李若瑜-藥敏試驗(yàn)

1、Dept. Dermatology and Dept. Dermatology and VenereologyVenereology, Peking University First Hospital, Peking University First Hospital 臨床常見(jiàn)病原真菌耐藥監(jiān)測(cè)臨床常見(jiàn)病原真菌耐藥監(jiān)測(cè) 北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚科 北京大學(xué)真菌和真菌病研究中心 李若瑜 第第16期國(guó)家級(jí)繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育項(xiàng)目（期國(guó)家級(jí)繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育項(xiàng)目（2015），皮膚真菌病基礎(chǔ)和臨床研究進(jìn)展講習(xí)班），皮膚真菌病基礎(chǔ)和臨床研究進(jìn)展講習(xí)班 Dept. Dermatology and Dept. Dermatol

2、ogy and VenereologyVenereology, Peking University First Hospital, Peking University First Hospital 內(nèi)內(nèi) 容容 藥敏試驗(yàn)的常用方法及應(yīng)用藥敏試驗(yàn)的常用方法及應(yīng)用 抗真菌藥物的耐藥監(jiān)測(cè)現(xiàn)狀抗真菌藥物的耐藥監(jiān)測(cè)現(xiàn)狀 抗真菌藥物的耐藥機(jī)制研究近況抗真菌藥物的耐藥機(jī)制研究近況 Dept. Dermatology and Dept. Dermatology and VenereologyVenereology, Peking University First Hospital, Peking Univers

3、ity First Hospital 抗真菌藥物的種類(lèi)抗真菌藥物的種類(lèi) 泊沙康唑泊沙康唑 Dept. Dermatology and Dept. Dermatology and VenereologyVenereology, Peking University First Hospital, Peking University First Hospital 侵襲性真菌感染逐漸增多侵襲性真菌感染逐漸增多 念珠菌院內(nèi)感染第位的病原菌念珠菌院內(nèi)感染第位的病原菌 曲霉第曲霉第2 2位的病原真菌位的病原真菌 接合菌接合菌( (毛霉毛霉) ) 隱球菌隱球菌 Dept. Dermatology and De

4、pt. Dermatology and VenereologyVenereology, Peking University First Hospital, Peking University First Hospital 臨床有增多趨勢(shì)的條件性真菌臨床有增多趨勢(shì)的條件性真菌 非白念念珠菌感染非白念念珠菌感染 毛孢子菌感染毛孢子菌感染 地霉感染地霉感染 鐮刀菌感染鐮刀菌感染 枝頂孢霉感染枝頂孢霉感染 暗色真菌感染暗色真菌感染 馬爾尼菲青霉馬爾尼菲青霉 Dept. Dermatology and Dept. Dermatology and VenereologyVenereology, Pekin

5、g University First Hospital, Peking University First Hospital 真菌耐藥菌株的不斷出現(xiàn)真菌耐藥菌株的不斷出現(xiàn). 耐氟康唑的白念珠菌 耐伊曲康唑、伏立康唑以及泊沙康唑的絲狀真菌 耐兩性霉素B絲狀真菌 耐卡泊芬凈的念珠菌株 Dept. Dermatology and Dept. Dermatology and VenereologyVenereology, Peking University First Hospital, Peking University First Hospital 藥敏試驗(yàn)的作用藥敏試驗(yàn)的作用 評(píng)價(jià)新型抗真菌藥物的

6、體外抗菌活性，評(píng)價(jià)新型抗真菌藥物的體外抗菌活性， 開(kāi)發(fā)新藥開(kāi)發(fā)新藥; 檢測(cè)臨床病原真菌對(duì)不同抗真菌藥物的檢測(cè)臨床病原真菌對(duì)不同抗真菌藥物的 體外敏感性體外敏感性; 指導(dǎo)臨床用藥的選擇指導(dǎo)臨床用藥的選擇, 監(jiān)測(cè)療效監(jiān)測(cè)療效,發(fā)現(xiàn)耐發(fā)現(xiàn)耐 藥株藥株. Dept. Dermatology and Dept. Dermatology and VenereologyVenereology, Peking University First Hospital, Peking University First Hospital 藥敏試驗(yàn)測(cè)定方法藥敏試驗(yàn)測(cè)定方法 液基稀釋法液基稀釋法CLSI M27-A3，M3

