糖化血紅蛋白標準化及檢測方法比較

1、內容目錄 糖化血紅蛋白標準化糖化血紅蛋白標準化 糖化血紅蛋白（糖化血紅蛋白（GHB） 檢測方法及產品示例檢測方法及產品示例 常用檢測方法之比較常用檢測方法之比較 1 2 3 4 糖化血紅蛋白（GHb） GHb是指結合了任何形式 碳水化合物的血紅蛋白， 血紅蛋白與糖基發(fā)生非酶 促，形成了不可逆的復合 物。 HbHb HbAHbA0 0HbAHbA1 1 HbA1aHbA1aHbA1bHbA1b HbA1cHbA1c HbAHbA () HbAHbA2 2 () HbFHbF () 95%95%2%2%1-3.5%1-3.5% 成人血紅蛋白分三種，成人血紅蛋白分三種， HbAHbA為主要成人為主要

2、成人HbHb 非糖化非糖化HbHb 糖化糖化HbHb 6-8%6-8%87-89%87-89% 血紅蛋白血紅蛋白 1%1%1%1%4%-6%4%-6% 糖化血紅蛋白的形成 血紅蛋白HbA由兩個亞基和兩個亞基組成，和亞 基上都有糖化位點，其中亞基第1位纈氨酸主鏈氨基 糖化率最高。 根據糖種類，糖基化血紅蛋白可分為葡萄糖糖 化、果糖糖化及乳糖糖基化血紅蛋白等。人體 內游離的葡萄糖含量遠高于其他糖類物質， 亞基的氮端纈氨酸主鏈氨基的糖化概率最高， 因此體內大部分糖基化血紅蛋白為 亞基氮端 纈氨酸與葡萄糖的加合物，該物質被命名為 HbA1c。 HbA1c糖基化位點結構圖 亞基 亞基 血紅素 血紅素 血

3、紅素 血紅素 檢測方法學分類 1、親和層析、親和層析 2、免疫法、免疫法 3、酶法、酶法 4、顯色法、顯色法 根據根據Ghb和非和非 GHb帶電不同帶電不同 基于基于Hb上糖基化上糖基化 基團的結構特點基團的結構特點 1、離子交換層析、離子交換層析 2、電泳法、電泳法 3、等電點聚焦法、等電點聚焦法 檢測方法：離子交換層析 主要有高效液相色譜法( high performance liquid chromatography， HPLC) 和手工微柱法。此方法是基 于血紅蛋白 鏈N 末端纈氨酸糖化 后所帶電荷不同而建立。在中性 pH條件下，HbA1c 攜帶的正電荷 相對較少，因此可通過離子交換

4、層析法將其與其他組分分離。 檢測方法：毛細管電泳法 毛細管電泳能分離檢測糖化血紅蛋 白和血紅蛋白的變異體，樣品用量 少、操作簡便、重復性好、省時、 高效。 完全自動化操作，簡單易用，在減 少人為誤差的基礎上，重復性也得 到了極大提高。 SEBIA全自動高壓液相毛細管電泳儀 檢測方法：瓊脂凝膠電泳法 Hb于酸性緩沖液條件下(pH6.0)，在 瓊脂糖凝膠上的電泳遷移取決于Hb 在凝膠上的吸附情況及其所帶的電 荷。HbA0因其末端的纈氨酸殘 基對凝膠的負電荷有高度的親和力， 因此它的遷移速率減慢。HbA1c因 它所連接的糖的阻斷作用，不可再 與凝膠結合，利用HbA1c和HbA0對 凝膠的親和力不同，

5、導致的電泳遷 移速率也不同，通過電泳將各成分 分開。 SEBIA蛋白質電泳儀 檢測方法：等電點聚集法 在聚丙烯酞凝膠中加入載體兩性介 質（如ampholin）的薄板上形成一 個由陽極到陰極逐漸增加的pH梯度。 溶血液中各個組分將移動到各自等 電點的pH位置上，這樣就得到比一 般電泳法更好的分劃效果和比較集 中的色帶。 GE Ettan IPGphor 3等電聚焦電泳儀 檢測方法：親和層析法 由交聯(lián)了間氨基苯硼酸間氨基苯硼酸的瓊脂糖珠作 為分離載體。當總的GHb通過載體時， 硼酸可與整合在血紅蛋白分子中的葡 萄糖順位二醇基發(fā)生可逆性結合，使 糖化的Hb選擇性地結合于凝膠柱上， 其他非糖化Hb等隨

