分子生物學論文

1、分子生物學論文外源一氧化氮促進小麥種子萌發(fā)及其信號作用機制研究105目 錄目 錄摘 要iabstractiii縮略語詞匯表v引言1文獻綜述3 種子萌發(fā)機理的研究進展3 谷物種子中淀粉的降解及其水解酶16 植物一氧化氮（no）研究進展20參考文獻25第一部分 no供體對滲透脅迫下小麥種子萌發(fā)與抗氧化代謝的影響33第一章 no供體對滲透脅迫下小麥種子吸脹萌發(fā)和水解酶活性的影響331 材料與方法352 結(jié)果與分析373 討論44第二章 no供體對滲透脅迫下小麥種子萌發(fā)過程中抗氧化代謝的調(diào)控501 材料與方法512 結(jié)果與分析533 討論58第二部分 小麥種子萌發(fā)早期b-淀粉酶對no的快速應答及其生化

2、特性研究61第三章 小麥種子萌發(fā)早期b-淀粉酶對no的快速應答611 材料與方法632 結(jié)果與分析653 討論80第四章 小麥種子萌發(fā)早期no誘導的b-淀粉酶同工酶的特性841 材料與方法852 結(jié)果與分析863 討論91全文結(jié)論94創(chuàng)新之處95存在的問題與展望96致謝98中文摘要外源一氧化氮促進小麥種子萌發(fā)及其信號作用機制研究摘 要一氧化氮（nitric oxide, no）供體硝普鈉（sodium nitroprusside, snp）能明顯促進滲透脅迫下小麥種子的吸脹、萌發(fā)和胚芽胚根的生長，加速貯藏物淀粉降解為還原糖及可溶性小分子糖類；脅迫解除后，仍能維持種子較高的活力從而有利于幼苗的生

3、長。進一步研究發(fā)現(xiàn)，snp還能明顯誘導脅迫下種子淀粉酶活性的上升，輕微提高蛋白水解酶活性，加速淀粉胚乳的液化或溶解，而snp對酯酶影響不大。在探察no對滲透脅迫下小麥種子萌發(fā)過程中抗氧化代謝時發(fā)現(xiàn)，一氧化氮（no）供體硝普鈉（snp）能顯著誘導滲透脅迫下cat（catalase）、apx（acorbate peroxidase）活力的上升和脯氨酸含量積累，抑制lox（lipoxygenase）活性，降低h2o2與mda（malondialdehyde）的含量，從而提高滲透脅迫下小麥種子萌發(fā)過程中抗氧化能力，為種子的正常萌發(fā)提供一個良好的細胞內(nèi)環(huán)境。有意思的是，在小麥種子正常萌發(fā)早期，snp處理

4、便可以顯著誘導內(nèi)源葡萄糖、果糖和蔗糖含量的上升；進一步采用各種糖和snp，并結(jié)合no清除劑處理小麥種子，發(fā)現(xiàn)糖信號可能也介導了萌發(fā)早期小麥種子中淀粉酶的激活機制，且與no之間存在著對話（cross-talk）現(xiàn)象。而且在正常萌發(fā)條件下no誘導切胚半粒小麥種子萌發(fā)早期（6 h）的淀粉酶活力上升可能與ga3無直接相關。并對no誘導小麥種子淀粉酶活力的可能信號作用機理及其與ga、糖信號通路的關系進行了探討。進一步研究外源一氧化氮（no）與赤霉素（ga）對小麥種子萌發(fā)早期（12h）淀粉酶調(diào)控的信號機制發(fā)現(xiàn)，在萌發(fā)早期（12h內(nèi)），-淀粉酶和b-淀粉酶都不受ga所調(diào)控；而b-淀粉酶對no存在著快速應答現(xiàn)

5、象，但是，-淀粉酶卻沒有這種應答關系。no誘導b-淀粉酶活性的迅速上升可能與游離態(tài)b-淀粉酶聚合體的解聚以及結(jié)合態(tài)b-淀粉酶的直接釋放有關；而no促進的蛋白水解酶活性的輕微上升，對b-淀粉酶的激活或釋放沒有貢獻；而且no對b-淀粉酶單體也沒有激活效應。此外，我們的研究結(jié)果還表明，b-淀粉酶對no的快速應答現(xiàn)象同樣存在于其它物種，如大麥、大豆、水稻、西瓜、抑南芥等種子的萌發(fā)早期，暗示了b-淀粉酶對no的快速應答可能是種子萌發(fā)早期的一個普遍機制。采用-淀粉酶活性大小存在差異的三個小麥品種研究發(fā)現(xiàn)，-淀粉酶活性與種子的萌發(fā)速率呈正相關，同時也暗示了，在正常條件下，高活性或高含量的-淀粉酶可能是促進種

6、子萌發(fā)的誘因之一。同時結(jié)合-淀粉酶抑制劑的實驗結(jié)果也表明，-淀粉酶在小麥種子萌發(fā)過程中起著重要作用。研究小麥種子萌發(fā)早期no誘導的b-淀粉酶同工酶的特性發(fā)現(xiàn)，萌發(fā)早期小麥種子中的b-淀粉酶最適ph為4.5-6.5，在ph3.0-9.0范圍內(nèi)較穩(wěn)定；最適溫度為40，高于55時活力喪失，表現(xiàn)了其對熱的不穩(wěn)定性；自由態(tài)的種子中預存的自由態(tài)i型-淀粉酶同工酶pi在4.8-6.0范圍，中性偏酸；依賴于no而產(chǎn)生的ii型-淀粉酶同工酶的pi在6.0-7.0范圍，偏中性。抑制劑實驗表明，萌發(fā)早期所有的-淀粉酶均含有巰基。進一步采用蛋白質(zhì)合成抑制劑的實驗結(jié)果表明，依賴于no誘導的-淀粉酶同工酶在種子萌發(fā)早期（

