分子生物學(xué)課件：第三章 蛋白質(zhì)相互作用

1、第三章第三章 蛋白質(zhì)相互作用蛋白質(zhì)相互作用 n蛋白質(zhì)相互作用（蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）是指兩個或兩個以）是指兩個或兩個以 上的蛋白質(zhì)分子通過上的蛋白質(zhì)分子通過非共價鍵非共價鍵形成蛋白形成蛋白 質(zhì)復(fù)合體（質(zhì)復(fù)合體（ protein complex）的過程）的過程 n分子機器分子機器 n蛋白質(zhì)復(fù)合體是生命分子機器的核心結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)復(fù)合體是生命分子機器的核心結(jié)構(gòu) n蛋白質(zhì)復(fù)合體的形式蛋白質(zhì)復(fù)合體的形式 二聚體dimer 三聚體trimer 寡聚體oligomer 多聚體polymer 同聚體homopolymer 異聚體heteropolymer

2、 n復(fù)合體的形狀復(fù)合體的形狀 n復(fù)合體的穩(wěn)定性復(fù)合體的穩(wěn)定性 n細(xì)胞內(nèi)環(huán)境有利用蛋白質(zhì)復(fù)合體的形成 n體外PPI研究難以模擬細(xì)胞內(nèi)環(huán)境 蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)（interactome） PPI的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ) PPI 界面依靠非共價鍵維系 n氫鍵氫鍵 n范德華力范德華力 n疏水力疏水力 n離子鍵離子鍵 n共價鍵共價鍵 nPPI 界面大小影響穩(wěn)定性 蛋白質(zhì)相互作用結(jié)構(gòu)域 n結(jié)構(gòu)域是蛋白質(zhì)中折疊較為緊密且具有是蛋白質(zhì)中折疊較為緊密且具有 一定功能的球狀和纖維狀的結(jié)構(gòu)，以模一定功能的球狀和纖維狀的結(jié)構(gòu)，以模 塊方式具有多種不同功能的分子。塊方式具有多種不同功能的分子。 n蛋白質(zhì)相互作用結(jié)構(gòu)域?qū)Ｖ改切┛梢宰R專指那些可以

3、識 別其他蛋白質(zhì)的特殊結(jié)構(gòu)，從而介導(dǎo)兩別其他蛋白質(zhì)的特殊結(jié)構(gòu)，從而介導(dǎo)兩 個蛋白之間發(fā)生相互作用的結(jié)構(gòu)域，一個蛋白之間發(fā)生相互作用的結(jié)構(gòu)域，一 般由般由50-100個氨基酸組成。個氨基酸組成。 n結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域相互作用結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域相互作用 n結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域-肽段模體相互作用肽段模體相互作用 SH2結(jié)構(gòu)域 n約100個氨基酸序列，識別磷酸化的酪氨 酸及相鄰的3-6個氨基酸殘基。 SH3結(jié)構(gòu)域 n由50個氨基酸殘基組成，存在于各種蛋 白激酶和銜接蛋白中，識別富含脯氨酸 的序列R/KXXPXXP或PXXPXR/K，其親和力 與脯氨酸殘基及相鄰氨基酸殘基組成相 關(guān)。 PH結(jié)構(gòu)域 n100-120個氨基酸殘

4、基組成，存在于多種 細(xì)胞骨架蛋白，蛋白激酶、PLC超家族中。 n兼具結(jié)合脂類和蛋白質(zhì)的能力，參與細(xì) 胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。 WW結(jié)構(gòu)域 n30-40個氨基酸殘基組成的三股反平行 片層結(jié)構(gòu)域，含兩個高度保守的色氨酸 WW而得名，識別富含脯氨酸的序列XPPXY， 參與非受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和蛋白 質(zhì)降解等過程。 PDZ結(jié)構(gòu)域 n由80-100個氨基酸殘基組成，包含2個 -螺旋和6個-折疊，常以串聯(lián)重復(fù)拷 貝存在，是構(gòu)成支架蛋白的重要結(jié)構(gòu)， 在細(xì)胞膜蛋白質(zhì)的聚集中發(fā)揮重要作用。 蛋白質(zhì)相互作用結(jié)構(gòu)域識別蛋白 質(zhì)的翻譯后修飾 nSH2結(jié)構(gòu)域識別含磷酸化酪氨酸模體結(jié)構(gòu)域識別含磷酸化酪氨酸模體 nFHA結(jié)構(gòu)域和結(jié)