7、8-A2 瓊脂稀釋法瓊脂稀釋法 紙片擴(kuò)散法紙片擴(kuò)散法CLSI M44-A2 Etest法法, ATB Fungus2,3 聯(lián)合用藥：棋盤(pán)法聯(lián)合用藥：棋盤(pán)法 棘白菌素類(lèi)棘白菌素類(lèi) Dept. Dermatology and Dept. Dermatology and VenereologyVenereology, Peking University First Hospital, Peking University First Hospital 標(biāo)準(zhǔn)化的藥敏方法日趨成熟標(biāo)準(zhǔn)化的藥敏方法日趨成熟 CLSI （NCCLS)制定的標(biāo)準(zhǔn)被普遍接受制定的標(biāo)準(zhǔn)被普遍接受 M27A3 酵母菌肉湯稀釋法體外抗真

8、菌藥敏酵母菌肉湯稀釋法體外抗真菌藥敏 試驗(yàn)參考方法試驗(yàn)參考方法 _棘白菌素類(lèi)折點(diǎn)棘白菌素類(lèi)折點(diǎn) M38A2絲狀真菌肉湯稀釋法體外抗真菌藥絲狀真菌肉湯稀釋法體外抗真菌藥 敏試驗(yàn)參考方法敏試驗(yàn)參考方法 _新質(zhì)控株、皮膚癬菌新質(zhì)控株、皮膚癬菌 M44A2酵母菌紙片擴(kuò)散法抗真菌藥敏試驗(yàn)酵母菌紙片擴(kuò)散法抗真菌藥敏試驗(yàn) EUCAST標(biāo)準(zhǔn)（標(biāo)準(zhǔn)（European Committee for Antibiotic Susceptibility Testing）與）與CLSI 取得一致取得一致 Dept. Dermatology and Dept. Dermatology and VenereologyVene

9、reology, Peking University First Hospital, Peking University First Hospital Dept. Dermatology and Dept. Dermatology and VenereologyVenereology, Peking University First Hospital, Peking University First Hospital 酵母菌藥敏試驗(yàn)酵母菌藥敏試驗(yàn) 建立了對(duì)以下藥物的測(cè)定方法建立了對(duì)以下藥物的測(cè)定方法: 氟康唑、伊曲康唑、氟康唑、伊曲康唑、 5-FC、兩性霉素、兩性霉素 B、伏立康唑、伏立康唑;

10、 體外體外-體內(nèi)療效關(guān)系已初步建立體內(nèi)療效關(guān)系已初步建立,特別對(duì)特別對(duì) 氟康唑氟康唑; 已提出判定折點(diǎn)及其解釋已提出判定折點(diǎn)及其解釋. Dept. Dermatology and Dept. Dermatology and VenereologyVenereology, Peking University First Hospital, Peking University First Hospital 絲狀真菌藥敏試驗(yàn)絲狀真菌藥敏試驗(yàn) 產(chǎn)孢菌種已建立方法產(chǎn)孢菌種已建立方法; 針對(duì)目前臨床常用藥物針對(duì)目前臨床常用藥物(棘白菌素棘白菌素); 但尚未建立折點(diǎn)但尚未建立折點(diǎn); 體外體外體內(nèi)體內(nèi)的一致性