7、12h）不是從頭合成的。關鍵詞： 一氧化氮；種子萌發(fā)；滲透脅迫；小麥（triticum aestivum l.）；赤霉素；-淀粉酶英文摘要signal mechanisms of exogenous nitric oxide on the promotion of wheat seeds germinationstressabstracteffects of nitric oxide (no) donor, sodium nitroprusside (snp) on the germination and activities of hydrolytic enzymes in wheat (t

8、riticum aestivum l.) seeds were researched. treatment with snp dramatically promoted imbibition and germination of wheat seeds, increased the elongation of roots and shoots, accelerated the degradation of reserve starch and the liquefaction of endosperms under osmotic stress. after osmotic stress re

9、moved, the wheat seed treated with snp could also retain higher viability. further studies showed that snp could induce amylase activities apparently, enhance protease activities slightly, while exhibit no roles in esterase. the effects of nitric oxide (no) donor, sodium nitroprusside (snp) on the a

10、ntioxidant metabolism in germinating wheat seeds were also investigated. treatment with snp dramatically promoted the activities of cat, apx and the contents of proline simultaneously, inhibited activities of lox, decreased the contents of h2o2 and mda. all of these functions were beneficial for imp

11、roving the antioxidant capacity during germination of wheat seed under osmotic stress.moreover, snp could strongly increase the content of sugars, such as fructose, glucose and sucrose in wheat seeds during early germination (12 h) under normal conditions. when the seeds treated with snp with or wit

12、hout ptio, an no scavenger, and different exogenous sugars, including fructose, glucose, sucrose and sorbitol, mannitol as controls, it was found that there might be existing a cross-talking between no and sugars signaling in the activation of amylase in the early stage of germination, while ga acte

13、d no such actions in the same period.the effects of nitric oxide (no) and gibberellic acid (ga3) on the responses of amylases in wheat seeds were further investigated during the first 12 h of germination. ga3 had no effects on the activities of -amylase (ec 3.2.1.1) or -amylase (ec 3.2.1.2), either

14、in intact seeds or embryoless halves within 12 h. in contrast, addition of sodium nitroprusside (snp), an no donor, was able to induce a rapid increase in -amylase activity without affecting -amylase. furthermore, the rapid response of -amylase to snp in wheat seeds could be attributed to no and was

15、 approximately dose-dependent. some other aspects of snp induction of amylase isozymes were also characterized. further investigations showed that snp might play an interesting role in the dissociation of free -amylase from small homopolymers or heteropolymers. furthermore, snp also directly induced

16、 the release of bound -amylase from glutenin and its crude enzyme preparation. however, the slight increase in protease induced by snp might not be responsible for this action. interestingly, based on the fact that the rapid response of -amylase to no also existed in seeds of other species, such as

17、barley, soybean, rice and watermelon, it might be a universal event in early seed germination.activities of -amylase in seeds of three wheat species and their germination index were investigated at the same time. it showed that there was a positive correlationship between activities of -amylase and

18、the index of germination in wheat seeds. experiment of -amylase inhibitors also showed us -amylase played a key role in wheat seeds germination. in this paper, characterization of beta-amylase isozymes induced by no was further investigated. the pi of the snp-induced beta-amylases, type, as determin

19、ed by ief, was in the range 6.0-7.0, and that of the intrinsically active ones, type, in the range 4.8-6.0. the optimum ph of these amylases was found to be 4.5-6.5, and they were stable in the ph range 3.0-9.0. the optimum temperature of these enzymes was 40, but they active even up to 55. further

20、investigations using protein synthesis inhibitors, such as actidione d and chloromycetin, showed that beta-amylase isozymes induced by no were not synthesized de novo.keywords: nitric oxide; seed germination; osmotic stress; gibberellin; wheat (triticum); -amylase縮略語詞匯表縮略語詞匯表abaabscisic acid脫落酸apxac

21、orbate peroxidase抗壞血酸過氧化物酶asaascorbic acid抗壞血酸bsaborine serum albumin牛血清白蛋白catcatalase過氧化氫酶ckscytokinins細胞分裂素dttdithiothreitol二硫蘇糖醇dwdry weight干重edtaethylenediamine tetraacetic acid乙二胺四乙酸fwfresh weight鮮重gagibberellin赤霉素ga3gibberellic acid赤霉酸h2o2hydrogen peroxide過氧化氫iefisoelectric focusing等電聚焦iaaindo

22、le acetic acid吲哚乙酸loxlipoxygenase脂氧合酶mdamalondialdehyde丙二醛2-me2-mercaptoethanol-巰基乙醇nadphreduced nicotinamideadenine還原型輔酶dinucliotide phosphatenonitric oxide一氧化氮nosnitric oxide synthase一氧化氮合酶nrnitrate reductase硝酸還原酶o2.-superoxide anion超氧陰離子pagepolyacrylamide gel electrophoresis聚丙烯酰胺凝膠電泳par4-(2-pyrid

23、ylazo)resorcinol4-(2-吡啶)間苯二酚pbsphosphate buffer solution磷酸緩沖液pcmbp-chloromercuribenzoate氯化苯汞pmsfphenylmethylsulphonyl fluoride苯甲基磺酰氟化物podperoxidase過氧化物酶pvppolyvinylpyrrolidone聚乙烯吡咯烷酮prpathgen-related protein病原相關蛋白rnsreactive nitrogen species活性氮rosreactive oxygen species活性氧sasalicylic acid水楊酸sabpsali