5、構(gòu)域和MH2結(jié)構(gòu)域識別含磷酸化結(jié)構(gòu)域識別含磷酸化 絲氨酸絲氨酸/蘇氨酸模體蘇氨酸模體 nBromo結(jié)構(gòu)域識別組蛋白中的乙?；嚱Y(jié)構(gòu)域識別組蛋白中的乙?；?氨酸氨酸 nChromo結(jié)構(gòu)域識別組蛋白中的甲基化結(jié)構(gòu)域識別組蛋白中的甲基化 賴氨酸賴氨酸 銜接蛋白和支架蛋白是蛋白質(zhì)復(fù)合體銜接蛋白和支架蛋白是蛋白質(zhì)復(fù)合體 的接頭和骨架的接頭和骨架 nAdaptor protein nGRB2(growth factor receptor-binding protein2) SH3-SH2-SH3 nNCK(noncatalytic region of tyrosine kinase) SH3-SH3-S

6、H3-SH2 nScaffold protein nJIP-1(JNK-interacting protein1) PPI 研究的醫(yī)學(xué)意義 nPPIPPI異?？蓪?dǎo)致細(xì)胞活動失控異?？蓪?dǎo)致細(xì)胞活動失控 n相互作用能力的喪失可喪失原有的正常調(diào)節(jié)。相互作用能力的喪失可喪失原有的正常調(diào)節(jié)。 n突變也可產(chǎn)生新的相互作用。突變也可產(chǎn)生新的相互作用。 n抑制抑制PPIPPI n設(shè)計小分子和多肽抑制劑，特異性結(jié)合于設(shè)計小分子和多肽抑制劑，特異性結(jié)合于PPIPPI的界面，的界面， 阻斷阻斷PPIPPI。馬拉維諾馬拉維諾 赫賽汀赫賽汀 n增強增強PPI PPI P53 MDM2P53 MDM2 PPI 研究策略

7、n蛋白質(zhì)復(fù)合物空間結(jié)構(gòu)的精細(xì)解析蛋白質(zhì)復(fù)合物空間結(jié)構(gòu)的精細(xì)解析 n X射線晶體衍射射線晶體衍射 n核磁共振波譜核磁共振波譜 n三維電鏡重構(gòu)技術(shù)三維電鏡重構(gòu)技術(shù) nPPI的高通量研究的高通量研究 n酵母雙雜交酵母雙雜交 n親和純化聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)親和純化聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù) 蛋白質(zhì)相互作用的類型蛋白質(zhì)相互作用的類型 n蛋白質(zhì)相互作用的類型：蛋白質(zhì)相互作用的類型：牢固型牢固型互作和互作和暫時型暫時型互作兩互作兩 種?；プ髁瓤梢詮姡部梢匀?。種?；プ髁瓤梢詮?，也可以弱。 n牢固型互作：以多亞基蛋白復(fù)合體常見，可以通過牢固型互作：以多亞基蛋白復(fù)合體常見，可以通過免免 疫共沉淀、疫共沉淀、Pull-down法法

8、研究。研究。 n暫時型互作：涉及到胞內(nèi)大部分生物過程，包括蛋白暫時型互作：涉及到胞內(nèi)大部分生物過程，包括蛋白 折疊、修飾、轉(zhuǎn)運、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞周期等。折疊、修飾、轉(zhuǎn)運、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞周期等。 研究技術(shù)研究技術(shù) n酵母雙雜交篩選系統(tǒng)酵母雙雜交篩選系統(tǒng) n蛋白質(zhì)親和色譜蛋白質(zhì)親和色譜 nPull-down Pull-down 技術(shù)技術(shù) n免疫共沉淀免疫共沉淀 n細(xì)胞免疫熒光染色細(xì)胞免疫熒光染色 n熒光共振能量轉(zhuǎn)移（熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRETFRET） n表面等離子共振表面等離子共振 ( (一一) ) 酵母雙雜交技術(shù)酵母雙雜交技術(shù) n一種基因篩選策略：蛋白質(zhì)之間微弱的、瞬間的一種基因篩選策略：蛋白質(zhì)

