《蛋白酶的測(cè)定方法》

1、1 響應(yīng)面法優(yōu)化蛋白酶生產(chǎn)工藝響應(yīng)面法優(yōu)化蛋白酶生產(chǎn)工藝 （下）（下） 2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 1、干物質(zhì)失重的測(cè)定、干物質(zhì)失重的測(cè)定 2、蛋白酶活力的測(cè)定、蛋白酶活力的測(cè)定 3、數(shù)據(jù)分析與建模、數(shù)據(jù)分析與建模 4、響應(yīng)曲面作圖、響應(yīng)曲面作圖 5、整改方案分析、整改方案分析 3 一、干物質(zhì)失重的測(cè)定 干重失重發(fā)酵前干重發(fā)酵后干重干重失重發(fā)酵前干重發(fā)酵后干重 4 二、蛋白酶活力分析二、蛋白酶活力分析 5 1、 原理原理 （1 1）、福林試劑在）、福林試劑在堿性堿性情況下極不穩(wěn)定，可被情況下極不穩(wěn)定，可被酚類酚類化合物還化合物還 原而呈藍(lán)色反應(yīng)。原而呈藍(lán)色反應(yīng)。 （2 2）、蛋白質(zhì)分子中含有具有酚基

2、的氨基酸）、蛋白質(zhì)分子中含有具有酚基的氨基酸( (酪氨酸、色氨酪氨酸、色氨 酸及苯丙氦酸等酸及苯丙氦酸等) )。 （3 3）、以）、以酪蛋白酪蛋白為底物，同酶液反應(yīng)，經(jīng)一定時(shí)間后，加為底物，同酶液反應(yīng)，經(jīng)一定時(shí)間后，加三三 氯醋酸氯醋酸，終止酶反應(yīng)，并使殘余的酪蛋白質(zhì)沉淀，同水解產(chǎn)，終止酶反應(yīng)，并使殘余的酪蛋白質(zhì)沉淀，同水解產(chǎn) 物分開(kāi)，經(jīng)過(guò)濾后取物分開(kāi)，經(jīng)過(guò)濾后取濾液濾液。用。用碳酸鈉堿化碳酸鈉堿化，再加入，再加入福林試劑福林試劑 使之發(fā)色，用分光光度計(jì)測(cè)定。使之發(fā)色，用分光光度計(jì)測(cè)定。 （4 4）、藍(lán)色反應(yīng)的強(qiáng)弱，同蛋白水解產(chǎn)物的多少成正比而水）、藍(lán)色反應(yīng)的強(qiáng)弱，同蛋白水解產(chǎn)物的多少成正比而

3、水 解產(chǎn)物的量又是同酶活力成正比例關(guān)系。因此，根據(jù)藍(lán)色反解產(chǎn)物的量又是同酶活力成正比例關(guān)系。因此，根據(jù)藍(lán)色反 應(yīng)的強(qiáng)弱就可推測(cè)蛋白酶的活力。應(yīng)的強(qiáng)弱就可推測(cè)蛋白酶的活力。 7 2 2 試劑試劑 1 1 福林試劑福林試劑 于于20002000mlml磨口回流裝置內(nèi)加入磨口回流裝置內(nèi)加入鎢酸鈉鎢酸鈉( (NaNa2 2WOWO4 42H2H2 2O)100gO)100g， 鉬酸鈉鉬酸鈉( (NaMoONaMoO4 42H2H2 2O)O)25g25g，水水700700mlml，85%85%磷酸磷酸5050m1m1，濃鹽酸濃鹽酸 10001000mlml，文火回流文火回流1010h h加入加入硫酸鋰

4、硫酸鋰( (LiLi2 2SOSO4 4)150g)150g，蒸溜水蒸溜水 5050m1m1，混勻取去冷凝器，加入幾滴混勻取去冷凝器，加入幾滴液體溴液體溴，再煮沸，再煮沸l(wèi)5minl5min，以以 驅(qū)逐殘溴及除去顏色，溶液應(yīng)驅(qū)逐殘溴及除去顏色，溶液應(yīng)呈黃色而非綠色呈黃色而非綠色。若溶液仍有。若溶液仍有 綠色，需再滴加溴液。再煮沸除去之。冷卻后，定溶至綠色，需再滴加溴液。再煮沸除去之。冷卻后，定溶至 10001000mlml。過(guò)濾，置于棕色瓶中保存。此溶液使用時(shí)加過(guò)濾，置于棕色瓶中保存。此溶液使用時(shí)加2 2倍蒸餾倍蒸餾 水稀釋水稀釋，即成稀釋的福林試劑。，即成稀釋的福林試劑。 2 2、0.40.

