活體生物發(fā)光成像技術(shù)PPT優(yōu)秀課件

1、活體生物發(fā)光成像技術(shù)活體生物發(fā)光成像技術(shù) 武武 燁燁 2011.06. 16 A549-luc小鼠肺癌移植瘤模小鼠肺癌移植瘤模 型型 1 活體生物發(fā)光成像技術(shù)活體生物發(fā)光成像技術(shù) (Optical in vivo Imaging) 生物發(fā)光生物發(fā)光(bioluminescence)與熒光與熒光(fluorescence); 熒光素酶熒光素酶(Luciferase)基因標(biāo)記細(xì)胞或基因標(biāo)記細(xì)胞或DNA; 熒光報(bào)告集團(tuán)熒光報(bào)告集團(tuán)(GFP, RFP, Cyt及及dyes等等)進(jìn)行標(biāo)記。進(jìn)行標(biāo)記。 熒光照相機(jī)熒光照相機(jī)(charge coupled device camera, CCD camera)

2、及其分析軟件和作為報(bào)告子的熒光素酶及其分析軟件和作為報(bào)告子的熒光素酶 (lsuciferae)和熒光素和熒光素(luciferin)組成。組成。 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 無創(chuàng)性；無創(chuàng)性； 可多次重復(fù)在不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)；可多次重復(fù)在不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)； 快速掃描成像；快速掃描成像； 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物整體成像。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物整體成像。 2 技術(shù)原理技術(shù)原理 標(biāo)記原理標(biāo)記原理 氧化反應(yīng)：氧化反應(yīng)：Fluc基因整合到細(xì)胞染色體基因整合到細(xì)胞染色體DNA上以表達(dá)上以表達(dá) 熒光素酶，當(dāng)熒光素酶，當(dāng) 外源（腹腔或靜脈注射）給予其底物熒外源（腹腔或靜脈注射）給予其底物熒 光素光素(luciferin)，即可在幾分鐘內(nèi)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象。，即可在

3、幾分鐘內(nèi)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象。 反應(yīng)條件：反應(yīng)條件：ATP, O2。 。 光的強(qiáng)度與標(biāo)記細(xì)胞的數(shù)目線性相關(guān)。光的強(qiáng)度與標(biāo)記細(xì)胞的數(shù)目線性相關(guān)。 分子生物學(xué)克隆技術(shù)：基因插入分子生物學(xué)克隆技術(shù)：基因插入單克隆細(xì)胞篩單克隆細(xì)胞篩 選選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。 光學(xué)原理光學(xué)原理 檢測(cè)波長(zhǎng)范圍：檢測(cè)波長(zhǎng)范圍：400-950 nm熒光熒光 最少可檢測(cè)到皮下最少可檢測(cè)到皮下500個(gè)細(xì)胞個(gè)細(xì)胞 相同深度檢測(cè)到發(fā)光強(qiáng)度和細(xì)胞的數(shù)量有較好的線性相同深度檢測(cè)到發(fā)光強(qiáng)度和細(xì)胞的數(shù)量有較好的線性 關(guān)系關(guān)系 3 實(shí)驗(yàn)過程實(shí)驗(yàn)過程 構(gòu)建單克隆細(xì)胞株構(gòu)建單克隆細(xì)胞株A549-luc Pgl4.17luc2/neo質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人

4、非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株 A549 篩選抗性細(xì)胞及單克隆化篩選抗性細(xì)胞及單克隆化 獲得穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的獲得穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的A549-luc細(xì)胞細(xì)胞 建立移植瘤模型建立移植瘤模型 (A549/A549-luc) 裸鼠皮下移植瘤模型：裸鼠皮下移植瘤模型：nude mice, 6-7 w, 202 g, female; 5106 /200 l PBS; n=3; 150 l /只只 (30 mg/ml), i.p., 10-25 min 后活體成像后活體成像;QWK, 4 w。 SCID鼠尾靜脈移植瘤模型：鼠尾靜脈移植瘤模型：SCID mice, 6-7 w, 202 g,

5、 female.; 5106 /200 lPBS; n=3; 150 l /只只(30 mg/ml), i.p., 10-25 min 后活體成后活體成 像像;Q3D, 4 w。 原位成瘤及轉(zhuǎn)移觀察：原位成瘤及轉(zhuǎn)移觀察：S.C. mice will be euthanized and collected tumor on D26; i.v. mice will be euthanized and collected lung, brain, heart, liver and ovaries on D30. HE staining. 4 實(shí)驗(yàn)過程實(shí)驗(yàn)過程 結(jié)果結(jié)果1：裸鼠皮下移植瘤模型的建立：裸鼠皮下移植瘤模型的建立 5 實(shí)驗(yàn)過程實(shí)驗(yàn)過程 結(jié)果結(jié)果2：SCID鼠靜脈移植瘤模型的建立鼠靜脈移植瘤模型的建立 6 實(shí)驗(yàn)過程實(shí)驗(yàn)過程 結(jié)果結(jié)果3： A549及及A549-luc細(xì)胞原位成瘤細(xì)胞原位成瘤 及轉(zhuǎn)移能力的病理形態(tài)學(xué)觀察及轉(zhuǎn)移能力的病理形態(tài)學(xué)觀察 皮下瘤皮下瘤HE(20) 7 實(shí)驗(yàn)過程實(shí)驗(yàn)過程 結(jié)果結(jié)果3： A549及及A54