9、之間微弱的、瞬間的 作用也能夠通過報告基因的表達(dá)產(chǎn)物敏感地檢測作用也能夠通過報告基因的表達(dá)產(chǎn)物敏感地檢測 得到得到 。 n酵母雙雜交系統(tǒng)利用雜交基因通過激活酵母雙雜交系統(tǒng)利用雜交基因通過激活報告基因報告基因 的表達(dá)探測蛋白蛋白的相互作用。的表達(dá)探測蛋白蛋白的相互作用。 n用于活細(xì)胞體內(nèi)的蛋白質(zhì)之間的相互作用研究。用于活細(xì)胞體內(nèi)的蛋白質(zhì)之間的相互作用研究。 n簡便、快速地分離到新的互作蛋白。簡便、快速地分離到新的互作蛋白。 原原 理理 n原理基于真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特殊性，這些轉(zhuǎn)原理基于真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特殊性，這些轉(zhuǎn) 錄因子通常需要兩個或以上相互獨立的結(jié)構(gòu)域組成。錄因子通常需要兩個或以上

10、相互獨立的結(jié)構(gòu)域組成。 分別使結(jié)合域和激活域同分別使結(jié)合域和激活域同誘餌蛋白誘餌蛋白和和獵物蛋白獵物蛋白形成形成 融合蛋白，在酵母細(xì)胞中表達(dá)，如果兩種蛋白可以融合蛋白，在酵母細(xì)胞中表達(dá)，如果兩種蛋白可以 發(fā)生相互作用，則可使結(jié)合域和激活域在空間上充發(fā)生相互作用，則可使結(jié)合域和激活域在空間上充 分接近，從而激活報告基因。分接近，從而激活報告基因。 n酵母的轉(zhuǎn)錄因子酵母的轉(zhuǎn)錄因子GAL4 GAL4由功能上由功能上相互獨立的結(jié)相互獨立的結(jié) 構(gòu)域構(gòu)域構(gòu)成，構(gòu)成，DNA結(jié)合結(jié)合功能域功能域(DNA binding domain， DBD)和和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（activation domai

11、n， AD）。只有當(dāng)被分開的兩者通過適當(dāng)?shù)耐緩皆诳臻g）。只有當(dāng)被分開的兩者通過適當(dāng)?shù)耐緩皆诳臻g 上較為接近時，才能重新呈現(xiàn)完整的上較為接近時，才能重新呈現(xiàn)完整的GAL4轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄因子 活性，使啟動子下游基因得到轉(zhuǎn)錄。活性，使啟動子下游基因得到轉(zhuǎn)錄。 酵母雙雜交酵母雙雜交 優(yōu)優(yōu) 點點 1. 作用信號是在融合基因表達(dá)后，作用信號是在融合基因表達(dá)后， 在細(xì)胞內(nèi)重建轉(zhuǎn)錄因在細(xì)胞內(nèi)重建轉(zhuǎn)錄因 子的作用而給出的，子的作用而給出的， 省去了純化蛋白質(zhì)的繁瑣步驟。省去了純化蛋白質(zhì)的繁瑣步驟。 2. 檢測在活細(xì)胞內(nèi)進行，檢測在活細(xì)胞內(nèi)進行， 可以在一定程度上代表細(xì)胞內(nèi)可以在一定程度上代表細(xì)胞內(nèi) 的真實情況。的

