AFLP技術(shù)的基本原理

1、aflp 技術(shù)的基本原理與實(shí)驗(yàn)方法aflp 技術(shù)的基本原理:aflp 技術(shù)是一項(xiàng)新的分子標(biāo)記技術(shù)，其原理是：基因組dna經(jīng)過(guò)二種酶不同的限制性內(nèi)切酶酶切后，產(chǎn)生粘性末端，再使用連接酶將人工合成的雙鏈接頭連接在酶切位點(diǎn)的粘性末端。接頭一端具有與內(nèi)切酶同樣的識(shí)別粘性末端，互補(bǔ)連接后成為dna模板進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增。接頭和與接頭相鄰的酶切片斷的幾個(gè)堿基序列作為引物的結(jié)合位點(diǎn)。引物由3部分組成: 核心堿基序列，該堿基序列與人工接頭互補(bǔ)；特異性酶切序列；引物3端選擇性堿基。選擇性堿基延伸到酶切片段區(qū)，這樣就只有那些兩端序列能與選擇堿基配對(duì)的限制性酶切片段被擴(kuò)增。另外，通過(guò)選擇在末端分別添加了13個(gè)選擇性核苷酸的

2、不同引物，可以達(dá)到選擇擴(kuò)增的目的。這些選擇性核苷酸使得引物選擇性地識(shí)別具有特異配對(duì)序列的內(nèi)切酶酶切片段。并與之結(jié)合，實(shí)現(xiàn)特異性擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)方法:(1) dna 酶切aflp技術(shù)成功的關(guān)鍵在于dna的充分酶切,所以對(duì)模板質(zhì)量要求較高,在dna完全溶解后利用紫外分光光度儀測(cè)定dna濃度，將dna濃度用雙蒸水調(diào)整到50ng/ul,應(yīng)避免其他dna污染和抑制物質(zhì)的存在。表1：e-m酶切體系反應(yīng)體系（e-m組合）1/2倍1倍dna（50ng/ul）1.50ul3.0 ulecor(10u/ ul)0.25ul0.5 ulmse (10u/ ul)0.15ul0.3 ultango buffer (10)2

3、.50ul5.0 ulddh2o8.10ul16.2 ul總體積12.5ul25 ul表2：p-m酶切體系反應(yīng)體系（p-m組合）1/2倍1倍dna（50ng/ul）1.50ul3.0 ulpst(10u/ ul)0.25ul0.5 ulmse (10u/ ul)0.15ul0.3 ulbuffer r (10)1.25ul2.5 ulddh2o9.35ul18.7 ul總體積12.5ul25 ul表3：p-t酶切體系反應(yīng)體系（p-t組合）1/2倍1倍dna（50ng/ul）1.50ul3.0 ultaq(10u/ ul)0.15ul0.3 ulpst (10u/ ul)0.5ul1.0 ulb

4、uffer taq (10)1.25ul2.5 ulddh2o9.10ul18.2 ul總體積12.5ul25 ul表4：e-t酶切體系反應(yīng)體系（e-t組合）1/2倍1倍dna（50ng/ul）1.50ul3.0 ultaq(10u/ ul)0.3ul0.6 ulecor(10u/ ul)0.25ul0.5 ulbuffer taq (10)1.25ul2.5 ulddh2o9.20ul18.4 ul總體積12.5ul25 ul表5：m-s酶切體系反應(yīng)體系（m-s組合）1/2倍1倍dna（50ng/ul）1.50ul3.0 ulsac(10u/ ul)0.5ul1.0 ulmse (10u/

5、ul)0.3ul0.6 ultango buffer (10)1.25ul2.5 ulddh2o8.95ul19.9 ul總體積12.5ul25 ul表6：t-s酶切體系反應(yīng)體系（t-s組合）1/2倍1倍dna（50ng/ul）1.50ul3.0 ulsac(10u/ ul)0.25ul0.5 ultaq(10u/ ul)0.3ul0.6 ulbuffer sac(10)1.25ul2.5 ulddh2o9.2ul18.4 ul總體積12.5ul25 ul表7：常用內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)、最適溫度、接頭名稱和預(yù)擴(kuò)引物內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)最適反應(yīng)溫度接頭名稱預(yù)擴(kuò)引物選擴(kuò)引物ecorgaattccttaag37

6、eadeaecea01ea16ec01ec16msetta aaatt65madmcmgmc01-mc16mg01-mg16pstctgcaggacgtc37padp0p001- p016taqtcgaagct65tadtctgtc01-tc16tg01-tg16sacgagctcctcgag37sadsasa01-sa16先將模板吸入pcr板中，再將內(nèi)切酶、buffer、雙蒸水配制為mix（因內(nèi)切酶用量很少或者因少數(shù)槍頭質(zhì)量問(wèn)題，每次吸取內(nèi)切酶時(shí)一定要注意觀察吸取是否足量），將配制好的mix加入到模板中，最后在配好的反應(yīng)體系中加入礦物油覆蓋離心，放入pcr儀或水浴鍋中37條件下56小時(shí)，然后

