一株脫氮光合細菌的分離、篩選及性能研究

1、本 科 畢 業(yè) 設(shè) 計 (論 文)一株脫氮光合細菌的分離、篩選及性能研究Isolation and Characterization of a Denitrifying Photosynthetic Bacteria Strain 學 院： 專業(yè)班級： 學生姓名： 學 號： 指導教師： 2011年 6月畢業(yè)設(shè)計（論文）中文摘要一株脫氮光合細菌的分離、篩選及性能研究摘 要：為了解決食品廠污水處理問題，本實驗篩選出一株可高效脫氮的光合細菌來降解污水。從自然界及市售光合細菌液中分離出數(shù)株光合細菌，將其接種到自制模擬廢水中，測定其去除總氮能力，選取去除率最高的一株光合細菌，測定其去除總磷、氨氮、化學需

2、氧量的能力，并對其進行形態(tài)觀察。結(jié)果表明，用篩選到的光合細菌SY-7降解模擬廢水，總氮去除率為67.99 %，氨氮去除率為58.20 %，總磷去除率為35.91 %，化學需氧量去除率為45.37 %；SY-7經(jīng)革蘭氏染色結(jié)果為陰性，短桿菌，大小為（0.51.0）（1.03.0）m,液體純培養(yǎng)物為粉紅色，平板菌落為圓形，橘黃色。關(guān)鍵詞：光合細菌；富集；分離；脫氮率；形態(tài)觀察畢業(yè)設(shè)計（論文）外文摘要Isolation and characterization of a denitrifying photosynthetic bacteria strain Abstract: The purpose

3、 of my experiment was to get a photosynthetic bacteria strain with high ability of denitrification and to provide technical information for application of photosynthetic bacteria in the cleaning of sewage from food plant. Several strains of photosynthetic bacteria were isolated from nature and merch

4、ant photosynthetic bacteria product. They were used to treat home-made simulated sewage and the ability of denitrification was tested. Finally one strain of photosynthetic bacteria with highest denitrification capability was selected and observed, then its ability of eliminating total phosphor, ammo

5、niacal nitrogen and chemical oxygen demand(COD) was also tested. The result showed that the selected photosynthetic bacteria SY-7 moved 67.99 % of total nitrogen, 58.20 % of ammoniacal nitrogen,35.91 % of total phosphor and 45.37 % of COD. SY-7 was belong to brevibacterium and Gram-negative. Its siz

6、e is （0.51.0）（1.03.0）m. The liquid culture was pink and the colony was round and saffron yellow.Keywords: photosynthetic bacteria; concentration；selection；the rate of denitrification；morphology observation 目 錄1 緒論11.1 光合細菌概述11.2 光合細菌在各個領(lǐng)域的應(yīng)用及國內(nèi)外研究現(xiàn)狀31.3 本研究的目的及意義52 材料與方法62.1 材料62.2 主要實驗儀器82.3 方法83 結(jié)

7、果分析113.1 光合細菌的富集113.2 光合細菌的分離123.3脫氮光合細菌的篩選123.4 SY-7光合細菌形態(tài)特征觀察164 討論18結(jié)論20致謝21參考文獻221 緒論1.1 光合細菌概述光合細菌 ( PSB)是自然界中廣泛存在的比較古老并具有原始光能合成體系的原核生物, 屬于水圈微生物的一種，在自然界分布極廣，幾乎遍布于土壤、泥炭、 沼澤、淡水、海水、水生植物根系，甚至在90的溫泉、冰天雪地的南極海岸、 以及含30%鹽的水體中也能找到它的蹤跡，它是地球上物質(zhì)和能量循環(huán)中不可缺少的一大類群微生物。因其細胞內(nèi)具有細菌葉綠素和類胡蘿卜素，常使用光合細菌自下而上的水體或固體呈現(xiàn)出紅色。PS