6、緩沖液流出；然 后用另一種含糖或多羥化合物的緩沖 液將GHb洗脫下來，利用兩部分Hb本 身的顏色，在415nm條件下測定并計 算出親和色譜所測的GHb。 伯樂In2it糖化血紅蛋白儀 Alere Afinion AS100 Analyzer 檢測方法：免疫法 化學發(fā)光法：又叫離子捕獲法，采用 離子捕捉免疫分析法，應用抗原抗體 反應原理，聯(lián)合熒光標記物，通過連 接帶負電的多陰離子復合物，吸附到 帶正電的纖維表面，經過一系列徹底 清洗等步驟后，測定熒光強度變化率， 計算濃度。 檢測方法：免疫法 比濁法：又有膠乳凝集法和免疫比濁 法兩種?？蓪崿F和自動化分析儀很好 地結合起來，具有快速、準確、特異 性

7、強、重復性好、靈敏度高、線性范 圍寬等優(yōu)點，可以使用自動化分析儀 進行批量檢測。 檢測方法：免疫法 免疫層析法：免疫層析法操作簡便易 行、快速準確、試劑穩(wěn)定。更易于實 現POC檢測，有助于醫(yī)生即時獲悉患 者血糖水平，并及時給予患者醫(yī)療指 導，以避免糖尿病診斷和治療的延誤， 未來有著較為廣闊的應用前景。 Bayer 拜安時手持式糖化檢測儀 檢測方法：酶法 全血經溶血處理后，用特異蛋白內切 酶將酶解消化成果糖氨基酸，再 經果糖氨基酸氧化酶作用下產生過氧 化氫（H2O2），H2O2的濃度與血液中 GHb的含量呈正比。 H2O2在過氧化物 酶的作用下與相應的色原耦聯(lián)，發(fā)生 顏色變化，根據其變化程度可得

8、H2O2 濃度，進而得知樣本中GHb的含量。 積水醫(yī)療酶法生化試劑 糖化血紅蛋白檢測標準化 瑞典瑞典Mono S 方法方法日本日本JDS/JSCC 方法方法美國美國NGSP方法方法 對不同的對不同的HbA1c檢測檢測 方法采用統(tǒng)一參考標方法采用統(tǒng)一參考標 準準(采用采用HPLC Bio-Rex 70 陽離子交換柱陽離子交換柱)進行進行 校準，使不同方法所校準，使不同方法所 測結果具有可比性測結果具有可比性 2000 年，年，JSCC 啟用啟用KO500 陽離子陽離子HPLC ，與，與JDS 合作合作 設計了新的設計了新的HbA1c檢測校檢測校 準物，通過新校準品校準準物，通過新校準品校準 后的

9、后的KO500 HPLC HbA1c檢檢 測法，成為測法，成為JDS/JSCC 的參的參 考標準化方案考標準化方案 2004 年，年，GE Healthcare 在在 其離子交換操作手冊中，其離子交換操作手冊中， 詳細介紹了詳細介紹了Mono S HPLC 方法用于檢測方法用于檢測HbA1c的操的操 作步驟。證實作步驟。證實Mono S 5/50 GL 柱檢測精度上具有優(yōu)越柱檢測精度上具有優(yōu)越 性。性。 IFCC法：法：2007 年國際臨床化學聯(lián)合會年國際臨床化學聯(lián)合會(IFCC) 重新明確了重新明確了HbA1c 的命名、的命名、 性質、單位性質、單位: 全稱為全稱為 鏈血紅蛋白鏈血紅蛋白鏈鏈