12、真實情況。 3. 檢測的結(jié)果可以是基因表達(dá)產(chǎn)物的積累效應(yīng)，檢測的結(jié)果可以是基因表達(dá)產(chǎn)物的積累效應(yīng)， 因而可因而可 檢測存在于蛋白質(zhì)之間的微弱的或暫時的相互作用。檢測存在于蛋白質(zhì)之間的微弱的或暫時的相互作用。 4. 酵母雙雜交系統(tǒng)可采用不同組織、器官、細(xì)胞類型和酵母雙雜交系統(tǒng)可采用不同組織、器官、細(xì)胞類型和 分化時期材料構(gòu)建分化時期材料構(gòu)建cDNA文庫，文庫， 能分析細(xì)胞漿、細(xì)胞能分析細(xì)胞漿、細(xì)胞 核及膜結(jié)合蛋白等多種不同亞細(xì)胞部位及功能的蛋白。核及膜結(jié)合蛋白等多種不同亞細(xì)胞部位及功能的蛋白。 缺點缺點 n 自身有轉(zhuǎn)錄功能的蛋白會造成假陽性。融合自身有轉(zhuǎn)錄功能的蛋白會造成假陽性。融合 蛋白會影響

13、蛋白的真實結(jié)構(gòu)和功能。不利于核蛋白會影響蛋白的真實結(jié)構(gòu)和功能。不利于核 外蛋白研究，會導(dǎo)致假陰性外蛋白研究，會導(dǎo)致假陰性 。 n利用酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)的新功能利用酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)的新功能 n在細(xì)胞體內(nèi)研究抗原和抗體的相互作用在細(xì)胞體內(nèi)研究抗原和抗體的相互作用 n利用酵母雙雜交篩選藥物的作用位點以及藥物對蛋利用酵母雙雜交篩選藥物的作用位點以及藥物對蛋 白質(zhì)之間相互作用的影響白質(zhì)之間相互作用的影響 n利用酵母雙雜交建立基因組蛋白連鎖圖利用酵母雙雜交建立基因組蛋白連鎖圖 （Genome Protein Linkage Map） 應(yīng)應(yīng) 用用 n2005年年9月月1日出版的

14、電子版日出版的電子版Cell上，德國上，德國 科學(xué)家采用了科學(xué)家采用了4456個誘餌蛋白和個誘餌蛋白和5632個個 獵物蛋白，采用獵物蛋白，采用 酵母酵母雙雜交方法進行研究。雙雜交方法進行研究。 結(jié)果，在結(jié)果，在1705種蛋白質(zhì)間之間確定了種蛋白質(zhì)間之間確定了 3186種新的相互作用關(guān)系。同時采用免疫種新的相互作用關(guān)系。同時采用免疫 共沉淀和共沉淀和Pull-down驗證了這一結(jié)果。再驗證了這一結(jié)果。再 通過拓?fù)鋵W(xué)等評價，至少在通過拓?fù)鋵W(xué)等評價，至少在401種蛋白質(zhì)種蛋白質(zhì) 間有間有911種相互作用聯(lián)系。種相互作用聯(lián)系。 蛋白質(zhì)親和色譜蛋白質(zhì)親和色譜 n 基本原理是將一種蛋白質(zhì)固定于某種基 質(zhì)

15、上（如Sepharose），當(dāng)細(xì)胞抽提液經(jīng) 過改基質(zhì)時，可與該固定蛋白相互作用 的配體蛋白被吸附，而沒有吸附的非目 標(biāo)蛋白則隨洗脫液流出。被吸附的蛋白 可以通過改變洗脫液或者洗脫條件而回 收下來。 應(yīng)用應(yīng)用 n被用于蛋白質(zhì)復(fù)合體的大規(guī)模篩選被用于蛋白質(zhì)復(fù)合體的大規(guī)模篩選 n與化學(xué)交聯(lián)法聯(lián)合可以提高篩選效率與化學(xué)交聯(lián)法聯(lián)合可以提高篩選效率 n與酵母雙雜交聯(lián)合為探討與酵母雙雜交聯(lián)合為探討PPI的動態(tài)特性提供的動態(tài)特性提供 有意義的信息有意義的信息 Pull-Down技術(shù)技術(shù) n 目的：目的： 1. 用固相化的、已標(biāo)記的餌蛋白或標(biāo)簽蛋白（生物素用固相化的、已標(biāo)記的餌蛋白或標(biāo)簽蛋白（生物素- 、 Po