8、B是生命演化中的過渡類型, 具有多種生理功能, 代謝類型極為多樣, 有光能自養(yǎng)、異養(yǎng)和混養(yǎng)多種營養(yǎng)生長方式, 具有光合、固碳、降解大分子有機物、固氮、脫氮、硝化、反硝化、硫化物、氧化等代謝方式,在養(yǎng)殖用水、有機廢水和生活污水的凈化處理中顯示出其強有力的優(yōu)勢1。1.1.1 光合細菌的分類根據(jù)在光合作用中是否產(chǎn)生氧氣，可將光合細菌分為產(chǎn)氧光合細菌和不產(chǎn)氧光合細菌兩大類。其中藍細菌為產(chǎn)氧光合細菌的代表；不產(chǎn)氧光合細菌主要包括外硫紅螺菌科、著色菌科、綠色硫細菌、紫色非硫細菌、多細胞絲狀綠細菌、螺旋桿菌科、含細菌葉綠素的專性好氧菌等7大類群50個屬2。1.1.2 光合細菌的形態(tài)學特征光合細菌都是革蘭氏陰

9、性菌, 其形態(tài)多樣，有球狀、桿狀、螺旋狀、弧狀、卵狀、環(huán)狀、半環(huán)狀、絲狀, 也可以隨著培養(yǎng)條件、生長階段以及菌種的不同變?yōu)殒湢睢?鋸齒狀、格子狀、網(wǎng)球狀等；球狀細胞的直徑一般為0.3-0.6 m, 桿狀為0.5-1.0 m0.9-2.0 m,螺旋狀細胞通常為0.7-1.0 m 3-5 m；在運動方面有通過鞭毛運動的, 有滑行運動的,或者不運動的；主要以二分裂方式進行繁殖, 少數(shù)為出芽生殖；一般沒有形成芽孢的能力3。光合細菌體內(nèi)沒有葉綠體和類囊體, 但是具有雙層膜的類似葉綠體的結(jié)構(gòu), 在此結(jié)構(gòu)中有類似于植物葉綠素a的光合色素, 即細菌葉綠素, 有的還有大量的類胡蘿卜素。因此PSB會呈現(xiàn)出一定的顏

10、色，一般而言，紅螺菌科和著色菌科的種類呈紅色、粉紅色、紫色或茶褐色，這是因為其類胡蘿卜素的高濃度蓄積，掩蓋了細菌葉綠素的顏色；綠菌科的種類呈綠色。那些類胡蘿卜素含量較少的種類或缺少類胡蘿卜素的變異株便顯示出細菌葉綠素的顏色4。1.1.3 光合細菌的生理特性1.1.3.1 代謝方式光合細菌有獨特的生理代謝功能，在光照條件下，能利用低級脂肪酸、多種二羧酸、醇類、糖類、芳香族化合物等低分子有機物作為光合作用的電子供體進行光能異養(yǎng)或光能自養(yǎng)生長；在微好氧或黑暗好氧條件下，它們又能以各種終端電子受體（O2、硝酸鹽或有機物）進行異養(yǎng)或自養(yǎng)生長,隨環(huán)境條件的變化改變其獲得能量的方式，改變自身的代謝方式5。1

11、.1.3.2 最適生長條件光合細菌在10 45 范圍內(nèi)均可生長繁殖，最佳溫度在30 40 ；適合絕大多數(shù)光合細菌生長的最佳pH值范圍在7.0-8.0之間；鈉、鉀、鈣、鈷、 鎂、 鐵等是光合細菌生理代謝中的必需元素6。 1.1.3.3 能量獲取形式光合細菌的獲能形式有三種：一是通過光合作用獲得能量。只要供氫體和碳源合適，所有光合細菌都能在光照、厭氣條件下 ,通過光合磷酸化獲得能量；二是通過脫氮或發(fā)酵獲得能量 ,這是在厭氣、黑暗條件下進行的,由有機酸產(chǎn)生能量，或在反硝化過程中從有機物放出能量；三是通過呼吸作用獲得能量 ,這是在有氧、黑暗條件下進行的,從有機物的氧化磷酸化中取得能量。PSB在利用光能

