沉淀與離心部分PPT課件

1、沉淀與離心部分 第三節(jié)第三節(jié) 酶的分離方法酶的分離方法 一、沉淀分離 二、離心分離 三、過濾與膜分離 四、層析分離 五、電泳分離 六、萃取分離 沉淀與離心部分 沉淀分離：通過改變某些條件或添加某種物質(zhì)，使酶的沉淀分離：通過改變某些條件或添加某種物質(zhì)，使酶的溶解溶解 度降低度降低，而從溶液中沉淀析出，與其它溶質(zhì)分離的技術(shù)過，而從溶液中沉淀析出，與其它溶質(zhì)分離的技術(shù)過 程。程。 原理：根據(jù)不同物質(zhì)在溶劑中的原理：根據(jù)不同物質(zhì)在溶劑中的溶解度不同溶解度不同而達到分離的目而達到分離的目 的。的。 不同溶解度的產(chǎn)生是由于溶質(zhì)分子之間及溶質(zhì)與溶劑分子之不同溶解度的產(chǎn)生是由于溶質(zhì)分子之間及溶質(zhì)與溶劑分子之

2、間間親和力的差異親和力的差異而引起的，溶解度的大小與溶質(zhì)和溶劑的而引起的，溶解度的大小與溶質(zhì)和溶劑的 化學(xué)性質(zhì)及結(jié)構(gòu)化學(xué)性質(zhì)及結(jié)構(gòu)有關(guān)。有關(guān)。 一、沉淀分離一、沉淀分離 沉淀與離心部分 沉淀分離方法沉淀分離方法適用分子適用分子 鹽析沉淀法鹽析沉淀法多用于各種蛋白質(zhì)和酶的分離純化多用于各種蛋白質(zhì)和酶的分離純化 等電點沉淀法等電點沉淀法用于氨基酸、蛋白質(zhì)及其他兩性物質(zhì)的沉淀，單用于氨基酸、蛋白質(zhì)及其他兩性物質(zhì)的沉淀，單 獨應(yīng)用較少，常與其它方法結(jié)合使用獨應(yīng)用較少，常與其它方法結(jié)合使用 有機溶劑沉淀法有機溶劑沉淀法 多用于蛋白質(zhì)和酶、多糖、核酸以及生物小分子多用于蛋白質(zhì)和酶、多糖、核酸以及生物小分子

3、 的分離純化的分離純化 復(fù)合沉淀法復(fù)合沉淀法發(fā)展較快的新方法發(fā)展較快的新方法 選擇性變性沉淀選擇性變性沉淀 法法 多用于除去某些不耐熱的和在一定多用于除去某些不耐熱的和在一定pHpH值下易變性值下易變性 的雜蛋白的雜蛋白 常用的幾種沉淀分離方法常用的幾種沉淀分離方法 沉淀與離心部分 1、鹽析沉淀法、鹽析沉淀法 在鹽濃度達到某一界限后，酶的溶解度隨鹽濃度升在鹽濃度達到某一界限后，酶的溶解度隨鹽濃度升 高而降低，這稱為高而降低，這稱為鹽析現(xiàn)象鹽析現(xiàn)象。 優(yōu)點：優(yōu)點： 成本低，不需要特別昂貴的設(shè)備成本低，不需要特別昂貴的設(shè)備 操作簡單、安全操作簡單、安全 對許多生物活性物質(zhì)具有穩(wěn)定作用對許多生物活性

4、物質(zhì)具有穩(wěn)定作用 沉淀與離心部分 （1）基本原理）基本原理 沉淀與離心部分 在蛋白質(zhì)的鹽析中，通常采用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、在蛋白質(zhì)的鹽析中，通常采用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、 硫酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉和磷酸鈉等。其中硫酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉和磷酸鈉等。其中以硫酸銨最為常用以硫酸銨最為常用。 （2）中性鹽的選擇）中性鹽的選擇 溶解度大溶解度大：硫酸銨在：硫酸銨在0時仍時仍 有有70.6%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的溶（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的溶 解度，遠遠高于其它鹽類。解度，遠遠高于其它鹽類。 鹽類鹽類0 20 80 100 硫酸銨硫酸銨70.675.495.3103 硫酸鈉硫酸鈉4.918.943.342.2 硫酸二