24、cylic acid-binding protein水楊酸結(jié)合蛋白sarsystem acquired resistance系統(tǒng)獲得抗性sdssodium dodecyl sulfate十二烷基硫酸鈉snpsodium nitroprusside硝普鈉sodsuperoxide dismutase超氧化物歧化酶tcatrichloroacetic acid三氯乙酸引言引言種子萌發(fā)是植物個體發(fā)育的最初階段，一般而言，其下一代的獨立生活是從種子萌發(fā)開始的。而種子的萌發(fā)受內(nèi)外因素的制約，其中內(nèi)部因素包括種子的休眠與不成熟，種皮的限制等；外部因素包括光，溫，水，氧氣，化學物質(zhì)等。通常情況下，影響一批成

25、熟種子萌發(fā)最主要的外部因素是水分虧缺，尤其是近年來由于環(huán)境的破壞、水資源的匱乏導致可耕種土地的干旱半干旱狀況日趨嚴重。從世界范圍來看，水資源日益短缺是全球性的問題。據(jù)統(tǒng)計，因旱災造成的糧食減產(chǎn)位于各種災害造成的損失之首。我國是水資源十分短缺的國家之一，干旱缺水地區(qū)面積占全國國土面積的52%，這些地區(qū)的耕地面積占全國的64%（李廣敏與關軍鋒，2001）。干旱脅迫能抑制種子萌發(fā)過程中胚乳和幼苗的淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等水解酶的活性；降低貯存物質(zhì)的氧化分解；抑制呼吸作用，使胚生長所需的物質(zhì)與能量供應受阻；從而抑制了胚的生長，影響種子的萌發(fā)，妨礙了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。因而，水分虧缺條件下種子的萌發(fā)機理一直是植物

26、抗逆研究和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上所關注的重要課題。小麥是一種重要的糧食作物，屬淀粉型種子。種子中的貯存物質(zhì)主要是淀粉，此外還有部分蛋白質(zhì)與脂肪。因而貯藏物質(zhì)-淀粉的降解與其水解酶-淀粉酶的表達是萌發(fā)過程中最顯著的事件之一。經(jīng)典的種子萌發(fā)理論認為，在正常的環(huán)境條件下，種子由特定部位滲透吸水，接著胚開始萌動合成ga向糊粉層運輸，刺激糊粉層合成并分泌水解酶類，尤其是-淀粉酶，至貯藏器官，將貯藏物質(zhì)水解成小分子物質(zhì)供胚生長。然而，近來越來越多的研究結(jié)果證實，ga僅僅在種子的萌發(fā)后期及幼苗的生長有關。而關于在萌發(fā)前期尤其是種子吸水膨脹階段淀粉酶的調(diào)控研究一直處于被忽視且未知的狀態(tài)。no在植物體內(nèi)起著重要的作用，參與

27、諸如信號轉(zhuǎn)導，抗氧化代謝，基因的表達與調(diào)控，細胞編程性死亡，生長與發(fā)育等。garca-mata與lamattina（2001）研究發(fā)現(xiàn)no可以誘導植物葉片的氣孔關閉增強植物對干旱的適應性，表明no參與了植物體內(nèi)的干旱脅迫響應。進一步發(fā)現(xiàn)no是通過介導aba信號轉(zhuǎn)導途徑誘導氣孔關閉，從而增強植物的抗旱性的；beligni等（2000）研究發(fā)現(xiàn)no能夠誘導需光種子萵苣在黑暗或低光強條件下正常萌發(fā)，表明no參與了種子萌發(fā)過程中的光形態(tài)發(fā)生，介導了種子萌發(fā)的內(nèi)部機制。有趣的是，最近的研究發(fā)現(xiàn)，大麥等作物種子的糊粉層可以通過亞硝酸鹽的非酶促反應來合成no，而且這也是萌發(fā)過程中的一個普遍現(xiàn)象（bethke

28、等，2004）；并且在高粱種子萌發(fā)早期也發(fā)現(xiàn)了no快速迸發(fā)的現(xiàn)象（simontacchi等，2004）。已經(jīng)知道，具有跨膜特性的no也是重要的植物信號分子/調(diào)節(jié)物質(zhì)，能夠參與種子萌發(fā)、光形態(tài)建成、脅迫響應、pcd以及抗病等各種生理代謝過程（zhang等，2003；barroso等，1999），其作用機理往往與其對相關代謝酶活/基因表達的調(diào)節(jié)有關（durner等，1998；neill等，2000；mackerness等，2001）。此外，植物no的生理功能還與其具有的抗氧化劑特性有關，beligni等（2002）就報道no可以延緩大麥糊粉層細胞的凋亡，就是因為no起到了類似于抗氧化劑bht（bu

29、tylated hydroxy toluene）的作用。然而，目前有關no誘導種子萌發(fā)過程中的生理生化機制以及no能否誘導禾谷類種子萌發(fā)，尤其是逆境條件下種子的萌發(fā)，國內(nèi)外仍未見文獻報道。no是否在萌發(fā)過程中與ga存在著互作關系，no是否參與了ga對淀粉酶調(diào)控等問題仍待進一步明確。本研究的主要目的是：其一，明確no能否促進滲透脅迫條件下的種子萌發(fā)；其二，深入研究no在種子萌發(fā)過程中的信號作用機制；其三，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上，尤其是干旱半干旱地區(qū)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上解決播種后萌發(fā)滯后的難題。研究結(jié)果不僅可以充實植物中的no信號作用機制，豐富種子中有關-淀粉酶的相關知識，為闡明種子萌發(fā)生理和今后生產(chǎn)實踐的應用提供