12、進行光合反應(yīng)時，因用于還原的CO2供氫體不同，其反應(yīng)式可分為三類：第一類以硫代硫酸鹽為供氫體，第二類以硫化氫為供氫體，第三類以有機物為供氫體4。1.1.4 光合細菌的生態(tài)特征1.1.4.1 光合細菌的生態(tài)位光合細菌主要生存于水域中厭氧層上部，可以下層的硫酸還原菌和細菌發(fā)酵生成的硫化氫、二氧化碳為營養(yǎng)源進行光合作用，轉(zhuǎn)換成其自身化合物，其中一部分又還原回到厭氧層。從另一個角度講，可以說光合細菌阻止在厭氧層生成的物質(zhì)移向好氧層，光合細菌在此起著生物濾器的作用，可阻止厭氧層生成的毒性物質(zhì)硫化氫擴散到好氧層，使生活于好氧層中的水生生物、水生動物和水生植物得以正常生長繁殖7。1.1.4.2 光合細菌在氮

13、元素循環(huán)中的作用光合細菌大多數(shù)種類能產(chǎn)生固氮酶而具有固氮能力。近年來的研究還發(fā)現(xiàn)光合細菌的某些種類具有脫氮活性，如Rhodobacter sphaeroides S株，當有硝酸鹽存在時，能在缺氧的條件下將其還原成氮氣。因此，在利用其處理高濃度有機廢水時，不僅能高效地去除BOD，同時還兼有良好的除氮效果。1.1.4.3 光合細菌對高濃度磷酸鹽的去除據(jù)研究，紅螺菌科的某些種類對磷酸鹽的耐受性很強。如球形紅桿菌在磷酸鹽濃度高達50 mM的培養(yǎng)基中仍能良好生長，實驗研究還表明，該菌能在一定條件下能大量積累多聚磷酸鹽。這表明利用PSB凈化水質(zhì)，在去除BOD的同時，可以實現(xiàn)除磷的效果。1.1.4.4 光合

14、細菌在硫元素循環(huán)中的作用由于光合細菌能將硫化氫、硫代硫酸鹽等轉(zhuǎn)化為元素硫或硫酸，因而在自然界的硫循環(huán)中占有重要位置。例如，可在水域厭氧層上部阻止硫化氫向好氧層擴散；還有，水稻從營養(yǎng)生長進入生殖期時，水稻根部的氧化能力增強，使根圈呈厭氧狀態(tài)，這時的硫酸鹽還原菌迅速增殖，在水稻根際發(fā)生硫化氫以及腐胺、尸胺等積累，從而使水稻根受到損傷。如果此時光合細菌大量生長，便會除去上述有毒物質(zhì)，有利于水稻的生長發(fā)育4。1.2 光合細菌在各個領(lǐng)域中的應(yīng)用及研究現(xiàn)狀20世紀 80年代以前, 國內(nèi)外 PSB的應(yīng)用主要在污水凈化、水產(chǎn)畜牧養(yǎng)殖和農(nóng)業(yè)增產(chǎn)等方面，之后由于 PSB含有豐富的營養(yǎng)藥用成分及其獨特的生物轉(zhuǎn)化功能

15、,在醫(yī)藥保健品方面的應(yīng)用研究有了新的發(fā)展。當前在國外, PSB 已在保健食品中應(yīng)用,但在國內(nèi) PSB尚未列入可用于保健食品的菌種名單內(nèi), 僅沼澤紅假單胞菌已獲準用于飼料添加劑。以下主要介紹PSB在污水和養(yǎng)殖水凈化上的應(yīng)用8。1.2.1 光合細菌凈化水質(zhì)的作用機理目前, 常用于有機廢水處理的光合細菌主要有紅螺菌科的膠質(zhì)紅假單胞菌和球形紅假單胞菌。這類細菌中的一些種屬，其細胞中的載色體顆粒中密集地包含著細菌葉綠素和類胡蘿卜素, 能夠進行光合磷酸化反應(yīng)和光氧化還原反應(yīng)。在好氧條件下, 胞內(nèi)缺少這種載色體, 但只要將其置于光照厭氧條件下,載色體就會很快形成,代謝途徑迅速轉(zhuǎn)化，并將有機酸異化,與同化的氧