5、氫鈉硫酸二氫鈉1.67.893.8101 幾種鹽在不同溫度下的溶解度（幾種鹽在不同溫度下的溶解度（g/100ml水）水） 沉淀與離心部分 分離效果好分離效果好：有的提取液加入適量硫酸銨鹽析，一步就可能：有的提取液加入適量硫酸銨鹽析，一步就可能 除去除去75%的雜蛋白，純度提高了的雜蛋白，純度提高了4倍。倍。 不易引起變性，有穩(wěn)定酶的作用不易引起變性，有穩(wěn)定酶的作用：有些酶用：有些酶用2-3mol/L的硫酸的硫酸 銨保存可達數(shù)年之久。銨保存可達數(shù)年之久。 價格便宜，廢液不污染環(huán)境價格便宜，廢液不污染環(huán)境 沉淀與離心部分 （3）鹽析的操作方法）鹽析的操作方法 最常用的是固體硫酸銨加入法。最常用的是

6、固體硫酸銨加入法。 研磨硫酸銨成細(xì)粉研磨硫酸銨成細(xì)粉 邊攪拌邊緩慢均勻少量多次加入邊攪拌邊緩慢均勻少量多次加入 冰浴冰浴 離心離心過濾過濾 加鹽速度盡量慢，加鹽速度盡量慢， 避免局部硫酸銨避免局部硫酸銨 濃度過大而造成濃度過大而造成 蛋白質(zhì)變性蛋白質(zhì)變性 低濃度低濃度高濃度高濃度 沉淀與離心部分 （4）鹽析的影響因素）鹽析的影響因素 蛋白質(zhì)濃度蛋白質(zhì)濃度：2.5%-3.0%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）較適中，（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）較適中， 相當(dāng)于相當(dāng)于25-30 mg/ml pH值值：常選在該酶的等電點附近：常選在該酶的等電點附近 溫度溫度：對溫度敏感的酶，要求在：對溫度敏感的酶，要求在0-4下操作，以下操作，以 避免

7、活力喪失避免活力喪失 鹽析時注意事項：鹽析時注意事項： 酶不同，結(jié)構(gòu)不同，所需鹽濃度不同。另外，酶的來源，雜酶不同，結(jié)構(gòu)不同，所需鹽濃度不同。另外，酶的來源，雜 質(zhì)等也對其有影響。質(zhì)等也對其有影響。 鹽析后的酶含大量鹽分，要進行脫鹽處理鹽析后的酶含大量鹽分，要進行脫鹽處理 沉淀與離心部分 2、有機溶劑沉淀法、有機溶劑沉淀法 原理：降低水溶液的介電常數(shù)，減小溶劑的極性，從而削原理：降低水溶液的介電常數(shù)，減小溶劑的極性，從而削 弱了溶劑分子與蛋白質(zhì)分子間的相互作用力，導(dǎo)致蛋白質(zhì)弱了溶劑分子與蛋白質(zhì)分子間的相互作用力，導(dǎo)致蛋白質(zhì) 溶解度降低而沉淀。溶解度降低而沉淀。 優(yōu)點：優(yōu)點： 分辯能力比鹽析高分

8、辯能力比鹽析高 沉淀不用脫鹽沉淀不用脫鹽 缺點：缺點： 對某些具有生物活性的大分子容易引起變性失活，操作需在低溫對某些具有生物活性的大分子容易引起變性失活，操作需在低溫 下進行。下進行。 沉淀與離心部分 （1）有機溶劑的選擇和濃度計算）有機溶劑的選擇和濃度計算 原則：能與水互溶原則：能與水互溶 常用試劑：乙醇、甲醇和丙酮（糖、核酸常用試劑：乙醇、甲醇和丙酮（糖、核酸 等常用的是乙醇）等常用的是乙醇） 計算公式：計算公式： V=V0(S2-S1)/(100-S2) 需要加需要加 入量入量 原溶液原溶液 體積體積 原溶液中原溶液中 有機溶劑有機溶劑 的體積的體積 有機溶劑終有機溶劑終 體積體積 加