30、新的理論基礎。本題的研究內(nèi)容主要集中于以下幾個部分：1. no對滲透脅迫下小麥種子萌發(fā)的影響；2. no是否參與了種子萌發(fā)過程中的抗氧化代謝；3. no對小麥種子萌發(fā)早期-淀粉酶活性快速誘導調(diào)節(jié)的分子機理；4. 其它種屬種子中是否也普遍存在-淀粉酶對no信號的快速應答現(xiàn)象；5. 受no調(diào)控的-淀粉酶生化特性及其生物學意義。文獻綜述文獻綜述 種子萌發(fā)機理的研究進展植物下一代的獨立生活是從種子萌發(fā)開始的。我們經(jīng)常說大自然喜歡變異，確實如此。自然界在造就形形色色的物種的同時，也造就了形形色色的種子萌發(fā)機制。從種子外部的解剖學形態(tài)到種子內(nèi)部的儲藏物質(zhì)的組成都決定了種子在萌發(fā)時必定存在著或多或少的差異。

31、比如，同是禾本科種子，由于儲存物質(zhì)的組成與比例的不同，小麥與玉米在動員儲藏物質(zhì)、啟動萌發(fā)時存在差異；同樣，水稻與小麥之間的差異便是顯而易見的了。另外，同一品種的一批種子由于所處的萌發(fā)環(huán)境不同，比如高溫/寒冷、光/暗、干旱/潮濕、鹽堿/重金屬等條件下，其適應環(huán)境的萌發(fā)機制也明顯不同。具體一個物種的種子能否萌發(fā)與怎樣萌發(fā)，是由其自身的內(nèi)部遺傳特性及外界的環(huán)境因素所決定。內(nèi)部遺傳特性，如胚的休眠與不成熟、種皮的限制（debeaujon等,2000）等；外界的環(huán)境因素，包括光、溫、水、氣、激素等。顯然，這是植物在進化過程中為了物種延續(xù)而適應環(huán)境的結(jié)果。萌發(fā)的類型多樣性與環(huán)境對其影響的復雜性使目前還很難

32、形成一個比較完美的種子萌發(fā)模型或理論構(gòu)圖（ellner, 1985a; ellner, 1985b）。一、 種子的萌發(fā)與休眠1種子的萌發(fā)人們可能會認為“萌發(fā)的概念”問題早已得到解決，或至少可以輕易地回答。然而，萌發(fā)過程的嚴格解釋目前仍難以準確闡明。什么是萌發(fā)？有活力的種子，當其受潮吸水后，開始進行呼吸、物質(zhì)合成及其它代謝活動，經(jīng)過一定時期，種胚突破種皮，露出胚根的過程，稱為萌發(fā)。萌發(fā)在形態(tài)學上，是胚轉(zhuǎn)變?yōu)橛酌?；萌發(fā)在生理學上，是恢復早先受抑制或暫停的代謝和生長，是開放一部分新的遺傳程序的轉(zhuǎn)錄；萌發(fā)在生物化學上，是氧化和合成途徑的相繼分化，是恢復營養(yǎng)生長和發(fā)育的典型生化途徑；因此，萌發(fā)在本質(zhì)上，

33、是將胚軸恢復到靜止或休眠期間暫時停止的連續(xù)生長狀態(tài)，開始進行新的遺傳程序即基因的相異轉(zhuǎn)錄（khan，1977）。萌發(fā)是在生命產(chǎn)生后又暫時停止的系統(tǒng)中的生命恢復過程。bewley（1997）將萌發(fā)的時間段劃分為從種子吸脹開始，到胚軸伸長和胚根刺破胚周圍組織。據(jù)推測，激素是構(gòu)成種子萌發(fā)的生化過程的調(diào)節(jié)物。2種子的休眠生物界有許多很有趣的現(xiàn)象，生物學上的休止就是其中之一。休止有許多形式，休眠、靜止、滯育、冬眠和睡覺都是休止的表現(xiàn)。生物學的休止反映了一種降低代謝或代謝低下的狀態(tài)，表現(xiàn)在遺傳程序的表達部分關閉（基因阻遏），并且經(jīng)常伴隨著生長發(fā)育的暫時停頓。進入和解除休眠對于有機體繼續(xù)生命周期來說是重要的

34、發(fā)育過程。對于構(gòu)成休止的生理學和組織學條件，我們還基本上一無所知。種子休眠和靜止或其他形式的休止（如芽休眠）的不同之處是高度干燥的狀態(tài)。為了進一步闡述種子萌發(fā)，我們還必須了解一個與之有關的重要概念：休眠。種子的休眠是一個十分古老的話題，然而至今也未能完全揭開它的奧秘。不同的科學家從不同的角度來探討這個問題。hobson（1981）曾這樣說過：“研究休眠問題的人有多少，休眠的定義就可能有多少種”。這種現(xiàn)象出現(xiàn)的主要原因是因為休眠機理不清楚。bewley（1997）認為，休眠是指在足夠的水分、溫度和氧氣條件下，種子萌發(fā)被抑制的一種內(nèi)在狀態(tài)。這意味著只要去除抑制作用，種子就能在很廣的環(huán)境條件下萌發(fā)。

