石斛組織培養(yǎng)研究進展

1、石斛組織培養(yǎng)研究進展張明1,夏鴻西2,朱利泉2,張玉進2(1.重慶市中藥研究院,重慶400065;2.西南農(nóng)業(yè)大學(xué),重慶400716)摘要目的:綜述國內(nèi)外對石斛組織培養(yǎng)進行的深入研究。方法:系統(tǒng)查閱國內(nèi)外近10年來的有關(guān)文獻20余篇。結(jié)果與結(jié)論:介紹了石斛組培的多種方法,對培養(yǎng)基、激素及多種條件對組培的影響作了論述,并提出了存在的問題及對策。石斛屬Dendrobium為蘭科第2大屬,多年生草本植物,全球計有1 500種。多生于樹皮或巖石上,開花多,結(jié)果少,每果可含100萬粒種子。種子細如粉塵1,每粒重約0.30.4g。種胚不超過球形階段,即存在后熟現(xiàn)象。由于缺乏胚乳組織,需與真菌共生(symb

2、iotical)才能萌發(fā),自然條件下發(fā)芽率一般不及5%。石斛為合軸生長(sympodial),分株是其繁殖的主要方式,對生長條件的要求較為苛刻。石斛屬植物中有不少是名貴中藥,在本草綱目中石斛被列為上品。我國76種石斛屬植物中有近40種作藥用2,著名的有D.nobile(金釵石斛)、D.candium(鐵皮石斛)、D.huosanness(霍山石斛)等。具有強陰益精、補腎益力、輕生延年等作用,其應(yīng)用范圍正迅速擴大。石斛屬植物約有四分之一可供觀賞3,稱為石斛蘭D.orchids,以花艷麗而著稱,近年作為觀賞植物發(fā)展迅速,已形成獨立產(chǎn)業(yè)。集藥用和觀賞于一體的價值,加之過度的采伐利用和繁殖率低,造成了

3、石斛供需之間的緊張狀況,我國已將其列為瀕于絕滅的受保護的中藥品種之一。自1960年法國人Gmorel利用石斛基尖組織培養(yǎng)無病毒植株的無性繁殖技術(shù)創(chuàng)立以來,石斛組織培養(yǎng)逐步走向深入化。近年來,石斛組織培養(yǎng)的最佳條件,包括光照、溫度、pH以及如何選用外植體,選用激素等取得長足進展,并利用組培技術(shù)研究種子萌發(fā)過程中的生理生化變化等,還獲得了轉(zhuǎn)基因石斛植株。我國石斛組織培養(yǎng)研究起步較晚,直到1984年,徐云鵬等才首次報道獲得霍山石斛試管苗4。此后又利用鐵皮石斛、束花石斛、兜唇石斛的莖尖、葉尖或種胚獲得了再生植株。1石斛組織培養(yǎng)再生植株的獲得組織培養(yǎng)獲得石斛再生植物株的途徑有器官發(fā)生型和原球莖發(fā)生型兩種

4、。器官發(fā)生型通過外植體組織培養(yǎng),使預(yù)先存在的分生組織形成芽(如腋芽)或不定分生組織(如子葉、莖段、愈傷組織等)形成不定芽。此途徑又可分為3種類型:無菌短枝型(又稱節(jié)培法),芽增殖型,器官發(fā)生型;原球莖發(fā)生途徑通過石斛適宜外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生胚性愈傷組織并增殖,隨后形成類胚組織原球莖進而發(fā)育成完整的再生植株。通常由種子離體培養(yǎng)產(chǎn)生的胚性組織稱原球莖(protocorm),而上外植體葉尖、基尖等誘導(dǎo)形成的胚性組織稱為擬原球莖(protocorm like bodies)即PLBs。原球莖或擬原球莖轉(zhuǎn)入不含任何激素或生長素的培養(yǎng)基(如MS)便可再生出完整小植株。1.1原球莖發(fā)生影響原球莖發(fā)生的主要有外植體

