數(shù)基數(shù) （二）同源蛋白質(zhì)具有共同的進化起源（二）同源蛋白質(zhì)具有共同的進化起源 1.1.氧合血紅素蛋白氧合血紅素蛋白 肌紅蛋白、血紅蛋白肌紅蛋白、血紅蛋白鏈和鏈和鏈是珠蛋白，它們有很鏈是珠蛋白，它們有很 高的序列同源。這種同源關(guān)系表明隨機突變一級結(jié)構(gòu)方面高的序列同源。這種同源關(guān)系表明隨機突變一級結(jié)構(gòu)方面 氨基酸取代和分歧或趨異事件的進化順序。氨基酸取代和分歧或趨異事件的進化順序。 2.2.絲氨酸蛋白酶類絲氨酸蛋白酶類 胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和彈性蛋白酶顯示足夠的序列同胰蛋白酶、胰凝乳蛋白

57、酶和彈性蛋白酶顯示足夠的序列同 源性，它們是經(jīng)過祖先絲氨酸蛋白酶基因的復(fù)制而來。源性，它們是經(jīng)過祖先絲氨酸蛋白酶基因的復(fù)制而來。 3.3.一些功能差異很大的蛋白質(zhì)一些功能差異很大的蛋白質(zhì) 溶菌酶和溶菌酶和乳清蛋白的功能很少相似，但它們的三級結(jié)構(gòu)乳清蛋白的功能很少相似，但它們的三級結(jié)構(gòu) 卻十分相似。根據(jù)它們的序列同源性可以推論出它們的進化卻十分相似。根據(jù)它們的序列同源性可以推論出它們的進化 關(guān)系關(guān)系具有共同的起源。具有共同的起源。 （三）血液凝固與氨基酸序列的局部斷裂（三）血液凝固與氨基酸序列的局部斷裂 在動物體內(nèi)的某些生物化學(xué)過程中，蛋白質(zhì)分子的部分肽在動物體內(nèi)的某些生物化學(xué)過程中，蛋白質(zhì)分子

58、的部分肽 鏈必須先按特定的方式斷裂，然后才呈現(xiàn)生物活性。蛋白鏈必須先按特定的方式斷裂，然后才呈現(xiàn)生物活性。蛋白 質(zhì)分子的這一特性具有它的重要生物學(xué)意義。它是在生物質(zhì)分子的這一特性具有它的重要生物學(xué)意義。它是在生物 進化過程中發(fā)展起來的，是蛋白質(zhì)分于的結(jié)構(gòu)與功能具有進化過程中發(fā)展起來的，是蛋白質(zhì)分于的結(jié)構(gòu)與功能具有 高度統(tǒng)一性的表現(xiàn)。高度統(tǒng)一性的表現(xiàn)。 1.1.血液凝固的生物化學(xué)原理血液凝固的生物化學(xué)原理 血液凝固是一系列復(fù)雜的生物化學(xué)過程。這一過程的主要血液凝固是一系列復(fù)雜的生物化學(xué)過程。這一過程的主要 環(huán)節(jié)有二：一是血漿中的凝血酶原受到血漿和血小板中一環(huán)節(jié)有二：一是血漿中的凝血酶原受到血漿和

59、血小板中一 些因子的激活而形成凝血酶些因子的激活而形成凝血酶(thrombin)(thrombin)；二是血漿中的纖；二是血漿中的纖 維蛋白原在凝血酶的激活下轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄岳w維蛋白維蛋白原在凝血酶的激活下轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄岳w維蛋白(fibrin)(fibrin) 網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使血液變成凝膠。網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使血液變成凝膠。 凝血酶原是一種糖蛋白。在凝凝血酶原是一種糖蛋白。在凝 血酶原致活物的催化下，凝血血酶原致活物的催化下，凝血 酶 原 分 子 中 的 二 個 肽 鍵酶 原 分 子 中 的 二 個 肽 鍵 (Arg274-Thr275(Arg274-Thr275和和Arg323-Arg323- Ile324I

60、le324）發(fā)生斷裂，釋放出分）發(fā)生斷裂，釋放出分 子量力子量力3200032000的氨基末端片的氨基末端片 段形成有活性的凝血酶。段形成有活性的凝血酶。 凝血酶由二條肽鏈通過一個二凝血酶由二條肽鏈通過一個二 硫鍵交聯(lián)而成，一條肽鍵（硫鍵交聯(lián)而成，一條肽鍵（A A 鏈鏈) )含含4949個殘基，另一條肽鍵個殘基，另一條肽鍵 含含259259個殘基。個殘基。 纖維蛋白原分子長纖維蛋白原分子長46nm46nm，分子量為，分子量為340 000340 000，屬纖維狀蛋白，屬纖維狀蛋白 質(zhì)。每一分子含質(zhì)。每一分子含6 6條肽鏈，這條肽鏈，這6 6條肽鏈兩兩相同，分三種類，條肽鏈兩兩相同，分三種類，