春季保護(hù)地小型西瓜苗期枯萎病和葉枯病初步鑒定

1、春季保護(hù)地小型西瓜苗期枯萎病和葉枯病初步鑒定 摘 要：隨著春保護(hù)地西瓜種植面積的擴(kuò)大和工廠化育苗的發(fā)展，西瓜苗期病害也越來越嚴(yán)重，有些常見于生長期的病害，現(xiàn)在在苗期也有較重發(fā)生。對湖北省宜城市流水鎮(zhèn)育苗場采集的2份西瓜苗期病樣，進(jìn)行分離、純化并回接病原菌，然后利用pcr擴(kuò)增真菌保守的its序列，初步確定所采集病樣1-a的致病菌為枯萎病病原菌fusarium oxysporum schl. f. sp. niveum （e. f. smith） snyber et hansen，病樣1-b的致病菌為葉枯病病原菌alternaria cucumerina （ell. et ev.） elliott

2、。本研究利用分子鑒定手段，避免了傳統(tǒng)分類方法的繁瑣、耗時和結(jié)果不穩(wěn)定性等缺點。 關(guān)鍵詞：西瓜；枯萎??；葉枯??；苗期病害 中圖分類號：s436；s651 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：a 文章編號：1001-3547（2013）16-0068-03 早春保護(hù)地西瓜上市早，價格高，經(jīng)濟(jì)效益好，近年來在湖北發(fā)展較快，其對西甜瓜嫁接苗的巨大市場需求促進(jìn)了工廠化育苗的快速發(fā)展。但由于部分小型育苗場設(shè)施簡陋，環(huán)境調(diào)控能力差，加上不注重種子處理，苗期頻發(fā)多種病害。2012年34月，湖北省低溫陰雨持續(xù)時間長，宜城市小型苗場發(fā)病較重。湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所對其中發(fā)生較為普遍的2種病害進(jìn)行了分離、鑒定，以期對其防治起到指導(dǎo)

3、作用。 1 材料與方法 1.1 供試菌株 從湖北宜城市流水鎮(zhèn)育苗場西瓜苗上采集病樣，圖1-a病樣的病部有粉紅色霉?fàn)钗?，圖1-b病樣的病部呈水漬狀，用組織分離法1分離病原菌，然后純化、保存。 1.2 致病性測定 根據(jù)柯赫氏法則2進(jìn)行寄主活體接種，接種菌絲，以清水為空白對照，3次重復(fù)。出現(xiàn)田間相同的癥狀時再次分離，并將2次獲得的分離菌作比較，以確定該菌病原菌。 1.3 dna提取 將病原菌菌塊移至馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基（psa）平板上，25黑暗條件下培養(yǎng)4872 h，然后將菌落邊緣的菌絲切成23 mm的菌落小塊，把45塊菌絲移至psa液體培養(yǎng)基，28、180 r/min振蕩培養(yǎng)2 d。將液體培養(yǎng)好的病菌

4、菌絲，在雙層尼龍網(wǎng)上過濾，用水洗滌2次，以除去菌絲內(nèi)的培養(yǎng)液，收集菌絲，將其包好放在硅膠中過夜，吸干水分，用液氮研磨成粉末，參照knapp等3報道的ctab （cetyltrim-ethyl ammonium bromide）法提取病菌菌絲dna。 pcr引物 病原菌rdna的its區(qū)域pcr擴(kuò)增選用的引物分別為its-f和its-r，其堿基序列如下4：its-f（5-gtcctaacaaggtttccgta-3），its-r（5-ttctccgct tattgatatgc-3）。 pcr混合物 10 mmol/l三磷酸堿基脫氧核苷酸0.6 l，20 mmol/l氯化鎂 1.2 l，緩沖液2.