7、立即轉(zhuǎn)入65條件下1小時(shí)完全酶切。一般做1/2倍體系即可。目前本實(shí)驗(yàn)室擁有的內(nèi)切酶有：ecor；mse；pst；taq；sac,以上內(nèi)切酶均為fermentas公司生產(chǎn)。(2) 連接表8：連接體系連接體系1/2倍1倍接頭ead/pad/sad0.5 ul1.0 ulmad/tad0.5 ul1.0 ult4連接酶（10u/ ul)0.15 ul0.3 ult4連接酶buffer2.5 ul5 ulddh2o8.8 ul17.7 ul總體積12.5 ul25 ul在連接的過(guò)程中不同的內(nèi)切酶都有其對(duì)應(yīng)的接頭（表7），不同的酶切組合就用相應(yīng)的接頭組合。將配制好的連接mix加入酶切產(chǎn)物中（要與酶切體系

8、等體積），用保鮮膜包好室溫下連接過(guò)夜。在配制連接mix時(shí)t4連接酶buffer容易產(chǎn)生沉淀，最好待其完全融解后適當(dāng)振蕩將沉淀溶解。接頭的制備：在公司合成的接頭為單鏈干粉（2 od/管，要將接頭制備為雙鏈。mad的制備程序是，先將mf和mr干粉在12000/分鐘離心一分鐘，然后mf加入127ul，mr加入135ul雙蒸水完全溶解后各取127ul混合，在65水浴鍋中10min再轉(zhuǎn)入37/10min最后室溫下放置10min即可。ead、 pad、sad和tad的制備程序是，先將ef(pf、sf、tf)和er(pr、sr、tr)干粉在12000/分鐘離心一分鐘，然后ef(pf、sf、tf)加入1270

9、ul，er(pr、sr、tr)加入1350ul雙蒸水完全溶解后各取350ul混合，在水65浴鍋中10min再轉(zhuǎn)入37/10min最后室溫下放置10min即可。（3）預(yù)擴(kuò)增：將連接產(chǎn)物稀釋5倍混勻后作為預(yù)擴(kuò)增的模板，在預(yù)擴(kuò)的過(guò)程中每一種內(nèi)切酶都有其對(duì)應(yīng)的一組或兩組預(yù)擴(kuò)引物（表7），不同的酶切組合就用對(duì)應(yīng)的一組或多組預(yù)擴(kuò)引物組合。表9：預(yù)擴(kuò)體系（以e-m組合為例）預(yù)擴(kuò)體系1倍2倍dna（連接產(chǎn)物稀釋）5 ul10 ulbuffer2.5 ul5.0 ulmgcl22.0 ul4.0 uldntp0.4 ul0.8 ultaq0.2 ul0.4 ulddh2o13 ul26 ulprimer1 ea

10、ec1.0 ul2.0 ulprimer2 mcmg1.0 ul2.0 ul總體積25 ul50 ule-m組合因?yàn)閑組合有預(yù)擴(kuò)引物ea和ec，m組合有預(yù)擴(kuò)引物mc和mg，所以e-m組合一共可以進(jìn)行四種引物組合的預(yù)擴(kuò)增，即ea-mc、ea-mg、ec-mc、ec-mg，其它酶切連接組合可依此類推。將預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物在瓊脂糖電泳檢測(cè)，帶型應(yīng)為彌散狀。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果來(lái)確定預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物稀釋倍數(shù)，一般為15到30倍。（4）選擇性擴(kuò)增：根據(jù)預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物瓊脂糖電泳檢測(cè)的結(jié)果，將預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)混勻后作為選擇性擴(kuò)增的模板表10：選擴(kuò)體系選擴(kuò)體系1倍2倍dna（預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物稀釋）3 ul3 ulbuffer1.5 ul3.0

11、 ulmgcl21.2 ul2.4 uldntp0.3 ul0.6 ultaq0.2 ul0.4 ulddh2o6.8 ul13.6 ulprimer1 ea01ea16ec01ec161.0 ul2.0 ulprimer2 mc01mc16mg01mg161.0 ul2.0 ul總體積15 ul30 ul每一種預(yù)擴(kuò)引物組合擴(kuò)增的產(chǎn)物可以有1616256對(duì)對(duì)應(yīng)的其選擴(kuò)引物進(jìn)行選擇性擴(kuò)增。例：如果預(yù)擴(kuò)引物組合為ea-mc，那么ea對(duì)應(yīng)的就會(huì)有ea01到ea16共16對(duì)選擴(kuò)引物，mc對(duì)應(yīng)的就有mc01到mc16共16對(duì)選擴(kuò)引物，而它們進(jìn)行隨機(jī)組合就可以形成1616256對(duì)選擴(kuò)引物組合了。最后將選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物變性后在聚丙烯酰胺變性凝膠上電泳檢測(cè)。由于aflp實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣，涉及實(shí)驗(yàn)試劑多，極易造成實(shí)驗(yàn)體系不穩(wěn)定導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗，所以酶切、連接、預(yù)擴(kuò)和選擴(kuò)實(shí)驗(yàn)應(yīng)在冰上操作完成，并嚴(yán)格按照操作規(guī)范操作。實(shí)驗(yàn)中所用到的酶、接頭和引物要防止污染和降解。實(shí)驗(yàn)如果失敗應(yīng)首先從酶切開(kāi)始分步