9、入有機溶劑的體積分?jǐn)?shù)加入有機溶劑的體積分?jǐn)?shù) （純?nèi)芤后w積分?jǐn)?shù)為（純?nèi)芤后w積分?jǐn)?shù)為100%） 沉淀與離心部分 （2）有機溶劑沉淀的影響因素）有機溶劑沉淀的影響因素 溫度：多數(shù)蛋白質(zhì)在有機溶劑與水的混合液中，溫度：多數(shù)蛋白質(zhì)在有機溶劑與水的混合液中， 溶解度隨溫度降低而下降。溶解度隨溫度降低而下降。 注意！大多數(shù)酶在有機溶劑中對溫度特別敏感，溫度注意！大多數(shù)酶在有機溶劑中對溫度特別敏感，溫度 稍高就會引起變性！稍高就會引起變性！ 樣品濃度：通常使用樣品濃度：通常使用5-20mg/ml的蛋白質(zhì)初濃度的蛋白質(zhì)初濃度 為宜，可以得到較好的分離效果。為宜，可以得到較好的分離效果。 pH值：選在等電點附件，

10、提高分辯能力值：選在等電點附件，提高分辯能力 離子強度：不超過離子強度：不超過5%為宜。乙醇溶液不超過原溶為宜。乙醇溶液不超過原溶 液液2倍體積為宜。倍體積為宜。 沉淀與離心部分 離心：借助離心機旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使不同離心：借助離心機旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使不同分分 子大小、密度子大小、密度的物質(zhì)分離的技術(shù)。的物質(zhì)分離的技術(shù)。 二、離心分離二、離心分離 1、基本原理、基本原理 F=m2r 當(dāng)物體圍繞一中心軸做圓周運動時，運動物體就受當(dāng)物體圍繞一中心軸做圓周運動時，運動物體就受 到離心力的作用。旋轉(zhuǎn)速度越高，運動物體所受到的離到離心力的作用。旋轉(zhuǎn)速度越高，運動物體所受到的離 心力越大。心力越大

11、。 沉淀與離心部分 2、相對離心力、相對離心力 RCF RCF 就是實際離心力轉(zhuǎn)化為重力加速度的倍數(shù)就是實際離心力轉(zhuǎn)化為重力加速度的倍數(shù) RCF=FRCF=F離心力離心力/F/F重力重力=m=m2 2r/mg=r/mg=2 2r/g r/g g g為重力加速度（為重力加速度（980.7cm/sec980.7cm/sec2 2) ) RCF= 1.119 RCF= 1.1191010-5 -5 (r/min)(r/min)2 2 r r 沉淀與離心部分 3、離心機的主要構(gòu)造和類型、離心機的主要構(gòu)造和類型 （1）制備性離心機分為三類：）制備性離心機分為三類： A、普通離心機、普通離心機 最大轉(zhuǎn)速最

12、大轉(zhuǎn)速6000r/min左右，最大相對離心力近左右，最大相對離心力近 6000g，容量為幾十毫升至幾升，分離形式是，容量為幾十毫升至幾升，分離形式是 固液沉降分離，其轉(zhuǎn)速不能嚴(yán)格控制，通常不帶固液沉降分離，其轉(zhuǎn)速不能嚴(yán)格控制，通常不帶 冷凍系統(tǒng)，于室溫下操作，用于收集易沉降的大冷凍系統(tǒng)，于室溫下操作，用于收集易沉降的大 顆粒物質(zhì)。顆粒物質(zhì)。Eg：紅細(xì)胞、酵母細(xì)胞等。：紅細(xì)胞、酵母細(xì)胞等。 沉淀與離心部分 沉淀與離心部分 B、高速冷凍離心機、高速冷凍離心機 最大轉(zhuǎn)速為最大轉(zhuǎn)速為20000-25000r/min，最大相對離心力為，最大相對離心力為 89000g，最大容量可通到，最大容量可通到3L，