16、化還原反應(yīng)和光氧化還原反應(yīng)緊密地聯(lián)結(jié)起來。光合細菌中的紅螺菌既不像嚴格厭氧的甲烷細菌那樣對氧的存在高度敏感,可以在有氧條件下分解有機物,通過氧化磷酸化取得能量供其生長；又不像好氧的活性污泥菌膠團細菌那樣受污水中氧濃度的限制,可以利用光能進行高效的能量代謝,即使在微弱的光照條件下也能進行,其中有機物作為供氫體被利用。這種隨環(huán)境條件的變化而靈活地改變代謝類型的特性, 是光合細菌能夠凈化水質(zhì)的主要原因9。隨著光合細菌被廣泛使用 ,人們發(fā)現(xiàn)它的生理生態(tài)功能之所以得到發(fā)揮 ,是因為有自然界中其它有益菌的幫助。生物學家的研究表明 ,自然界的有機污染物是通過微生物的協(xié)同作用達到凈化目的的。首先是放線菌、芽抱

17、桿菌、酵母菌、乳酸菌等有益菌把碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生低分子糖類、低級脂肪酸、氨基酸等小分子物質(zhì),然后才有光合細菌利用小分子有機物迅速增殖,并取代初級分解者的地位。這是因為光能異養(yǎng)型細菌能利用光能，對比其它非光能異養(yǎng)細菌而言，能更高效且迅速的分解小分子有機物,所以其很容易成為優(yōu)勢菌種。隨著有機殘基濃度不斷增加,光合細菌逐漸衰老死亡,最終由活性污泥微生物和藻類取代,將污水凈化10。1.2.2 光合細菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的應(yīng)用在養(yǎng)殖過程中常因養(yǎng)殖對象排泄物及殘餌等有機物的積累造成水體污染， NH3-N濃度高，導致水質(zhì)敗壞，有害菌大量生長，從而導致水產(chǎn)動物缺氧、生病、乃至死亡。生產(chǎn)上一般采用換水的

18、解決辦法，但存在一些弊端，如難以保持養(yǎng)殖水體適當肥度及增加養(yǎng)殖成本。隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展和集約化程度地不斷提高，水源水及養(yǎng)殖自身污染日益加劇，為有效控制養(yǎng)殖水質(zhì)惡化問題，而又不影響?zhàn)B殖產(chǎn)品質(zhì)量，光合細菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用越來越廣泛，并日益成為發(fā)展無公害水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的優(yōu)選投入品。通過施用光合細菌，利用其獨特的生理特點消耗養(yǎng)殖水體中有機物、氨氮及硫化物等，通過反硝化作用去除水體中的亞硝酸鹽等，從而促進水體中養(yǎng)殖對象排泄物及殘餌加速分解并被光合細菌利用，大大降低水中有機質(zhì)、化學耗氧量、氨氮、硫化物等含量，使溶解氧含量增加。除此之外，因光合細菌無毒、無化學殘留、無副作用、無抗藥性問題，能有效改善養(yǎng)

19、殖生態(tài)環(huán)境，減少病害的發(fā)生，為水養(yǎng)殖帶來了可觀的經(jīng)濟效益。伊玉華11報道稱，按日用量740 mL使用光合細菌的養(yǎng)蝦池塘中，次日便可提高DO，連續(xù)投放2天后，DO由使用前的5.7 mg/L提高到10.98 mg/L，較未使用光合細菌的池塘提高DO5.4 mg/L；而氨氮含量由0.36 mg/L降至0.08 mg/L；富營養(yǎng)化類型的藻類數(shù)量明顯下降，具有餌料價值的藻類數(shù)量增加。王夢亮等7利用沼澤紅假單胞菌和類球紅細菌純培養(yǎng)物1:1的混合物（pH 值 7.5，活菌數(shù)1.6億個/mL）按 30 kg/hm2用量一次性灑入魚塘，待 PSB大量增殖并趨于穩(wěn)定時，試驗池水質(zhì)比對照組有明顯改善，其中溶解氧增加

20、68%，COD 下降 21%，氨氮下降 58.7%，硝酸氮下降 29.4%，硫化物下降77.4%。施安輝等7分別用沼澤紅假單胞菌、綠色紅假單胞菌、膠質(zhì)紅假單胞菌和球形紅假單胞菌（菌密度均在30億個/mL以上）在室內(nèi)凈化污水，使用質(zhì)量濃度10 mg/L，10 d 后測定COD，分別下降了9.89 % 、2.85 %、9.34 %和11.51 % ，氨氮分別下降了34.51 %、 13.33 %、 28.97 % 和18.37 %,亞硝酸鹽分別下降了29.27 %、13.19 %、30.34 %和16.25 %。1.2.3 光合細菌在污水處理中的應(yīng)用光合細菌在凈化污水方面的卓越貢獻已經(jīng)得到認可，如