5、4mol/Lmol/L三氯醋酸三氯醋酸( (TCA)TCA)溶液溶液 稱取三氯醋酸稱取三氯醋酸65.465.4g g，定容至定容至10001000mlml。 3 3、0.4mol/L0.4mol/L碳酸鈉溶液碳酸鈉溶液 稱取無(wú)水碳酸鈉稱取無(wú)水碳酸鈉( (NaNa2 2COCO3 3)42.4g)42.4g，定容至定容至10001000m1m1。 4 4、0.05mol/L pH2.5 0.05mol/L pH2.5 乳酸乳酸- -乳酸鈉緩沖液乳酸鈉緩沖液 A A液：液：稱取稱取10.610.6g80-90%g80-90%乳酸加蒸餾水定容至乳酸加蒸餾水定容至10001000mlml。 B B液：

6、液：稱取稱取1616克克70%70%乳酸鈉加蒸餾水定容至乳酸鈉加蒸餾水定容至10001000mlml。 取取A A液液1616mlml與與B B液液1 1mlml稀釋稀釋1 1倍即成倍即成0.050.05mol/L pH2.5 mol/L pH2.5 乳酸乳酸 - -乳酸鈉緩沖液。乳酸鈉緩沖液。 5 5、2%2%酪蛋白溶液酪蛋白溶液 稱取干酪素稱取干酪素2 2g g加入加入0.10.1mol/Lmol/L氫氧化鈉氫氧化鈉2020mlml在水浴中加在水浴中加 熱使溶解熱使溶解( (必要時(shí)用小火加熱煮沸必要時(shí)用小火加熱煮沸) )，然后用，然后用pH2.5pH2.5乳酸乳酸- -乳乳 酸鈉緩沖液定容

7、至酸鈉緩沖液定容至10001000mlml即成。即成。 配制后應(yīng)及時(shí)使用或放入冰箱內(nèi)保存。否則極易繁殖配制后應(yīng)及時(shí)使用或放入冰箱內(nèi)保存。否則極易繁殖 細(xì)菌，引起變質(zhì)。細(xì)菌，引起變質(zhì)。 配制酪蛋白溶液定容時(shí)，若泡沫過(guò)多，則可加配制酪蛋白溶液定容時(shí)，若泡沫過(guò)多，則可加1212滴酒滴酒 精消泡。精消泡。33503350酸性蛋白酶酪蛋白溶液的配制，應(yīng)加弄乳酸酸性蛋白酶酪蛋白溶液的配制，應(yīng)加弄乳酸 2323滴濕潤(rùn)。滴濕潤(rùn)。 6 6、100100g/m1g/m1酪氨酸溶液酪氨酸溶液 精確稱取在精確稱取在l05烘箱中烘至恒重的酪氨酸烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1g，逐步逐步 加入加入0.1mol/L鹽酸鹽酸(

8、HCl)使溶解，加蒸溜水定容至使溶解，加蒸溜水定容至100m1， 其濃度為其濃度為1000g/m1。 再吸取此液再吸取此液10ml以蒸餾水定容至以蒸餾水定容至100ml即配成即配成 100g/m1酪氨酸镕液酪氨酸镕液 此溶液配成后也應(yīng)及時(shí)使用或放入冰箱內(nèi)保存，以免繁此溶液配成后也應(yīng)及時(shí)使用或放入冰箱內(nèi)保存，以免繁 殖細(xì)菌而變質(zhì)。殖細(xì)菌而變質(zhì)。 3 3 操作步驟操作步驟 3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 （1 1）按表配制各種不同濃度的酪氨酸溶液）按表配制各種不同濃度的酪氨酸溶液 (2)(2)測(cè)定步驟測(cè)定步驟 另取另取6 6支試管按上表編號(hào)分別吸取不同濃度的酪氨支試管按上表編號(hào)分別吸取不同濃

9、度的酪氨 酸酸1 1mlml，各加入各加入0.40.4mo1/Lmo1/L碳酸鈉碳酸鈉5 5m1m1，再加入已稀釋的福再加入已稀釋的福 林試劑林試劑1 1m1m1。 搖勻置于水浴鍋中，搖勻置于水浴鍋中，4040保溫發(fā)色保溫發(fā)色2020minmin，在波長(zhǎng)在波長(zhǎng) 660660nmnm處測(cè)定吸光度。一般測(cè)處測(cè)定吸光度。一般測(cè)3 3次，取平均值次，取平均值 以吸光度為縱座標(biāo)，酪氨酸的濃度為橫座標(biāo)，繪制以吸光度為縱座標(biāo)，酪氨酸的濃度為橫座標(biāo)，繪制 成標(biāo)準(zhǔn)曲線。成標(biāo)準(zhǔn)曲線。 準(zhǔn)確稱取蛋白酶固態(tài)發(fā)酵的濕曲準(zhǔn)確稱取蛋白酶固態(tài)發(fā)酵的濕曲2 2g g，用用10102020mlml蒸蒸 餾水，餾水，3030浸提浸