13、分離形式，分離形式 也是固液沉降分離。也是固液沉降分離。 一般有制冷系統(tǒng)，離心室溫一般有制冷系統(tǒng)，離心室溫 度可調(diào)節(jié)和維持在度可調(diào)節(jié)和維持在0-4，轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn) 速、溫度和時間都可嚴(yán)格控速、溫度和時間都可嚴(yán)格控 制。制。 沉淀與離心部分 C、超速離心機、超速離心機 轉(zhuǎn)速可達轉(zhuǎn)速可達50000- 80000r/min， 相對離心力最大可達相對離心力最大可達 510000g 沉淀與離心部分 名稱名稱最大轉(zhuǎn)速最大轉(zhuǎn)速 （r/min） 相對離心力相對離心力 （RCF） 特點特點 常速離心機常速離心機6000 6000 g主要用于細(xì)胞、細(xì)胞碎片主要用于細(xì)胞、細(xì)胞碎片 和培養(yǎng)基殘渣等固形物的和培養(yǎng)基殘渣等固形物

14、的 分離。也用于酶的結(jié)晶等分離。也用于酶的結(jié)晶等 較大顆粒的分離較大顆粒的分離。 高速離心機高速離心機（12.5） 104 11041105 g 主要用于沉淀、細(xì)胞碎片主要用于沉淀、細(xì)胞碎片 和細(xì)胞器等的分離。和細(xì)胞器等的分離。 超速離心機超速離心機(2.5 12)104 5105 g主要用于主要用于DNA、RNA、 蛋白質(zhì)等生物大分子以及蛋白質(zhì)等生物大分子以及 細(xì)胞器、病毒等的分離純細(xì)胞器、病毒等的分離純 化；樣品純度的檢測；沉化；樣品純度的檢測；沉 降系數(shù)和相對分子質(zhì)量的降系數(shù)和相對分子質(zhì)量的 測定等。測定等。 沉淀與離心部分 （2）轉(zhuǎn)子）轉(zhuǎn)子 轉(zhuǎn)子類型轉(zhuǎn)子類型 固定角式轉(zhuǎn)子固定角式轉(zhuǎn)子(

15、fixed-angle rotor)(fixed-angle rotor) 水平轉(zhuǎn)子水平轉(zhuǎn)子(swing-out rotor)(swing-out rotor) 垂直轉(zhuǎn)子垂直轉(zhuǎn)子(vertical rotor)(vertical rotor) 帶狀轉(zhuǎn)子帶狀轉(zhuǎn)子(zonal rotor)(zonal rotor) 連續(xù)轉(zhuǎn)子連續(xù)轉(zhuǎn)子(continuous rotor)(continuous rotor) 轉(zhuǎn)子的材質(zhì)轉(zhuǎn)子的材質(zhì) 鋁質(zhì)：較輕鋁質(zhì)：較輕, ,耐受強度較弱耐受強度較弱, ,適合在較低的轉(zhuǎn)速下使用適合在較低的轉(zhuǎn)速下使用; ; 不銹鋼：耐受強度最好不銹鋼：耐受強度最好, ,但材質(zhì)本身太重；但材

16、質(zhì)本身太重； 鈦合金：耐受強度不錯鈦合金：耐受強度不錯, ,重量也比不銹鋼輕。重量也比不銹鋼輕。 沉淀與離心部分 A A、固定角式轉(zhuǎn)子、固定角式轉(zhuǎn)子 離心管在離心機中放置的位置與旋轉(zhuǎn)軸心形離心管在離心機中放置的位置與旋轉(zhuǎn)軸心形 成一個固定的角度成一個固定的角度, ,角度變化在角度變化在14-4014-40之間。之間。 常見的角度常見的角度 2020 28 28 34 34 40 40 沉淀與離心部分 角式轉(zhuǎn)子的特點角式轉(zhuǎn)子的特點 重心低重心低, ,轉(zhuǎn)速可較高轉(zhuǎn)速可較高 樣品粒子穿過溶劑層的距離略大于離心管的直徑樣品粒子穿過溶劑層的距離略大于離心管的直徑 “管壁效應(yīng)管壁效應(yīng)” ：有一定的角度：有