5、的大小、來源、生理狀態(tài)、培養(yǎng)基類型、激素濃度,種類、處理時間及一些其它因素。1.1.1外植體石斛組培擬原球莖的誘導(dǎo)可以選擇花序枝、葉尖、莖節(jié)切段等作外植體。Lam ChanLT等5用D.somia的花序枝尖作外植體在VW培養(yǎng)基上誘導(dǎo)PLBs的發(fā)生,結(jié)果以13 mm的外植體形成的PLBs數(shù)目最多。取莖基部的分蘗芽或莖的頂芽作外植體,前者好于后者。Kim報道取側(cè)芽進行液體培養(yǎng),在45 d內(nèi)開始形成擬原球莖。以種子離體培養(yǎng)形成原球莖的能力與其種齡有關(guān),葉秀鱗6取鐵皮石斛26個月種齡的胚進行離體培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),種齡愈長;其胚細胞愈多,萌發(fā)形成原球莖的頻率就越高,但4,5,6個月種齡的胚差不多。曾宋君7用5種

6、石斛的種子在N6培養(yǎng)基上進行組培得出了相似的結(jié)論。1.1.2培養(yǎng)基選擇適宜的培養(yǎng)基對石斛的分化至關(guān)重要,常用的培養(yǎng)基為MS,Nitch,Knudso C(KC),N6等。Devi J等8利用D.moschatum的莖尖在5種培養(yǎng)基上誘導(dǎo)PLBs的發(fā)生,結(jié)果以Nitch培養(yǎng)基的效果最好;Suman K91991年在KL,VW,MS,W,Nitch,Mitra 6種培養(yǎng)基上進行D.fimbria-tum種子的離體培養(yǎng),結(jié)果發(fā)現(xiàn)在Nitch,VW上培養(yǎng)基上萌發(fā)率高達91%,其次是MS(85%),在MS,Nitch,VW上培養(yǎng)45 d便出現(xiàn)原球莖,其它培養(yǎng)基則出現(xiàn)較遲。MS培養(yǎng)基上獲得的原球莖體積最大

7、,因此作者推斷D.fimbriatum的種子萌發(fā)及發(fā)育需要鹽分較高的培養(yǎng)基。這與周華偉10報道的石斛組培的結(jié)果相似。曾宋君7以D.candium,D.loddigesi,D.wagii,D.densiflorum,D.fim-briatum5種石斛在MS,KS,SH,VW,KC,改良N6及PT培養(yǎng)基上進行離體培養(yǎng),得出石斛的最適通用培養(yǎng)基是改良N6或PT培養(yǎng)基附加0.2 mgL-1的NAA和2%蔗糖。此外,側(cè)芽和頂芽對培養(yǎng)基的要求也各不相同,VW液體培養(yǎng)基對節(jié)生花型石斛效果較好,在45周內(nèi)即可形成PLBs;蝶生花型和常綠類石斛的腋芽用KC固體培養(yǎng)基要比KC液體培養(yǎng)基好,以頂芽作外植體則正相反。

8、繼代和初代培養(yǎng)的培養(yǎng)基可以不同。石斛的原球莖易分化成苗,故繼代培養(yǎng)基以液體振蕩培養(yǎng)可獲得較佳效果。1.1.3激素一般高濃度的細胞分裂素有利于誘導(dǎo)芽的發(fā)生,而高濃度的2.4-D對愈傷組織的誘導(dǎo)形成有促進作用。愈傷組織的不規(guī)則分裂會導(dǎo)致擬原球基和不定芽的發(fā)生,Lan C以花枝尖作外植體在VW培養(yǎng)基上添加1 mgL-16-BA和0.1 mgL-1NAA或添加1 mgL-1Kintin和0.1 mgL-12.4-D均能獲得高比例的PLBs,周月坤11在MS培養(yǎng)基上附加0.5 mgL-16-BA和0.52.0 mgL-12.4-D,由葉基部誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織,進而分化出擬原球莖獲得完整植株,并指出2.4-

9、D對誘導(dǎo)愈傷組織形成和分化有重要作用,NAA的加入對分化PLBs的有一定的促進作用。王光遠12以D.can-dium種子離體培養(yǎng),在MS上添加0.5 mgL-1NAA,暗處培養(yǎng)1周后產(chǎn)生大量的愈傷組織,轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng),原球莖大量發(fā)生。外加激素ABA對原球莖的分化也會產(chǎn)生影響,在添加0.5 mgL-1ABA的MS培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)15d后轉(zhuǎn)入含2 mgL-16-BA的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng),150 d后其試管開花率達84.0%,而不用ABA預(yù)處理的,其成花率只有27.0%。如果原球莖繼續(xù)在含ABA的培養(yǎng)基上培養(yǎng)則不會有培養(yǎng)體花芽的發(fā)生。1.1.4其它影響因素除了外植體、培養(yǎng)基、激素影響外,光照、溫度、pH以