21、應(yīng)用到味精廢水、檸檬酸廢水、酒糟廢水、淀粉廢水、啤酒廢水、豆制品廢水、中藥廢水、養(yǎng)豬廢水、 苯甲酸廢水、生活污水、皂素廢水、印染廢水、焦化廢水等的處理中。國內(nèi)應(yīng)用光合細菌法最多的是華東地區(qū), 如上海豆制品廠、浙江輕工研究所及上海交通大學在這方面有較多的研究。研究表明光合細菌不僅對多種有機物有較強的分解轉(zhuǎn)化能力, 而且還耐受紫外線, 對氯、 鹽分及氰、酚毒物耐性較強,可在惡劣條件下處理有機廢水。有試驗研究表明，光合細菌對化學需氧量（COD）為52 840 mg /L的豆制品廢水處理12 h后，其去除率達92.7 %；對COD為3 860 mg /L的淀粉廢水處理72 h后, 去除率達99.5 %

22、10。1.2.4 光合細菌的發(fā)展前景二十一世紀將是生物技術(shù)全面發(fā)展、廣泛應(yīng)用，對人類生存產(chǎn)生巨大影響的世紀，而PSB則屬于生物工程中最具前景的領(lǐng)域。隨著對光合細菌研究日益深入 光合細菌在現(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)、農(nóng)業(yè)、環(huán)保等產(chǎn)業(yè)中應(yīng)用越來越廣泛。同時，關(guān)于光合細菌的開發(fā)應(yīng)用還存在著諸多問題，比如：（1）光合細菌種類繁多，但進行具體研究的卻是少數(shù)的幾種光合細菌，這就會限制對光合細菌的利用；（2）對已知作用結(jié)果的光合細菌未能及時投入生產(chǎn)、創(chuàng)造效益或投入生產(chǎn)后不能充分發(fā)揮其作用等問題；因此，需要科研人員對其不斷深入研究，尤其是在工藝路線以及高效菌種的分離篩選與菌種改造方面不斷完善，光合細菌的應(yīng)用才能更加廣泛。今后

23、這一領(lǐng)域的研究可能從以下幾個方面進一步深入：（1）高效、多功能的優(yōu)良菌種的篩選與改良；（2）利用基因工程技術(shù)構(gòu)建易生產(chǎn)、保存、繁殖和具有優(yōu)良性狀的工程菌；（3）固定化光合細菌的研究與應(yīng)用7。1.3 本研究的目的及意義近年來我國食品行業(yè)迅猛發(fā)展，規(guī)?；潭纫苍絹碓酱?，除了對食品質(zhì)量和衛(wèi)生有了更高的要求外，對食品生產(chǎn)所產(chǎn)生的廢水處理也越來越重視，食品工廠建廠時都要求規(guī)劃污水處理設(shè)施。食品廠污水處理難度非常大，例如，味精生產(chǎn)中排放的污水量非常大，除了高的 COD外,還有高濃度氨氮、多種氨基酸和有機酸；檸檬酸生產(chǎn)廢水中主要含有淀粉、蛋白質(zhì)、各種有機酸、生產(chǎn)菌體所必須的酶、發(fā)酵殘留物、葡萄糖、氨氮和脂肪

24、等有機物；豆制品廢水中BOD、COD 值較高,全氮和氨氮含量也較高,屬于高濃度的廢水。由此看出，食品廠廢水中一般總氮含量較高，因此本實驗以篩選脫氮能力強的光合細菌為目標13。目前廢水治理系統(tǒng)常用活性污泥法、生物膜法和厭氧法?；钚晕勰喾ê蜕锬しㄋ璧臋C械化程度高，維護管理復雜, 占地面積大, 而且只能用于處理低濃度有機廢水；厭氧法雖能處理高濃度有機廢水,但處理時啟動慢，對溫度要求也高。光合細菌能以多種有機酸和醇類等有機化合物作為光合作用的供氫體和碳源, 而且能耐受高濃度有機物,并具有較強的分解和去除有機物的生理特性。因此,在自然光照和微好氧條件下,能對許多高濃度有機廢水進行高效率的處理, 并且