10、N 末端脫氧果糖基血紅蛋白末端脫氧果糖基血紅蛋白; 特特 別強調別強調HbA1c 測定的是測定的是“物質分數物質分數”，而不是，而不是“質量分數質量分數”; 推薦使推薦使 用用( mmol /mol) 作為作為HbA1c 的單位，此建議為的單位，此建議為HbA1c 結果數據提供了結果數據提供了 非常明確的計量單位，可溯源到溯源鏈的最高等級國際單位制。非常明確的計量單位，可溯源到溯源鏈的最高等級國際單位制。 糖化血紅蛋白檢測標準化 2004 年，Hoelzel 等發(fā)表了關于HbA1c檢測的IFCC 標準法與美國、日本、瑞典3 個國家標準 法之間的比較研究報告。 三種國標法的基本原理是通過蛋白質表

11、面凈電荷的差異對Hb 進行分離，并未對HbA1c具有 特異性，其結果的溯源僅來自于HPLC 分離的色譜圖的峰值，三者所測得“HbA1c波峰”可 能包含其他無法分離開來的非糖化Hb 成分，其測定結果都略高于IFCC 檢測值，這同樣使 得這三種方法對同一樣品所測得的數據不同。 HbA1c常用檢測方法之比較 Source: ngsp pt 2013 11%11% 11%11% 54%54% 24%24% 31%31% 67%67% 2%2% n免疫法 n離子交換色譜 n電泳法 n親和層析色譜 19951995年年 （889889家）家） 20132013年年 （32403240家）家） HbA1c常

12、用檢測方法之比較 方法方法原理原理優(yōu)勢優(yōu)勢挑戰(zhàn)挑戰(zhàn) 酶法使用特別作用于氨基酸末端 糖化的纈氨酸的酶檢測 HbA1c 不受變異體的分析干擾，成本低、 反應速度快，無需專有儀器，全自 動生化可用 不能發(fā)現血紅蛋白變異體 免疫法使用針對糖化的鏈氨基酸 末端的抗體檢測HbA1c 在使用新一代的試劑盒時分析不受 大多數常見變異體的干擾。根據標 記方法不同，可以應用多個檢測平 臺，可實現全自動和POC檢測 不能發(fā)現血紅蛋白變異體，新一代的 試劑盒依然會受到少見變異體的分析 干擾。高濃度樣本可能需要稀釋 硼酸親和層析法糖化的血紅蛋白被綁定在硼 酸基團樹脂時，非糖化的血 紅蛋白組分直接流出分析柱 最小的Hb變

13、異體分析干擾，操作簡 單、快速、特異性強， 檢測的是總糖化血紅蛋白，而不是 HbA1c,不能發(fā)現血紅蛋白變異體。結 合方式為不穩(wěn)定的鍵合，會有結合不 穩(wěn)的情況，影響檢測結果 離子交換HPLC基于電荷分離血紅蛋白組分能夠發(fā)現常見的血紅蛋白變異體 變異體被共洗脫時易被干擾 ，儀器昂 貴，維護成本較高 毛細管電泳法基于電荷分離血紅蛋白組分能夠發(fā)現血紅蛋白變異體，樣品 用量少、操作簡便、重復性好、省 時、高效 工作流程復雜，需要特定的儀器，設 備成本高 檢測方法學分類 1、親和層析、親和層析 2、免疫法、免疫法 3、酶法、酶法 4、顯色法、顯色法 根據根據Ghb和非和非 GHb帶電不同帶電不同 基于基于Hb上糖基化上糖基化 基團的結構特點基團的結構特點 1、離子交換層析、離子交換層析 2、電泳法、電泳法 3、等電點聚焦法、等電點聚焦法 檢測方法：離子交換層析 主要有高效液相色譜法( high performance liquid chromatography， HPLC) 和手工微柱法。此方法是基 于血紅蛋白 鏈N 末端纈氨酸糖化 后所帶電荷不同而建立。在中性 pH條件下，HbA1c 攜帶的正電荷 相對較少，因此可通過離子交換 層析法將其與其他組分分離。 檢測方法：親和層析法 由交聯(lián)了間氨