10、及外源添加物等也會影響原球莖或PLBs的發(fā)生及發(fā)育。石斛組培常用的溫度為(261) ,光強1 6002 000 lx,日照光8 h,pH為5.05.5。當(dāng)然,在組織培養(yǎng)過程中由于培養(yǎng)體的代謝活躍改變培養(yǎng)基的pH,進而會影響到培養(yǎng)體的生長,Sharon M等13在培養(yǎng)D.snowfire原球莖的過程中發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)基的pH值在45 d后由5.1降至4.1,培養(yǎng)體變成褐色,但通過反復(fù)轉(zhuǎn)入新鮮培養(yǎng)基可防止或消除褐變現(xiàn)象。石斛組培過程中最常用的添加物是10%25%的椰乳(CW)。另據(jù)曾宋君7的研究,CW可用廉價的香蕉汁,馬鈴薯汁、蕃茄汁取代。蔗糖對胚萌發(fā)及成苗的效果不及白糖或片糖,在組培過程中加入活性炭是

11、必要的,它可以除去瓊脂中的毒性物質(zhì)或培養(yǎng)物產(chǎn)生的芳香族代謝廢物、防止組織褐變,并刺激胚胎的發(fā)生與生根。因石斛的胚性外植體即便在有生長素存在時也較難生根,因此如何使芽生根則是成苗的關(guān)鍵。1.2器官發(fā)生影響3種類型器官發(fā)生的因素包括外植體、培養(yǎng)基、激素等。1.2.1無菌短枝型又稱節(jié)培法或微型扦插法,即將待繁殖的材料如石斛莖節(jié)、花梗、枝等剪成帶一葉的單芽莖段,轉(zhuǎn)入成苗培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。MosichS E等14即是通過莖段培養(yǎng)獲得完整小植株的,其方法是將石斛的莖段(長度10 cm)按232切成3段,上段滅菌57 min,中段1015 min,下段2015 min,滅菌后切去兩端變色的組織,再橫切成段,

12、下端插入改良Knop培養(yǎng)基,4周后芽開始生長,隨后轉(zhuǎn)入MS培養(yǎng)基即獲得石斛再生苗。1.2.2芽增殖型即通過莖尖或初代培養(yǎng)的芽在適宜的培養(yǎng)基上誘導(dǎo),不斷發(fā)生腋芽進而形成叢芽, 隨后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基行生根培養(yǎng)從而獲得再生植株。Sobhana等15利用5種石斛D.moschatum,D.fimbriatum,D.nobile,D.crumenatum和D.pierardii腋芽分別以VW,KC,MS,Morel培養(yǎng)基進行離體培養(yǎng),各培養(yǎng)基均附加3 mgL-16-BA和1mgL-1NAA,誘導(dǎo)芽的增殖,結(jié)果以VW產(chǎn)生的芽培養(yǎng)體數(shù)目最多。此外,作者以VW培養(yǎng)基附加BA或KT(濃度分別為1,2,3,4,5,

13、6 mgL-1)添加或者不添加NAA(1 mgL-1)進行試驗,證實6-BA可以產(chǎn)生最大數(shù)量的叢生芽,5種石斛中又以D.moschatum數(shù)目最多,D.pierardii添不添加NAA結(jié)果相似。這說明培養(yǎng)基的種類、激素的濃度及種類對不同石斛芽的增殖有很大影響,如果以莖段作外植體,其取向至關(guān)重要。在Nayak Nr等16的研究中,D.phylum和D.moschatum莖節(jié)切段作水平放置可以獲得再生植株,而垂直放置的處理則無任何莖芽的發(fā)生。值得注意的是Nihar Ranjan首次將一種高細胞分裂素活性的物質(zhì)thidiazuron(TDZ)應(yīng)用于石斛的組織培養(yǎng)并與6-BA比較作用效果,結(jié)果后者比前