16、lyHis-或或GST-），從細(xì)胞裂解液中釣出與之互作的），從細(xì)胞裂解液中釣出與之互作的 蛋白。蛋白。 2. 確定已知的餌蛋白與釣出蛋白或已純化的相關(guān)蛋白間確定已知的餌蛋白與釣出蛋白或已純化的相關(guān)蛋白間 的相互作用關(guān)系。的相互作用關(guān)系。 3. 從體外轉(zhuǎn)錄或翻譯體系中檢測出蛋白相互作用。從體外轉(zhuǎn)錄或翻譯體系中檢測出蛋白相互作用。 優(yōu)優(yōu) 點點 1. 用普通的試驗儀器和試劑（如離心機、用普通的試驗儀器和試劑（如離心機、 Mini-Gel、蛋白染色）、蛋白染色） 2. 靈活的靈活的Pull-Down模式，鹽離子、變性劑濃模式，鹽離子、變性劑濃 度可調(diào)，對于弱蛋白相互作用也適用。度可調(diào)，對于弱蛋白相互作

17、用也適用。 3. 一天之內(nèi)一天之內(nèi)“Pull Down”和檢測可能與餌蛋白和檢測可能與餌蛋白 相結(jié)合的蛋白。相結(jié)合的蛋白。 4. 高效回收互作蛋白復(fù)合物。高效回收互作蛋白復(fù)合物。 缺點缺點 n表位附加標(biāo)記可能會使融合蛋白不穩(wěn)定，改變表位附加標(biāo)記可能會使融合蛋白不穩(wěn)定，改變 或或使融合蛋白功能喪失使融合蛋白功能喪失。 n 出現(xiàn)假陽性出現(xiàn)假陽性。實驗所檢測到的相互作用可能。實驗所檢測到的相互作用可能 時由蛋白質(zhì)所帶電荷引起的，并不是生理性的時由蛋白質(zhì)所帶電荷引起的，并不是生理性的 相互作用；蛋白的相互作用可能并不是直接的，相互作用；蛋白的相互作用可能并不是直接的， 可是由第三者作為中介的；有時會檢

18、測到兩種可是由第三者作為中介的；有時會檢測到兩種 在細(xì)胞中不可能相遇卻有極強親和力的蛋白。在細(xì)胞中不可能相遇卻有極強親和力的蛋白。 因此實驗結(jié)果還應(yīng)經(jīng)其他方法驗證因此實驗結(jié)果還應(yīng)經(jīng)其他方法驗證。 免疫共沉淀 （co-immunoprecipitation） n免疫共沉淀（免疫共沉淀（co-IP）是以抗體和抗原之間的是以抗體和抗原之間的 特異性結(jié)合為基礎(chǔ)，確定兩種蛋白質(zhì)在完整的特異性結(jié)合為基礎(chǔ)，確定兩種蛋白質(zhì)在完整的 細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。 n優(yōu)點優(yōu)點是蛋白處于天然狀態(tài)，蛋白的相互作用可是蛋白處于天然狀態(tài)，蛋白的相互作用可 以在天然狀態(tài)下進行，可以避免認(rèn)

19、為影響；可以在天然狀態(tài)下進行，可以避免認(rèn)為影響；可 以分離得到天然狀態(tài)下相互作用的蛋白復(fù)合以分離得到天然狀態(tài)下相互作用的蛋白復(fù)合 體。體。 n缺點：缺點：免疫共沉淀同樣不能保證沉淀的蛋白復(fù)免疫共沉淀同樣不能保證沉淀的蛋白復(fù) 合物時候為直接相互作用的兩種蛋白。另外靈合物時候為直接相互作用的兩種蛋白。另外靈 敏度不如親和色譜高。敏度不如親和色譜高。 Co-Immunoprecipitation (Western Blot or MS) HBc-YFP pEYFP FLAG-MxA WT FLAG-MxA L612K FLAG-MxA K83A Anti-GFP-IP IP IP 4% input