11、尚在探討中的一致性尚在探討中; 檢測(cè)檢測(cè)煙曲霉菌煙曲霉菌 對(duì)唑類(lèi)藥物的敏感性有意義對(duì)唑類(lèi)藥物的敏感性有意義; 兩性霉素兩性霉素B 解釋仍然困難解釋仍然困難; 詳細(xì)鑒定到種水平是必要的詳細(xì)鑒定到種水平是必要的; 如如土曲霉土曲霉, 尖端賽多孢子菌尖端賽多孢子菌, 和和多育賽多孢多育賽多孢一般對(duì)兩性霉素一般對(duì)兩性霉素B 耐藥耐藥. Dept. Dermatology and Dept. Dermatology and VenereologyVenereology, Peking University First Hospital, Peking University First Hospital

12、Etest和其它商品化方法和其它商品化方法 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn): : 使用簡(jiǎn)便；使用簡(jiǎn)便； 對(duì)酵母菌比較穩(wěn)定對(duì)酵母菌比較穩(wěn)定, , 絲狀菌尚絲狀菌尚 在研究中；在研究中； 與與CLSICLSI方法有較高一致性；方法有較高一致性； 但對(duì)唑類(lèi)的但對(duì)唑類(lèi)的MICs MICs 常由于存在拖常由于存在拖 尾難以判斷；尾難以判斷； 其它的快速檢測(cè)試劑尚需進(jìn)一其它的快速檢測(cè)試劑尚需進(jìn)一 步驗(yàn)證步驗(yàn)證, , 如如ROSCOROSCO紙片法。紙片法。 Dept. Dermatology and Dept. Dermatology and VenereologyVenereology, Peking University

13、First Hospital, Peking University First Hospital 判斷抗真菌藥的敏感性和耐藥性 CLSICLSI方案測(cè)定念珠菌體外敏感試驗(yàn)折點(diǎn)方案測(cè)定念珠菌體外敏感試驗(yàn)折點(diǎn) MIC（g/ml） 敏感敏感 S 劑量依賴(lài)性敏感劑量依賴(lài)性敏感 SDD 中介中介 I 耐藥耐藥 R 氟康唑氟康唑=64 伊曲康唑伊曲康唑*1 氟胞嘧啶氟胞嘧啶32 伏立康唑伏立康唑=4 *數(shù)據(jù)主要基于粘膜疾病 Dept. Dermatology and Dept. Dermatology and VenereologyVenereology, Peking University First

14、Hospital, Peking University First Hospital M-44AM-44A方案測(cè)定方案測(cè)定念珠菌體外敏感試驗(yàn)?zāi)钪榫w外敏感試驗(yàn)折點(diǎn)折點(diǎn) 抑菌菌直徑（抑菌菌直徑（mmmm） 敏感敏感 S S 劑量依賴(lài)性敏感劑量依賴(lài)性敏感 SDDSDD 耐藥耐藥 R R 氟康唑氟康唑 FluconazoleFluconazole =19=1915-1815-18=14=17=1714-1614-16=13=13 Dept. Dermatology and Dept. Dermatology and VenereologyVenereology, Peking University

15、First Hospital, Peking University First Hospital 藥敏試驗(yàn)的應(yīng)用指征藥敏試驗(yàn)的應(yīng)用指征 盡可能將臨床分離株鑒定到種；盡可能將臨床分離株鑒定到種； 意義：曲霉中敏感性不同，土曲、新種意義：曲霉中敏感性不同，土曲、新種 無(wú)菌部位的念珠菌，常規(guī)做氟康唑和無(wú)菌部位的念珠菌，常規(guī)做氟康唑和 5-FC藥敏；藥敏； 黏膜感染，治療失敗后應(yīng)行藥敏；黏膜感染，治療失敗后應(yīng)行藥敏； 天然耐藥者不測(cè)天然耐藥者不測(cè). . Dept. Dermatology and Dept. Dermatology and VenereologyVenereology, Peking