14、者更有效。其最佳作用濃度為2.24.5molL-1,提高TDZ的使用濃度會對莖芽的再生產(chǎn)生抑制作用。TDZ是1種雜環(huán)芳香脲,在大豆、小紅蘿卜的子葉、煙草、金甲豆等組培中廣范用于誘導(dǎo)芽的增殖,效果顯著17。在組織培養(yǎng)中若加入10.8molL-1的6-BA,誘導(dǎo)生根會比NAA更有效。其特點是繁殖速度快,是莖尖培養(yǎng)和脫毒菌初期必由之路,而石斛組培中的關(guān)鍵又在于促進生根。1.2.3不定芽發(fā)生型由愈傷組織直接形成不定芽,然后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中可誘導(dǎo)生根而形成完整的小植株。以石斛的基節(jié),幼嫩小葉、花梗等作外植體均可獲得較好的誘導(dǎo)效果。此外也有由“原球莖”形成愈傷組織的報道。葉秀鱗觀察到由D.candi-um

15、種子離體培養(yǎng)形成的原球莖,轉(zhuǎn)入N6培養(yǎng)基培養(yǎng)時,表面細胞發(fā)生不規(guī)則分裂,產(chǎn)生大量愈傷組織,隨后由愈傷組織分化形成不定芽再發(fā)育成幼苗。外植體的發(fā)育階段不同也會影響其發(fā)育方向的不同,以基尖為例,帶有葉原基的莖尖頂端形成芽、基部則形成愈傷組織,而不帶葉原基的莖尖只在基部形成愈傷組織,隨后分化出不定芽和擬原球莖。Madhuri Sharon等將原球莖一特定部位處作劃傷處理,未劃傷的作對照,結(jié)果發(fā)現(xiàn)劃傷的原球基形成大量愈傷組織而對照直接形成完整小植株。2問題與展望2.1人工種子制作在自然條件下僅鐵皮石斛能傳粉結(jié)果,結(jié)果率也僅有17.3%。雖然人工授粉可以大大提高大多數(shù)石斛種的結(jié)果率(72.1%100%)

16、18,但操作上費工又費時。制作人工種子則是一條可行的途徑,可以原球莖或擬原球莖等為材料外加包被物制得。郭順星19等已成功的以原球基為材料,3%海藻酸鈉和2%CaCl2為人工種皮制成鐵皮石斛人工種子,其在1/2MS+蔗糖的培養(yǎng)基上生長良好。但直接用于栽培的人工種子卻尚無研究。2.2 石斛組織培養(yǎng)次生代謝產(chǎn)物的研究組織培養(yǎng)過程中次生代謝產(chǎn)物的研究對石斛尤為重要,而這一研究在國內(nèi)甚為鮮見或甚至是空白。國外也較少,僅Nan G L等201997年報道在石斛PLBs的組織培養(yǎng)過程中有大量的松柏醇產(chǎn)生。同屬于藥用植物的人參、地黃等組織培養(yǎng)過程中次生代謝產(chǎn)物人參皂苷,毛地黃苷等已進入工業(yè)化生產(chǎn)試驗階段。鄭光

17、植等21從三分三的根、莖、葉,種皮甚至是花藥的愈傷組織培養(yǎng)產(chǎn)生莨菪堿及東莨菪堿,且5種愈傷組織中以莖愈傷組織的兩種生物堿產(chǎn)量最高,含量均超過了原植物根的提取物。石斛植物中含有多種生物堿、抗癌菲、類黃酮等物質(zhì),這些物質(zhì)是否在組織培養(yǎng)中產(chǎn)生,產(chǎn)量在哪一階段的培養(yǎng)中最高等,這些問題都有待于研究,以便從根本上解決石斛生長緩慢,栽培條件要求較嚴的問題,并有利于通過生物技術(shù)獲取這些藥用成分。2.3石斛組織培養(yǎng)技術(shù)與遺傳轉(zhuǎn)化利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得轉(zhuǎn)基因植物的關(guān)鍵是毒性基因的誘導(dǎo)表達,而在單子葉植物中常常缺少這種誘導(dǎo)物質(zhì)。近來的研究者Nan G L等20在石斛組織培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)PLBs發(fā)育早期有大量的松柏醇產(chǎn)生