35、vleeshouwers等（1995）強調(diào)合理的休眠概念應該把那些影響種子萌發(fā)的內(nèi)在和外在因素區(qū)分開。baskin和baskin（1998）對于休眠也做了類似的解釋:因為不合適的外界條件和/或種子內(nèi)部結(jié)構(gòu)特性阻止了種子的萌發(fā)。在不可預測環(huán)境中種子存在推遲萌發(fā)現(xiàn)象，這是大家早就注意到了的事實；然而，在環(huán)境條件相對穩(wěn)定的條件下，種子也會有休眠現(xiàn)象，有的學者提出這是為了避免競爭，尤其是親屬之間的競爭(ellner, 1987; ellner, 1986; nilsson, 1994; kobayashi and yamamura, 2000),特別是對光、水的競爭。據(jù)此，理論生物學家也列出了幾種會導

36、致種子休眠的原因：在有風險的環(huán)境中確保種的延續(xù)；阻止與母株或兄弟之間的競爭；當環(huán)境不利于實生苗的定居時可作為一種調(diào)節(jié)對策；調(diào)節(jié)萌發(fā)對策使適合度達到最大；作為幾個生活周期特征之一被繼承下來使種的適合度最大（李良和王剛，2003）。這是對同一問題的不同方面的研究。理論生物學家提出了很多數(shù)學模型試圖從進化的角度來加以解決。然而，與萌發(fā)一樣，休眠類型的多樣性與環(huán)境對其影響的復雜性目前也很難形成一個比較完美的種子休眠模型或理論構(gòu)圖。一顆有活力的種子可能不會萌發(fā)，比如，大多數(shù)溫帶和寒帶植物的種子在夏末和秋季散落之后，盡管溫度、濕度和光照均適合于種子發(fā)芽，但仍保持休眠狀態(tài)，直到來年春季才萌發(fā)（allen與s

37、kmeyer, 1998; vleeshouwers與bouwmeester, 2001）。種子長期保持生命力而不萌發(fā)的能力是植物最重要的適應性之一。正是體現(xiàn)在生長活動中止的這種適應性，使得種子不僅能在不利的季節(jié)條件下存活了下來，并且保證了其物種的延續(xù)。在自然環(huán)境下，種子休眠代表著一種重要的保護模式，目的在于阻止種子在不適宜的時期萌發(fā)，確保幼苗存活。顯而易見，種子若在溫濕等條件不當?shù)募竟?jié)萌發(fā)便會導致幼苗的死亡。這種適應性有兩種主要的表現(xiàn)形式，一種是強迫休眠，即由于不利環(huán)境條件所引起的生長停頓，我們也經(jīng)常稱之為“靜止”；另一種是機體休眠，這和種子本身的性質(zhì)有關（bewley and black，

38、1982，bewley and black，1989；baskin與baskin，2000）?？梢钥闯鲞@兩類休眠，一類為外因性的，一類為內(nèi)因性的。外因性休眠受諸多因素影響，如物理的、化學的、甚至種皮和果皮；而內(nèi)因性休眠是由胚的特征所決定的。休眠的種子在一定條件下都可以萌發(fā)（baskin和baskin, 1998）。靜止的或強迫休眠的種子容易受到非專一性的觸發(fā)因子，如足夠的水分和適宜的溫度的作用就能夠啟動種子的萌發(fā)。然而，機體休眠的種子即使是在有利于生長的正常條件下也不萌發(fā)。機體休眠種子需要特殊的環(huán)境刺激，這種刺激不是恒定不變的，但具有觸發(fā)萌發(fā)過程的作用。一般情況下，特殊的觸發(fā)因子通常是和抑制條

39、件有關的周期性的環(huán)境因素。目前，我們可以肯定的是，靜止種子和機體休眠種子在萌發(fā)方面的區(qū)別在于遺傳阻遏和代謝抑制或缺乏的程度。在靜止種子萌發(fā)時，開始的氧化代謝是厭氧的，一般的或非特殊的萌發(fā)因子，如水，可以推動這些途徑的活化。后來，氧化代謝變?yōu)樾柩醯?，并伴隨著分化基因的轉(zhuǎn)錄。這些途徑受內(nèi)源萌發(fā)物（激素）的推動。然而，休眠種子在萌發(fā)時缺乏現(xiàn)成的重要中間產(chǎn)物。所以需要特殊的引發(fā)，如低溫或光敏節(jié)律，來活化水解以及后來的氧化途徑，或修補早期的代謝缺乏。此外，遺傳轉(zhuǎn)錄受到強烈的阻遏，萌發(fā)物需要觸發(fā)以推動轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯的活化?？傊?，休眠種子萌發(fā)必須作好代謝準備。所以，在靜止種子和休眠種子萌發(fā)時，代謝途徑及其順序可

40、能是有重要差別的。休眠的類型可以分為三組：外部、內(nèi)部和綜合休眠。外部休眠中萌發(fā)遲滯的原因通常和種皮的各種物理或化學性質(zhì)有關，其中包括對水和氣體的透性（genever，1998；hilhorsth，1995；hilhorsth，1998）。這類休眠包括物理休眠和化學休眠，可用各種物理方法予以打破。物理休眠或硬實性在自然界中是相當普遍的，堅硬的果、種皮對萌發(fā)的胚起機械阻礙作用?；瘜W休眠大部分發(fā)現(xiàn)于熱帶和亞熱帶地區(qū)的植物，以抑制劑阻礙種子在不利的旱季發(fā)芽，人工去除果皮、種皮或者淋洗果實就足以使許多種子萌發(fā)，這種過程在自然條件下通常在雨季發(fā)生。內(nèi)部休眠是最普遍的而且不容易克服，如胚發(fā)育不完全、胚的活力