16、University First Hospital, Peking University First Hospital 內(nèi)內(nèi) 容容 藥敏試驗(yàn)的常用方法及應(yīng)用藥敏試驗(yàn)的常用方法及應(yīng)用 抗真菌藥物的耐藥監(jiān)測(cè)現(xiàn)狀抗真菌藥物的耐藥監(jiān)測(cè)現(xiàn)狀 抗真菌藥物的耐藥機(jī)制研究近況抗真菌藥物的耐藥機(jī)制研究近況 Dept. Dermatology and Dept. Dermatology and VenereologyVenereology, Peking University First Hospital, Peking University First Hospital ARTEMIS DISKARTEMIS

17、DISK藥敏監(jiān)測(cè)藥敏監(jiān)測(cè) 來(lái)自全球來(lái)自全球4040個(gè)國(guó)家個(gè)國(guó)家134134個(gè)研究點(diǎn)個(gè)研究點(diǎn) 氟康唑:205,329株酵母菌(1997至2005)； 伏立康唑:147,776株酵母菌(2001至2005)； 方法：CLSI M44-A紙片擴(kuò)散法 結(jié)果：BIOMIC圖象分析系統(tǒng)自動(dòng)判讀。 Pfaller et al. J Clin Microbiol 2007, Vol.45, P.1735-45 Dept. Dermatology and Dept. Dermatology and VenereologyVenereology, Peking University First Hospital,

18、 Peking University First Hospital ARTEMIS DISK 監(jiān)測(cè)結(jié)果監(jiān)測(cè)結(jié)果 90.1%的念珠菌株對(duì)氟康唑敏感，22個(gè)種中有10個(gè)種出 現(xiàn)敏感性降低(敏感度16 AF30.5 AF416 AF516 AF616 Dept. Dermatology and Dept. Dermatology and VenereologyVenereology, Peking University First Hospital, Peking University First Hospital AF2的CYP51A第220位蛋氨 酸被異亮氨酸替代(M220I) AF4-6的CY

19、P51A第54位的甘 氨酸被精氨酸替代(G54R) Dept. Dermatology and Dept. Dermatology and VenereologyVenereology, Peking University First Hospital, Peking University First Hospital 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Cyp51A基因 相對(duì)表達(dá)水平 AF1 AF2 AF3 AF4 AF5 AF6 0 1 2 3 4 5 6 7 8 atrF基因 相對(duì)表達(dá)水平 AF1 AF2 AF3 AF4 AF5 AF6 0 1 2 3 4 5 6 7 8 MDR1基因

20、相對(duì)表達(dá)水平 AF1 AF2 AF3 AF4 AF5 AF6 0 1 2 3 4 5 6 7 8 MDR4基因 相對(duì)表達(dá)水平 AF1 AF2 AF3 AF4 AF5 AF6 0 1 2 3 4 5 6 7 8 MDR3基因 相對(duì)表達(dá)水平 AF1 AF2 AF3 AF4 AF5 AF6 0 1 2 3 4 5 6 7 8 MDR2基因 相對(duì)表達(dá)水平 AF1 AF2 AF3 AF4 AF5 AF6 藥物流出泵及唑類(lèi)藥物靶酶基因相對(duì)表達(dá)水平藥物流出泵及唑類(lèi)藥物靶酶基因相對(duì)表達(dá)水平 Dept. Dermatology and Dept. Dermatology and VenereologyVener

21、eology, Peking University First Hospital, Peking University First Hospital Mann P. A, et al .Antimicrob. Agents Chemother, 2003,47: 577-581. Diaz-Guerra T. M,et al. Antimicrob. Agents Chemother, 2003,47: 1120-1124 Nascimento A. M,et al. Antimicrob. Agents Chemother, 2003,47: 1719-1726 Mellado E. et

22、al. Antimicrob. Agents Chemother, 2004,48: 2747-2750 煙曲霉菌 cyp51A 基因突變的報(bào)道 Dept. Dermatology and Dept. Dermatology and VenereologyVenereology, Peking University First Hospital, Peking University First Hospital 有關(guān)三唑類(lèi)耐藥的氨基酸替換 氨基酸改變氨基酸改變耐藥藥物耐藥藥物 M220I, M220V, M220K, M220T 伊曲康唑伊曲康唑 G54R, G54E, G54K, G54V