20、4% input FLAG-MxA FLAG-MxA HBc-YFP HBc-YFP YFP 細(xì)胞免疫熒光染色細(xì)胞免疫熒光染色 n利用不同熒光基團標(biāo)記的抗體與細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)蛋利用不同熒光基團標(biāo)記的抗體與細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)蛋 白的結(jié)合，借助激光共聚焦顯微鏡獲取熒光圖白的結(jié)合，借助激光共聚焦顯微鏡獲取熒光圖 像，若不同的蛋白的熒光圖像有像，若不同的蛋白的熒光圖像有共定位共定位（co-co- localizationlocalization），則可提供這些蛋白有相互作），則可提供這些蛋白有相互作 用的可能性。用的可能性。 n共定位不一定有相互作用，可能是間接相互作共定位不一定有相互作用，可能是間接相互作 用用。

21、 MxA colocalizes with HBcAg A CFP-MxAHBcAgMerged HBcAgCFP-K83A HBcAgCFP-L612K Merged Merged Li N et al. Hepatology. 2012 B YFP-HBcAgMergedCFP-MxA YFP-HBcAgMergedCFP-K83A CFP-L612KYFP-HBcAgMerged 熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù) (Fluorescence resonance energy transfer) FRET 原理：原理： 兩種熒光蛋白兩種熒光蛋白CFP和和 YFP，CFP的的發(fā)射光譜

22、發(fā)射光譜與與 YFP的的吸收光譜吸收光譜有相當(dāng)?shù)闹丿B有相當(dāng)?shù)闹丿B, 當(dāng)它們足夠接近當(dāng)它們足夠接近 時時, 用用CFP的吸收波長激發(fā)的吸收波長激發(fā), CFP的發(fā)色基團將會的發(fā)色基團將會 把能量高效率地共振轉(zhuǎn)移至把能量高效率地共振轉(zhuǎn)移至YFP的發(fā)色基團上的發(fā)色基團上, 所以所以CFP的發(fā)射熒光將減弱或消失的發(fā)射熒光將減弱或消失, 主要發(fā)射將主要發(fā)射將 是是YFP的熒光。兩個發(fā)色基團之間的能量的熒光。兩個發(fā)色基團之間的能量轉(zhuǎn)換效轉(zhuǎn)換效 率率與它們之間的與它們之間的空間距離的空間距離的6次方成反比次方成反比, 對空間對空間 位置的改變非常靈敏。位置的改變非常靈敏。 The donor emission

23、 spectrum must significantly overlap the excitation spectrum of the acceptor 供體發(fā)射波與受體供體發(fā)射波與受體 激發(fā)波有重疊激發(fā)波有重疊 The donor and acceptor fluorophores must be in favorable mutual orientation 合適的空間取向合適的空間取向 The distance between the donor and acceptor fluorophores must be less than 100 距離距離100 FRET: basic req

24、uirements Detecting methods Monitor changes in donor fluorescence 檢測供體檢測供體 熒光熒光 Monitor changes in acceptor fluorescence 檢測受檢測受 體熒光體熒光 Simultaneously measure changes in both donor and acceptor fluorescence using spectral imaging 同時檢測受體和供體熒光同時檢測受體和供體熒光 100 Ex=452 nm Em=527 nm Em=475 nm 熒光共振能量轉(zhuǎn)移熒光共振能量

25、轉(zhuǎn)移(FRET)技術(shù)驗證蛋技術(shù)驗證蛋 白質(zhì)之間的相互作用白質(zhì)之間的相互作用 Transfer Excitation Emission 要研究兩種蛋白質(zhì)要研究兩種蛋白質(zhì)a和和b間的相互作用間的相互作用,可以根據(jù)可以根據(jù)FRET 原理構(gòu)建一融合蛋白，這種融合蛋白由三部分組成原理構(gòu)建一融合蛋白，這種融合蛋白由三部分組成: CFP, 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)b， YFP。 用用CFP吸收波長吸收波長452 nm作為激發(fā)波長作為激發(fā)波長, 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)a與與b沒有發(fā)生相互作用時沒有發(fā)生相互作用時, CFP與與YFP相距很遠(yuǎn)相距很遠(yuǎn) 不能發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移不能發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移,因而檢測到的是發(fā)射波長因而檢測