41、下降，只有能引起生理變化的那些因素才能打破休眠，諸如一定溫度的層積，后熟要求，光照條件，生長促進劑的應用等等。大多數(shù)種子都是綜合休眠，有各種內(nèi)部休眠類型和外部休眠類型的結(jié)合，由于造成抑制萌發(fā)的各種原因之間的組合的多樣性（楊期和等，2003），對綜合休眠進行明確的分類是比較困難的，為克服綜合休眠通常需要進行復合的預處理。3萌發(fā)與休眠的關系從以上敘述可以看出，萌發(fā)并不是休眠的簡單終止，也不是與休眠的簡單過程替換。萌發(fā)是一個在不同萌發(fā)因子的作用下打破休眠恢復生長的復雜過程；萌發(fā)是一個協(xié)調(diào)、有序、周密的物質(zhì)與能量的大動員過程；萌發(fā)是分解代謝與合成代謝的精密互作；萌發(fā)是從生命停滯到生命恢復的復雜的戲劇性

42、的過程。種子萌發(fā)是胚解除休止狀態(tài)，反映了由低代謝向“最適的”或“正常的”代謝的發(fā)育轉(zhuǎn)變，同時也反映了休止的解除與生長的恢復。在生物學上，種子萌發(fā)是解除胚的類似隱生的狀態(tài)，是發(fā)育的遺傳程序的再表達。二、 種子的結(jié)構(gòu)與養(yǎng)料的儲藏1、種子的結(jié)構(gòu)種子的大小、形狀與結(jié)構(gòu)，在種間有極大的差異。種子是由受精胚珠形成的。當受精胚珠發(fā)育時，我們一般可以看到：種皮，由一或二層珠被形成；外胚乳，由珠心形成；胚乳，由一個雄的生殖核和兩個極核融合形成三倍體的胚乳細胞核；胚，由一個雄核和卵受精產(chǎn)生。這些不同成分繼續(xù)發(fā)育的程度如何，或甚至它們之中是否全部保存下來，都會造成各種類型種子中一些根本性的結(jié)構(gòu)差異。另外，許多植物的

43、胚珠外組織，特別是子房壁（果皮）在種子形成過程中與種子緊密結(jié)合。我們也能看到即使同一植株上的種子，其結(jié)構(gòu)也有所不同，這是種子的多形性。有些植物的種子可出現(xiàn)大小不同、胚乳有無、種皮色澤不一和葉綠素多少的種種差異，產(chǎn)生這種差異的原因尚不十分了解。種皮是種子內(nèi)部隔絕外界環(huán)境的天然屏障，種子與珠柄連結(jié)處的一個疤痕形成了種皮上一個明顯特征：種臍。許多種子在種臍的一端有一個小孔：珠孔。此外，許多種子的種皮上還有附屬物，如種阜、假種皮等。種臍及其附屬物在吸漲過程中水分的進入起重要作用。至于為什么會出現(xiàn)種皮的不透水性目前還很不清楚。外胚乳在絕大多數(shù)種子發(fā)育初期之后就不復存在了，但絲蘭、咖啡等少數(shù)種類，則逐漸變

44、成種子養(yǎng)料的主要儲藏組織。這些種子實際上沒有胚乳，可是有些種類也會有相當數(shù)量的胚乳。根據(jù)胚乳的發(fā)達與否，種子可分為胚乳型或非胚乳型種子。比較發(fā)達的胚乳內(nèi)貯藏著營養(yǎng)物，常見的例子是禾本科植物，在這種情況下，子葉相當小，或是吸器狀器官。種子發(fā)育期間，胚乳包圍了胚，并直到種子充分長大，一直保持著較大的組織；有的種子當胚生長加速，胚乳可被吸收或消耗成一薄層組織，而胚就占滿了整個種子，如紅花菜豆。禾本科及一些其它植物，胚乳的特點是外面有一層糊粉層。當種子開始成熟時，胚乳表面的細胞垂周分裂，形成長方形小細胞。這樣的細胞可以有一層或幾層，如圖1所示，它們的細胞壁變得相當厚，并且，重要的是，不象谷粒中的其它充

45、滿了淀粉的死的胚乳細胞，它們是保持著活性的細胞。胚乳糊粉層子葉、盾片胚果種皮圖1 小麥種子的結(jié)構(gòu)示意圖胚包括長著一片或幾片子葉的胚軸。胚軸由三個部分組成：著生子葉的下胚軸、胚根（與下胚軸間的界限很難劃分）和胚芽（帶有第一片真葉的莖尖）。少數(shù)植物在子葉間有一節(jié)間叫中胚軸。這些部分在雙子葉植物的胚中一般容易判別，但是在單子葉植物中，特別是禾本科，則比較難認。它們的單獨一片子葉大多變成吸器-盾片。子葉基部的膜延伸為胚芽鞘，而有些植物的胚軸部分變成中胚軸。胚根鞘可解釋為裹著內(nèi)生胚根的胚軸基部。外胚葉可認為是子葉的葉舌。胚的形狀及其在種子中的位置，在種間有極大的差異。2、種子養(yǎng)料的貯藏種子萌發(fā)所需要的物

46、質(zhì)和能量完全來源于貯存物質(zhì)的氧化分解與能量的釋放。在幼苗本身成為能營光合作用的自養(yǎng)植物體之前，萌動的種子靠體內(nèi)的貯藏養(yǎng)料來維持其生長發(fā)育(bewley, 1997；bewley and black, 1985)。這些貯藏物多半是以離散的胞內(nèi)體形式存在，并包含著類脂物、蛋白質(zhì)、碳水化合物、有機磷酸鹽及各種無機化合物。當然，也僅有極少數(shù)植物如蘭花，幾乎沒有貯藏養(yǎng)料，種子的萌發(fā)與生長都是靠外界供給碳水化合物等有機物，估計常常是由它和腐生菌之間的關系供給的。貯藏養(yǎng)料的組分，種子之間有很大的差異。碳水化合物，主要是淀粉，在禾谷類及其它禾本科植物中占優(yōu)勢，雖然同時也存在蛋白質(zhì)和類脂物。大部分植物的種子，其