23、伊曲康唑和泊沙康唑伊曲康唑和泊沙康唑 L98H伊曲康唑、泊沙康唑、伏立伊曲康唑、泊沙康唑、伏立 康唑和立?？颠蚩颠蚝土⒏？颠?許多三唑類(lèi)耐藥是因?yàn)樵?CYP51A 基因啟動(dòng)子 L89H 與2個(gè)拷貝的34 bp片段串 聯(lián)相結(jié)合。 Dept. Dermatology and Dept. Dermatology and VenereologyVenereology, Peking University First Hospital, Peking University First Hospital 藥物主動(dòng)外排泵的變化 基因標(biāo)志基因標(biāo)志 蛋白蛋白參考文獻(xiàn)參考文獻(xiàn) AfuMDR1 ATP-結(jié)合盒超家族

24、結(jié)合盒超家族 Tobin, M. B.et al gene 1997 AfuMDR2 ATP-結(jié)合盒超家族結(jié)合盒超家族 AfuMDR3 主要輔助因子主要輔助因子 超家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 Nascimento A. M. et al Antimicrob Agents Chemother 2003 AfuMDR4 ATP-結(jié)合盒超家族結(jié)合盒超家族 AtrF ATP-結(jié)合盒超家族結(jié)合盒超家族 John W. Slaven et al. Fungal Genetics and Biology 2002 Dept. Dermatology and Dept. Dermatology and Ve

25、nereologyVenereology, Peking University First Hospital, Peking University First Hospital Update on azole resistance in Aspergillus fumigatus Dept. Dermatology and Dept. Dermatology and VenereologyVenereology, Peking University First Hospital, Peking University First Hospital 曲霉與唑類(lèi)曲霉與唑類(lèi) In vitro “red

26、uced susceptibility” remains 0-5% in most large surveys, often using itraconazole Most data for A. fumigatus section Case reports and case series suggest that multiply- azole resistant Aspergillus could emerge ? association with agricultural azole use Rodriguez-Tudela, et al. Antimicrob Agents Chemo

27、ther. 2008;52:2468. Verweij, et al. N Engl J Med. 2007;356:1481-83. Arendrup, et al. Antimicrob Agents Chemother. 2008;52:3504-11. Howard, et al. Int J Antimicrob Agents Chemother. 2006;28:450-53. Snelders et al. PLoS Medicine. 2008;5:e219. Dept. Dermatology and Dept. Dermatology and VenereologyVene

28、reology, Peking University First Hospital, Peking University First Hospital 唑類(lèi)藥物對(duì)曲霉的流行病學(xué)折點(diǎn)唑類(lèi)藥物對(duì)曲霉的流行病學(xué)折點(diǎn) ECV (g/mL) ITRPSCVRC Species No. Tested A. fumigatus281510.251 A. flavus59210.51 A. niger520212 A. terreus46220.51 Espinel-Ingroff et al. JCM. 2010; submitted. Dept. Dermatology and Dept. Dermato

29、logy and VenereologyVenereology, Peking University First Hospital, Peking University First Hospital Development of Azole resistance of A. fumigatus P.Verweij, TIMM, 2007 菌株菌株ITCVRCAMBCAS AF2930.5110.25 04787-16810.5 04787-162 10.25 Repeat numbers of Repeat numbers of microsatellite locimicrosatellite loci A Allelic profilellelic profilee e STST Af Af 3A3A Af Af 3 3B B Af Af 3 3C C AfAf 4A4A AfAf 4B4B AfAf4 4 C C ANXANX 4 4 BGTBGT 1 1 CATCAT 1 1 LILI P P MAT1 MAT1 2 2 SOSO DBDB ZRZR F2F2 31318 85 57 79 919192 21 14 41 11 11 11 13232 29298 85 57 79 919192 21 13 31 11 11 11 19