25、在處理前不需對廢水進行稀釋。與活性污泥法、生物膜法和厭氧法相比，光合細菌處理法具有節(jié)約電能、水能、設(shè)備及運轉(zhuǎn)費用等優(yōu)點,而所得的副產(chǎn)品菌體污泥還可綜合利用，作為魚和家畜的餌料或種植業(yè)肥料，不造成二次污染10。所以能篩選出一株脫氮光合細菌并應(yīng)用到實際中，具有重要的意義。2 材料與方法2.1 材料2.1.1 菌種來源 本實驗中菌種有兩大來源：一是通過周邊地區(qū)采樣，多次富集、分離、純化后獲得；二是購買市售的光合細菌液，再經(jīng)過分離純化獲得。采樣地點見表1，市售菌液來源見表2。表1 采樣地點編號采樣地點SY1花果山水庫魚塘底泥SY2連島在海一方沙灘沙泥SY3連島圍海造田地淤泥SY4淮海工學院污水池底泥S

26、Y5連云港市新浦某魚塘底泥表2 市售光合細菌制劑名稱及來源編號名稱廠家SS1淡海水通用光合細菌廣州大禹水族有限公司SS2金雙喜正紅A系列超級復合光合細菌天津假日漁業(yè)水族銷售公司SS3光合細菌PSB晉江市奇美寵物有限公司SS4光合細菌菌種江西稻草人農(nóng)業(yè)園2.1.2 培養(yǎng)基2.1.2.1 富集培養(yǎng)基本實驗使用了兩種富集培養(yǎng)基，成分如下：（1）小林達治（1977）培養(yǎng)基13氯化銨1.0 g，氯化鈉0.5-2.0 g，碳酸氫鈉1.0 g，磷酸氫二鈉0.2 g，醋酸鈉1-5 g，七水合硫酸鎂0.2 g，生長輔助因子貯液1 mL，微量金屬貯液10 mL，pH 7.0，蒸餾水1000 mL。微量金屬貯液配方

27、：六水合三氯化鐵5 mg，五水合硫酸銅0.05 mg，硼酸1 mg，四水合氯化錳0.05 mg，七水合硫酸鋅1 mg，六水合硝酸鈷0.05 mg，蒸餾水1000 mL。（2）紅螺菌科富集培養(yǎng)基14磷酸二氫鉀0.5 g，醋酸鈉3 g，七水合硫酸鎂0.2 g，六水合氯化鈣0.05 g，酵母膏0.05 g，丙酸鈉0.3 g，磷酸氫二鉀0.3 g，硫酸銨0.3 g，氯化鈉0.1 g，pH 7.2，蒸餾水1000 mL。2.1.2.2 分離培養(yǎng)基14光合細菌分離培養(yǎng)基成分如下：酵母膏3 g，蛋白胨3 g，六水合氯化鈣0.3 g，七水合硫酸鎂0.5 g，pH 6.8，蒸餾水1000 mL，瓊脂2 %。2.

28、1.2.3 擴大培養(yǎng)基13光合細菌擴大培養(yǎng)基的成分如下：醋酸鈉5 g，氯化銨1 g，七水合硫酸鎂0.2 g，磷酸二氫鉀0.6 g，磷酸氫二鉀0.4 g，酵母膏0.1 g，pH 7.0，蒸餾水1000 mL。2.1.3 人工模擬廢水在本實驗中將培養(yǎng)出的菌液接種到自制的人工模擬廢水中，定時測定其總氮含量，從而篩選到脫氮能力強的光合細菌菌株。人工模擬廢水的成分如下（g/L）：葡萄糖7.2，酵母膏1.6，磷酸二氫鉀0.28，氯化鈣0.36，七水合硫酸鎂0.48，碳酸氫鈉0.48，氯化銨1.2，一水合硫酸錳0.12，七水合硫酸亞鐵0.11。2.2 主要實驗儀器本實驗主要使用的儀器設(shè)備見表3。表3 實驗儀