17、一定的角度, , 在離心過程中撞到離在離心過程中撞到離 心管外壁的粒子沿著管壁滑到管底形成沉淀心管外壁的粒子沿著管壁滑到管底形成沉淀, , 此效應(yīng)此效應(yīng) 使最后在管底聚成的沉淀較緊密。使最后在管底聚成的沉淀較緊密。 沉淀與離心部分 在離心管的不同部位距旋在離心管的不同部位距旋 轉(zhuǎn)中心軸的距離也不同轉(zhuǎn)中心軸的距離也不同,那那 么在一定的轉(zhuǎn)速下其么在一定的轉(zhuǎn)速下其RCF 值也各不相同值也各不相同 沉淀與離心部分 B B、水平轉(zhuǎn)子、水平轉(zhuǎn)子 （1 1）轉(zhuǎn)子靜止時）轉(zhuǎn)子靜止時, ,處在轉(zhuǎn)子中的離心管中處在轉(zhuǎn)子中的離心管中 心線與旋轉(zhuǎn)軸平行心線與旋轉(zhuǎn)軸平行, , （2 2）轉(zhuǎn)子旋轉(zhuǎn)加速時）轉(zhuǎn)子旋轉(zhuǎn)加速時

18、, ,離心管中心線由離心管中心線由 行位置逐漸過渡到垂直位置行位置逐漸過渡到垂直位置, ,即與旋即與旋 轉(zhuǎn)軸成轉(zhuǎn)軸成9090角角, , （3 3）粒子的沉淀方向同旋轉(zhuǎn)半徑方向基本）粒子的沉淀方向同旋轉(zhuǎn)半徑方向基本 一致有少量的一致有少量的“管壁效應(yīng)管壁效應(yīng)” ” 沉淀與離心部分 沉淀與離心部分 沉淀與離心部分 水平轉(zhuǎn)子的特點水平轉(zhuǎn)子的特點 轉(zhuǎn)子的重心位置較高轉(zhuǎn)子的重心位置較高 樣品粒子沉降穿過溶劑層的距離大于直徑樣品粒子沉降穿過溶劑層的距離大于直徑 對于多種成分樣品分離特別有效對于多種成分樣品分離特別有效 常用于速率區(qū)帶離心和等密度離心常用于速率區(qū)帶離心和等密度離心 沉淀與離心部分 3、離心方

19、法、離心方法 （1）差速沉降離心法）差速沉降離心法 分離兩種以上大小，密度不同的顆粒。分離兩種以上大小，密度不同的顆粒。 操作方法：操作方法： 分離較大顆粒分離較大顆粒 分離較小顆分離較小顆 粒粒 適用范圍：大小、密度相差較大的顆粒適用范圍：大小、密度相差較大的顆粒 優(yōu)點：操作簡單、方便優(yōu)點：操作簡單、方便 缺點：分離效果差，沉淀中有雜質(zhì)，沉淀后顆粒在缺點：分離效果差，沉淀中有雜質(zhì)，沉淀后顆粒在 底部易受擠壓底部易受擠壓 上清加大轉(zhuǎn)速和分離時間上清加大轉(zhuǎn)速和分離時間 沉淀與離心部分 例用差速離心法分離已破碎的細(xì)胞各組份例用差速離心法分離已破碎的細(xì)胞各組份 已破碎的細(xì)胞已破碎的細(xì)胞 500g,10500g,10分鐘分鐘 沉淀沉淀 上清液上清液 ( (細(xì)胞核）細(xì)胞核） 10,000g,1010,000g,10分鐘分鐘 沉淀沉淀 上清液上清液 ( (細(xì)胞膜碎片細(xì)胞膜碎片, ,線粒體線粒體,) 100,000g,3,) 100,000g,3小小 時時 溶酶體溶酶體 沉淀沉淀 上清液上清液 ( (核糖核蛋白體）核糖核蛋白體） ( (可溶性成份可溶性成份) ) 沉淀與離心部分 （2）差速區(qū)帶離心法（密度梯度離心）差速區(qū)帶離心