26、到的是發(fā)射波長 476 nm的的CFP熒光熒光;但當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)但當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)a與與b發(fā)生相互作用時發(fā)生相互作用時,由由 于蛋白質(zhì)于蛋白質(zhì)b受蛋白質(zhì)受蛋白質(zhì)a作用而發(fā)生構(gòu)象變化作用而發(fā)生構(gòu)象變化,使使CFP與與YFP 充分靠近發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，此時檢測到的就是發(fā)充分靠近發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，此時檢測到的就是發(fā) 射波長為射波長為527 nm的的YFP熒光。將編碼這種融合蛋白的基熒光。將編碼這種融合蛋白的基 因通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)使其在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，這樣就可以在活細(xì)因通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)使其在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，這樣就可以在活細(xì) 胞生理條件下研究蛋白質(zhì)胞生理條件下研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用。蛋白質(zhì)間的相互作用。 Phot

27、obleaching Photobleaching: an example 應(yīng)用實例應(yīng)用實例 1、關(guān)于細(xì)胞凋亡的研究、關(guān)于細(xì)胞凋亡的研究 Reiko等利用等利用FRET技術(shù)研究了技術(shù)研究了Caspase8與與Bid蛋白之間的相互作用蛋白之間的相互作用, 研究者將研究者將Bid蛋白兩端分別與蛋白兩端分別與CFP與與YFP融合，精心設(shè)計使其在沒有被融合，精心設(shè)計使其在沒有被 裂解前剛好可以發(fā)生裂解前剛好可以發(fā)生FRET ，當(dāng)，當(dāng)Bid蛋白被裂解后蛋白被裂解后FRET效應(yīng)自然消效應(yīng)自然消 失，這是一種很好的檢測失，這是一種很好的檢測Caspase8 酶活性方法，而且當(dāng)酶活性方法，而且當(dāng)Bid蛋白與蛋

28、白與 CFP與與YFP融合之后仍能行使正常的功能，當(dāng)融合物在細(xì)胞內(nèi)被裂解融合之后仍能行使正常的功能，當(dāng)融合物在細(xì)胞內(nèi)被裂解 后，連接后，連接CFP的片段轉(zhuǎn)移到線粒體，通過的片段轉(zhuǎn)移到線粒體，通過CFP熒光可以很清楚地觀測熒光可以很清楚地觀測 到其在細(xì)胞內(nèi)的定位。到其在細(xì)胞內(nèi)的定位。 2. 關(guān)于膜蛋白的研究關(guān)于膜蛋白的研究 細(xì)胞膜受體之間相互作用細(xì)胞膜受體之間相互作用: 外界外界 刺激因素向細(xì)胞內(nèi)的信號傳遞一般認(rèn)為通過其在胞膜上的刺激因素向細(xì)胞內(nèi)的信號傳遞一般認(rèn)為通過其在胞膜上的 受體受體,當(dāng)配體與受體結(jié)合后當(dāng)配體與受體結(jié)合后,引起受體構(gòu)象變化或化學(xué)修飾，引起受體構(gòu)象變化或化學(xué)修飾， 介導(dǎo)信號傳

29、遞。但是關(guān)于介導(dǎo)信號傳遞。但是關(guān)于Fas及其同源物及其同源物TNFR(均為胞膜均為胞膜 上的三聚體受體上的三聚體受體)的研究發(fā)現(xiàn)的研究發(fā)現(xiàn),它們都可以在無配體存在的情它們都可以在無配體存在的情 況下自發(fā)組裝況下自發(fā)組裝,并介導(dǎo)信號傳遞并介導(dǎo)信號傳遞,引發(fā)細(xì)胞凋亡。其中在鑒定引發(fā)細(xì)胞凋亡。其中在鑒定 Fas發(fā)生三聚體化的實驗中使用了發(fā)生三聚體化的實驗中使用了FRET技術(shù)技術(shù), 將將Fas分別與分別與 CFP和和YFP融合融合,利用此項技術(shù)可以很方便地觀測到利用此項技術(shù)可以很方便地觀測到Fas單體單體 是否發(fā)生聚合。是否發(fā)生聚合。 n優(yōu)點：優(yōu)點：免疫共沉淀、免疫共沉淀、pull-down等技術(shù)需要破等技術(shù)需要破 碎細(xì)胞，