18、,它可誘導(dǎo)毒性基因的表達。如果將在暗處培養(yǎng)的PLBs轉(zhuǎn)入光照條件下培養(yǎng),其含量呈6倍量增加。PLBs松柏醇的產(chǎn)量是葉的11倍,這使通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法可獲得轉(zhuǎn)基因植物,即將克隆的花色基因、主成分表達基因等通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入石斛PLBs成為可能。此外基因槍法獲得石斛轉(zhuǎn)基因植物業(yè)已實現(xiàn),Chia TF22等已成功的將熒光素酶基因(luc)通過W粒子微彈射擊導(dǎo)入PLBs,并在由PLBs培養(yǎng)成的小植株中表達。石斛蘭作為四大名蘭之一,其觀賞價值體現(xiàn)在花色艷麗、花期長。不同種、品種的石斛蘭其觀賞價值又有很大區(qū)別,通過遺傳轉(zhuǎn)化,將克隆的具有高觀賞價值的基因?qū)胧?一方面可以提高石斛價值,另一方面可以創(chuàng)造新品

19、種,豐富擴大石斛的種質(zhì)資源。在國內(nèi),石斛組織培養(yǎng)的研究相對其它植物來說起步較晚,與國外相比還有一定的距離,但無論是在國內(nèi)還是國外,石斛花藥培養(yǎng),原生質(zhì)體培養(yǎng)等尚未見報道?？上驳氖菄鴥?nèi)的組織培養(yǎng)技術(shù)已相當(dāng)成熟,這為石斛組織培養(yǎng)的研究提供了很好的技術(shù)保證。國內(nèi)有不少人研究石斛的組織培養(yǎng),此間重要的是解決組培苗的栽培問題,使石斛組織培養(yǎng)技術(shù)更好地為生產(chǎn)服務(wù)。參考文獻1 Vellupillai M,Swarup S,Chong Jingoh.Histological and ProteinChang During Early Stages of Seed Germination in the Orch

20、id,Dendrobium Erumenatum.Journal of Horticultural.Science,1997,726:941.2 李滿飛,徐國鈞.商品石斛的調(diào)查及鑒定().中草藥,1991,22(4):173.3 陳心啟,吉占和.中國蘭花全書.北京:中國林業(yè)出版社,1998.4徐云鵑,于力文.霍山石斛種子試管苗的培養(yǎng).植物生理學(xué)通訊,1984,4:35.5 Lam Chan L T,Lee Sm.Inflorescence Culture of Some TropicalOrchid Varidties Singapore.Journal of Primary Industri

21、es.1996,24:35.6 葉秀嶙,程式君,王伏雄.黑節(jié)草未成熟種子的形態(tài)發(fā)育及其在離體培養(yǎng)時的表現(xiàn).云南植物研究,1988,10(30):285.7 曾宋君,程式君,張京麗.五種石斛蘭的胚培養(yǎng)及其快速繁殖研究.園藝學(xué)報,1988,25(1):75.8Devi J,Borthakur B,Deka P C.Clonal Propagation of DenelrobiumMoschatum and Cymbidium Aloifolium Through Shoot-tip CultureJournal of the Orchid Society of India,1997,11(12):

22、19.9 Kumaria S,Tandon P.Asymbiotic Germination ofDendrobiumFimbratum var.oculatumHK.f.Seeds on Different Media.Pro-ceeding of the Indian National.Science Academy,1991,57(34):277.10Zhou H W,Li S J,Qian X H,et al.Effects of Some Factors onPlantlet Growth of Dendrobium in Tissue Culture.Journal of Zhe-

23、jiang Agriculture University,1995,21(16):622.11周日坤,王伏雄.兜辱石斛幼葉再生植株的研究.植物學(xué)集刊,1989,12(4):123.12王光遠,蔡海南,劉培,等.石斛離體培養(yǎng)中ABA對誘導(dǎo)花芽形成的影響.植物學(xué)報,1995,37(5):374.13Sharon M,Bagde B,Bapgle P.Regenerate Protential of WoundInflicted Dendrobiam Snowfire Protocrms.Journal of the OrchidSociety of India,1992,6(12):55.14Mo

24、sich S E,Ball E A,Arditti J.Clonal Propagation of Dendrobi-um by Means of Nodal Cuttings.A morchiol Soc Bull,1974,43:1055.15Sobhana A,Rajeevan P K.In Vitro Imltiple Shool Production inDendrobium as Influenced by Cytokinin.Journal of DrnamentalHorticulture,1993,(2):1.16Nayak N R,Rath S P,Satyanarayan P.In Vitro Progation