10、提半小時(shí)，用濾紙半小時(shí)，用濾紙過(guò)濾過(guò)濾。將濾液稀釋一定。將濾液稀釋一定 倍數(shù)倍數(shù)( (使其測(cè)定光密度在使其測(cè)定光密度在0.20.20.40.4范圍內(nèi)為宜范圍內(nèi)為宜) )。 3.2 3.2 酶液的制備酶液的制備 取四支試管，分別加入取四支試管，分別加入1 1mlml稀釋酶液，其中一支為空白稀釋酶液，其中一支為空白 管，三支為平行試驗(yàn)管，置入管，三支為平行試驗(yàn)管，置入4040水浴中預(yù)熱水浴中預(yù)熱3 35 5minmin。 在三支平行試驗(yàn)管中分別加入在三支平行試驗(yàn)管中分別加入1 1ml 2% ml 2% 酪蛋白溶液，準(zhǔn)酪蛋白溶液，準(zhǔn) 確計(jì)時(shí)保溫確計(jì)時(shí)保溫1010minmin。立即加入立即加入2 2m

11、l 0.4Mml 0.4M三氯乙酸溶液，三氯乙酸溶液， l5minl5min后用濾紙過(guò)濾。分別吸取后用濾紙過(guò)濾。分別吸取1 1mlml清液，加清液，加5 5ml 0.4Mml 0.4M碳酸碳酸 鈉溶液，最后加入鈉溶液，最后加入1 1mlml福林福林- -酚試劑，搖勻，于酚試劑，搖勻，于4040水浴中水浴中 顯色顯色2020minmin。 空白管中先加入空白管中先加入2 2ml 0.4Mml 0.4M三氯乙酸溶液，再加三氯乙酸溶液，再加l ml 2%l ml 2% 酪蛋白溶液，酪蛋白溶液，1515minmin后用濾紙過(guò)濾。以下操作與平行試驗(yàn)管后用濾紙過(guò)濾。以下操作與平行試驗(yàn)管 相同。相同。 以空

12、白管為對(duì)照，在以空白管為對(duì)照，在680納米納米波長(zhǎng)下測(cè)波長(zhǎng)下測(cè)光密度光密度，取其平，取其平 均值。均值。 3.3 3.3 測(cè)定測(cè)定 蛋白酶活力單位定義：蛋白酶活力單位定義：在在4040，pH2.5pH2.5下，每分鐘水解下，每分鐘水解 酪蛋白釋放酪蛋白釋放1 1微克酪氨酸的酶量定義為微克酪氨酸的酶量定義為1 1個(gè)蛋白酶單位。個(gè)蛋白酶單位。 式中：式中： K K：標(biāo)準(zhǔn)曲線中標(biāo)準(zhǔn)曲線中ODOD值為值為1 1所相當(dāng)?shù)睦野彼岬奈⒖藬?shù)；所相當(dāng)?shù)睦野彼岬奈⒖藬?shù)； OD OD：平行試驗(yàn)管的平均光密度；平行試驗(yàn)管的平均光密度； 4 4：試管中反應(yīng)液總體積：試管中反應(yīng)液總體積( (毫升毫升) )； 10 10：

13、反應(yīng)：反應(yīng)1010分鐘；分鐘； N N：稀釋倍數(shù)；稀釋倍數(shù)；W W：曲的稱取量曲的稱取量( (克克) ) 4 4 計(jì)算計(jì)算 （1 1）對(duì)于同一臺(tái)分光光度計(jì)與同一批福林）對(duì)于同一臺(tái)分光光度計(jì)與同一批福林- -酚試劑，酚試劑， 其工作曲線其工作曲線K K值可以沿用，當(dāng)另配福林值可以沿用，當(dāng)另配福林- -酚試劑時(shí)，工作曲酚試劑時(shí)，工作曲 線應(yīng)重作。線應(yīng)重作。 （2 2）當(dāng)用不同產(chǎn)品的酪蛋白對(duì)同一蛋白酶測(cè)定時(shí)，）當(dāng)用不同產(chǎn)品的酪蛋白對(duì)同一蛋白酶測(cè)定時(shí)， 其結(jié)果會(huì)有差異，故蛋白酶活力表示時(shí)應(yīng)注明所用酪蛋白其結(jié)果會(huì)有差異，故蛋白酶活力表示時(shí)應(yīng)注明所用酪蛋白 的生產(chǎn)廠。的生產(chǎn)廠。 5 5 說(shuō)明說(shuō)明 三、三、數(shù)據(jù)分析與建模數(shù)據(jù)分析與建模 使用使用DESIGN EXPERT 7.1 軟件軟件 1、建立數(shù)學(xué)模型、建立數(shù)學(xué)模型 2、模型顯著性檢驗(yàn)、模型顯著性檢驗(yàn) 3、解方程，求出最佳發(fā)酵條件、解方程，求出最佳發(fā)酵條件 4、求出模型所預(yù)測(cè)的最高產(chǎn)量。、求出模型所預(yù)測(cè)的最高產(chǎn)量。 四、響應(yīng)曲面作圖四、響應(yīng)曲面作圖 D esign-E xpert?S oftware R1 55.3 28.8 X 1 = A : A X 2 = B : B A c tual Fac tor C