47、中許多是重要的農(nóng)作物，貯藏的主要物質(zhì)是脂類，如甘油三脂，但同樣也還有相當多的其它貯藏物，如蛋白質(zhì)等。另外一類種子，如豌豆、菜豆等豆科植物，蛋白質(zhì)含量很高，淀粉含量甚至更高，而脂類甚少。有些種子中貯藏的碳水化合物是甘露聚糖，或以游離氨基酸形式貯存氮。除了主要的有機貯藏物質(zhì)外，也常有肌醇六磷酸鈣鎂和小分子的碳水化合物。此外，應該了解，種子在發(fā)育期間，母體植物所經(jīng)歷的環(huán)境條件和遺傳因素，都會使其種子中的貯藏物發(fā)生相當大的差異（bewley and black, 1978）。在靜止種子中貯藏養(yǎng)料的的大規(guī)模水解是發(fā)生在滯后期之后，甚至是發(fā)生在胚根出現(xiàn)之后（drennan與berrie，1962；macl

48、eod與palmer, 1969），表明胚芽胚根早期生長的養(yǎng)分供應依然依賴于貯藏物質(zhì)的降解。三、 植物激素與種子萌發(fā)在種子上應用生長調(diào)節(jié)劑對于解除休眠和促進萌發(fā)有特別重要的意義，這樣不僅為生產(chǎn)上提供實踐依據(jù)，而且可以為我們提供許多關于種子休眠機理的可能解釋。所有的活性物質(zhì)，如赤霉素、細胞分裂素和乙烯都是在種子中發(fā)現(xiàn)的。然而，外源施用同樣的這些活性物質(zhì)在種子上表現(xiàn)出了活性，而在種子內(nèi)部已經(jīng)預先存有或內(nèi)源產(chǎn)生的卻以不同的方式起著作用。目前的解釋是，種子休眠受促進物質(zhì)和抑制物質(zhì)之間的平衡來調(diào)節(jié)。激素被認為是生理過程的媒介體，它們將特殊的環(huán)境刺激轉(zhuǎn)換為生化信息。植物激素不同于動物激素，它的濃度特殊性大

49、于目標特殊性。它們是植物體內(nèi)的代謝產(chǎn)物并對植物的生長發(fā)育與休眠萌發(fā)起重要的調(diào)控作用。對種子萌發(fā)/休眠機理的研究，植物激素是一個主要方面。與種子生理有關的主要激素種類是赤霉素（ga）、脫落酸（aba）、細胞分裂素（cks）、生長素（iaa）和乙烯。其它的如內(nèi)酯、固醇、酚和硫胺素等也有類似激素的性質(zhì)，也和一些種子的生理活動有復雜的關系。據(jù)推測，激素是構(gòu)成種子萌發(fā)的生化過程的調(diào)節(jié)物。因而，激素被推崇為首要的萌發(fā)因子。同樣，關于激素與種子萌發(fā)及休眠的關系一直是種子生理生化研究的熱點，有很多研究報告及文獻綜述可供參考（beck and ziegler，1989；richards et al.，2001；

50、preiss，1982；fincher，1989；bewley, 1997；bewley and black, 1994；bewley and marcus a，1990；鄭光華，2004）。1、赤霉素（ga）與種子萌發(fā)眾所周知，赤霉素能有效的促進許多植物不休眠種子的萌發(fā)，打破休眠種子的休眠。萌發(fā)顯然依賴于赤霉素的充足供應或合成赤霉素的能力。在休眠種子中，赤霉素對于種皮強迫休眠（如大麥、萵苣）和胚休眠（如野燕麥）這兩類休眠種子都具有明顯的促進作用。其有效濃度一般在10-5-10-3 mol/l的范圍內(nèi)。在廣泛實驗的各類赤霉素中，低濃度的ga4和ga7混合物比ga3對解除休眠更有效。另外，有證據(jù)

51、說明，為了內(nèi)源赤霉素的合成，胚必需有糖的充分供應。所以，ga的最后合成可能與葡萄糖的異生作用有關。對于休眠的大麥和小麥種子，ga可以促進其萌發(fā)。從經(jīng)典的大麥種子萌發(fā)研究結(jié)果得知，有活力的谷物種子，吸水后，胚部合成并釋放ga，ga進入糊粉層，刺激糊粉層合成各種水解酶類，使貯藏物質(zhì)水解成可供胚生長的小分子化合物。最令人信服的證據(jù)是，將麥粒橫切，含胚半粒種子浸入水中，能產(chǎn)生-淀粉酶，水解淀粉為糖；不含胚的半粒種子則無此變化，而施加外源ga則又發(fā)現(xiàn)了-淀粉酶的產(chǎn)生。14c標記氨基酸的實驗結(jié)果表明，ga能促進蛋白質(zhì)的合成。使用m-rna合成抑制劑放線菌素d進行實驗證明，放線菌素d能抑制ga介導的m-rn