5、0 l，加10 mol/l引物its-f和its-r各1.0 l，2 u/l taq 酶 1.0 l，模板1.0 l，使用超純水將反應(yīng)體系補(bǔ)至20 l。 pcr反應(yīng) 熱循環(huán)參數(shù)設(shè)置為94預(yù)變性4 min；94 30 s，56退火30 s，72延伸90 s，循環(huán) 36 次；72延伸6 min。pcr 產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，檢測到600 bp左右的條帶，將病原菌基因組pcr擴(kuò)增產(chǎn)物回收，回收片段與克隆載體進(jìn)行pgem-t連接，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌dh-5感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，選取陽性菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后，部分菌液用m13進(jìn)行pcr擴(kuò)增，凝膠電泳檢測，并將檢測后確認(rèn)含有目的片段的陽性克隆送到華

6、大基因測序公司測序，將測序結(jié)果提交genbank進(jìn)行分析。根據(jù)序列分析和形態(tài)學(xué)鑒定的結(jié)果，對所分離的病原菌進(jìn)行鑒定。 2 結(jié)果與分析 2.1 病原菌回接鑒定 菌絲接種第5天病部有粉紅色霉?fàn)钗铮▓D2-a）和水漬狀（圖2-b），與田間癥狀相同。從回接表現(xiàn)癥狀的病葉中再次分離到病原菌。 2.2 病原菌的rdna-its序列驗證 用病原菌 rdna的its區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，均擴(kuò)增出約600 bp的特異性片段（圖3）。測序后通過genbank軟件比對序列：病樣1-a分離獲得的菌株12的rdna its序列與fusarium oxysporum的相似度達(dá)99%，而西瓜枯萎病的致病菌是尖孢鐮刀菌西瓜?；停╢.

7、 oxysporum schl. f. sp. niveum（e. f. smith） snyber et hansen），初步判斷所得病菌為西瓜枯萎病致病菌5。病樣1-b分離獲得的菌株34的rdna its序列與半知菌交鏈孢霉屬（alternaria sp.）的序列相似度高達(dá)99%，西瓜葉枯病的致病菌是瓜鏈格孢菌（a. cucumerin），初步判斷所得病菌為西瓜葉枯病致病菌6。 3 小結(jié)與討論 西瓜枯萎病和葉枯病均可全生育期發(fā)病，且以中后期發(fā)病為主，傳播途徑以土壤和病殘體帶菌為主，種子也可攜帶病菌。本研究中苗期大量發(fā)病與嫁接育苗過程中過度保濕、連續(xù)陰雨、光照不足、種子消毒不徹底等有關(guān)。 本

8、研究所收集的2個病樣，1-a病樣的病部有粉紅色霉?fàn)钗铮@與已經(jīng)報道的西瓜枯萎病癥狀相似；1-b病樣的病部初為水漬狀小點，后擴(kuò)展成淺褐色至褐色、圓形或半圓形的水漬狀病斑，這與已報道的西瓜葉枯病癥狀相似7。但為了進(jìn)一步確定病害病原菌，本研究利用位于rdna上的高度保守序列作為通用引物對病原菌進(jìn)行pcr擴(kuò)增，然后將pcr產(chǎn)物通過連接、轉(zhuǎn)化并測序，所得序列通過genbank上的blast，確定其分類地位。該方法最大優(yōu)點是適用于所有真菌研究，最大缺點是必須通過測序才能確定病原菌分類地位。而根據(jù)特定生物its區(qū)域的dna序列設(shè)計出來的特異引物，因為不同物種間its序列的變異性較大，所以只有與特異性引物相對

9、應(yīng)的真菌才能擴(kuò)增出相應(yīng)的its產(chǎn)物。擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后，只需檢查有無擴(kuò)增條帶即可得出明確的結(jié)果8。因此，下一步將設(shè)計特異引物辨別西瓜不同病害的致病種，使檢測速度更加快捷，時間更加縮短，最終使其指導(dǎo)實際生產(chǎn)。 參考文獻(xiàn) 1 方中達(dá).植病研究方法.3版m.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998：234. 2 謝聯(lián)輝.普通植物病理學(xué)m.北京：科學(xué)出版社，2006. 3 knapp j e， chandlee j m. rna/dna mini prep from a single sample of orchid tissuej. biotechniques， 1996， 21： 54-56. 4 jung d s， na y j， ryu k h. phylogenic analysis of alternaria brassicicola producing bioactive metabolitesj. j microbiol， 2002， 40： 289-294. 5 張淑梅，趙曉宇，張先成，等.3種瓜類枯萎病菌fusarium oxysporum的分子檢測j.植物病理學(xué)報，2010，40（6）：636-641. 6 劉志恒，呂彬，趙廷昌，等.西瓜葉枯病病原菌生物學(xué)特性研究j.