52、a合成的促進效應。目前，已經(jīng)查明，至少有十種以上的酶可被ga所誘導而釋放出來，其中包括水解葡萄糖苷、乳糖、纖維二糖、蛋白質(zhì)、肽、葡萄糖、麥芽糖和蔗糖等的各種酶。因此，ga被稱之為動員和利用胚乳物質(zhì)的激素。隨著對ga作用機制研究的深入，已經(jīng)從亞細胞水平找到ga促進種子萌發(fā)的新線索。諸如在-淀粉酶的活性提高之前，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、多核糖體已明顯增多，細胞膜體系中的膽堿也隨之增多，dna模板的效能提高，rna聚合酶活性增強等。早先的實驗結(jié)果就表明，當ga處理的種子已開始萌發(fā)時，-淀粉酶的活性還沒有增強，因而ga促進種子萌發(fā)時不是或至少不必要先通過提高-淀粉酶的活性來實現(xiàn)。胚是ga的第一個作用靶子，用標記的氨基

53、酸滲入實驗結(jié)果表明，當用ga處理野燕麥種子時，一天之后種子就可全部萌發(fā)，在浸種后第10-12小時，氨基酸已大量滲入胚部合成新的蛋白質(zhì)。因此，ga作用的分子基礎可能就是激活或解除某些受阻抑的基因（鄭光華，2004）。2、脫落酸（aba）與種子萌發(fā)為了探察抑制劑是否參與了種子的萌發(fā)與休眠，人們從一些植物的休眠胚中，分離出了多種抑制劑，其中在已鑒別的抑制劑中，脫落酸是主要的并且是最普遍的。它不僅存在于胚，而且存在于種子的其它部位。在通常一些情況下，例如同一個種不同品種之間或同一品種不同批次的種子之間，胚休眠的深度與脫落酸濃度之間存在著一定的相關性。而不同物種之間，胚休眠的深度與脫落酸濃度之間的相關性

54、還不明確。以上表明，脫落酸對種子的萌發(fā)主要起抑制作用。另外，與萌發(fā)平行發(fā)生的是，aba水平的減少和ga水平的增加。由于aba和ga具有共同的前體甲羥戊酸，有的學者猜測，增加萌發(fā)力的處理可能是使aba的途徑轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣蒰a的途徑（addicott和lyon, 1969）。目前，普遍認為aba和ga之間存在著拮抗效應。關于aba的作用機理，經(jīng)實驗驗證，它阻抑核酸的正常代謝，主要干擾核糖核酸（rna）的形成。從而阻抑了蛋白質(zhì)和有關酶的合成，使種子不能進行正常的代謝活動，一般認為抑制-淀粉酶的合成。當用外源aba處理棉籽離體胚時發(fā)現(xiàn)，羧肽酶與異檸檬酸酶的合成都受到了明顯的抑制。此外，aba還能抑制蛋白水

55、解酶的活性，主要是抑制酶的產(chǎn)生，并使得氨基酸積累，加入ga也不能解除aba的抑制效應（鄭光華，2004）。3、細胞分裂素（cks）與種子萌發(fā)miller于1956年發(fā)表了最早的一篇關于細胞分裂素對種子休眠作用方面報告，文中討論了激動素對黑暗條件下萵苣種子的作用（miller, 1956）。激動素可以解除黑暗條件下萵苣種子的休眠。進一步研究發(fā)現(xiàn)，激動素只有在不足以促進萌發(fā)的低光照下才起作用。在完全黑暗的條件下，激動素與其它細胞分裂素一樣，都只能打破一小部分萵苣種子的休眠，并且這些種子胚的伸出通常是不正常的，它們先生長出子葉。外源細胞分裂素對種子休眠的作用仍不明確。應用細胞分裂素促進種子萌發(fā)，但是

56、，這些細胞分裂素很少能比赤霉素更有效。細胞分裂素最顯而易見的是，當它與抑制物質(zhì)，特別是脫落酸aba，同時施用時表現(xiàn)出了拮抗效應。各種濃度赤霉素打破休眠的作用受脫落酸的抑制，而脫落酸的抑制效應又被細胞分裂素所克服。因此認為，細胞分裂素具有一種使第二種促進物質(zhì)（ga）起作用的“許可”作用（khan，1977）。4、乙烯與種子萌發(fā)乙烯對種子休眠與萌發(fā)的調(diào)控作用也是很重要的一個因子，在棉花和花生等種子的研究中曾令人信服地被證實。如當棉籽結(jié)束休眠浸種萌芽時，它會釋放出乙烯。如把尚未解除休眠的種子與之放在同一個培養(yǎng)容器中，則可以由于釋放出的乙烯而解除休眠，開始萌發(fā)。同時，乙烯 明顯促進其萌發(fā)。試驗表明，乙

57、烯不僅可以起到激動素的作用，而且還可以提高ga的效應。用乙烯與ga及激動素綜合處理人參種子可以完全取代低溫層積處理，從而在室溫條件下一次播種成苗，而任何單一因子處理對其萌發(fā)都是無效的。水浮蓮種子經(jīng)光照可以產(chǎn)生乙烯促進萌發(fā)，對不照光的種子用乙烯處理可使發(fā)芽率從0增加到80%（傅家瑞，1984）。利用乙烯生物合成前體1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸處理水浮蓮種子，也明顯提高了發(fā)芽率。說明有了乙烯合成前體，加速乙烯合成，也提高發(fā)芽率。另外，加入乙烯生物合成抑制劑，氨基氧乙酸與cocl2，發(fā)現(xiàn)明顯抑制了其種子的萌發(fā)。ga在和黑暗中無促進萌發(fā)的作用，在光照條件下用ga處理也明顯促進發(fā)芽。越來越多的研究表明，氣態(tài)激素乙烯在解除種子休眠方面可能也有重要作用。在逆境條件下外源乙烯或乙烯利的作用是特別明顯。據(jù)報道，在解除萵苣、蒼耳等種子休眠方面細胞分裂素和乙烯或乙烯利有增效作用或協(xié)同作用（khan，1977）。在逆境aba對萵苣種子的抑制作用期間，或