29、器名稱、型號及廠家名稱型號廠家紫外可見分光光度計754N上海精科立式壓力蒸汽滅菌器筒01J2003-04上海東亞壓力容器制造有限公司漩渦混合器XW-80A上海青浦滬西儀器廠恒溫恒濕箱SPX-250C上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠單人單面凈化工作臺SW-CJ-1FD蘇州凈化設(shè)備有限公司高速冷凍離心機MIKRO 22R德國進口2.3 方法2.3.1 光合細菌富集（1）取20 g泥樣，放于250 mL三角瓶中；（2）加入液體富集培養(yǎng)基200 mL，與泥樣振蕩混勻，液面注入0.5 cm高液體石蠟，棉塞封口，造成厭氧環(huán)境；（3）在溫度30 、60 w白熾燈的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至培養(yǎng)液呈紅色或紅棕色；（4）

30、移取紅色或紅棕色光合細菌的富集液1mL至裝有已滅菌富集培養(yǎng)液5 mL的試管中，液面注入0.5 cm高滅菌液體石蠟，蓋上試管蓋，保持厭氧條件；（5）連續(xù)富集2-3次，使欲要分離的光合細菌成為優(yōu)勢種。 2.3.2 光合細菌分離（1）取富集液1mL,梯度稀釋至10-6；（2）選擇10-4，10-5，10-6三個梯度的稀釋液，涂布于分離培養(yǎng)基平板，涂布量為100 L；（3）將平板置于溫度30 、60 w白熾燈的生化培養(yǎng)箱中，厭氧培養(yǎng)，直到出現(xiàn)粉色至紅色的單菌落。本實驗中為了制造厭氧環(huán)境，使用了兩種分離方法：一是雙層平板分離法；二是將涂布有稀釋液的單層平板置于干燥器中，用真空泵抽去其中的空氣，再充入氮氣

31、。通過這兩種方法造成厭氧環(huán)境。；（4）挑取不同特征的單菌落在分離培養(yǎng)基平板上進行劃線分離2-3次，得到純的單菌落；（5）將分離出的單菌落接種到擴大培養(yǎng)基中，直至液體變?yōu)榉凵良t色，得到光合細菌純菌液。2.3.3 脫氮光合細菌的篩選在裝有自制模擬廢水的250 mL三角瓶中，接入純菌液，接種量為10 %，在溫度30 、60 w白熾燈的生化培養(yǎng)箱中，厭氧培養(yǎng)。分別于6天、9天后以原模擬廢水為基準測定其總氮含量，挑選出降氮能力最強的菌株，再測定其去除氨氮、總磷和化學需氧量（COD）的能力。2.3.3.1 總氮測定方法堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法15（1）取10.00 mL試樣（含氮量超過100 g時

32、，可減少取樣量并加水稀釋至10 mL），置于25 mL比色管中；（2）加入5 mL堿性過硫酸鉀溶液，塞緊磨口塞，用布或繩等方法扎緊瓶塞，以防彈出；（3）將比色管置于滅菌器中，加熱使溫度達到120-124 后開始計時，保持此溫度加熱半小時；（4）冷卻，開閥放氣，取出比色管并冷至室溫；（5）加鹽酸（1+9）1 mL，用水稀釋至25 mL標線，混勻；（6）移取部分溶液至10 mm石英比色皿中，在紫外分光光度計上，以無氨水作參比，分別在波長220與275 nm處測定吸光度。（7）空白試驗：空白試驗除了用10mL無氨水代替試樣外，采用上述相同步驟測定；（8）標準曲線的繪制：分別吸取0、0.50、1.00

33、、2.00、3.00、5.00、7.00、9.00、10.00 mL硝酸鉀標準使用溶液于25mL比色管中，用水稀釋至10 mL，剩余步驟同（1）-（6）；（9）測得吸光度后，按下式計算：AS = AS220 - AS275Ab = Ab220 - Ab275At = AS Ab式中：AS220 、AS275分別為標準溶液在220 nm和275 nm波長的吸光度； Ab220 、Ab275分別為空白溶液在220 nm和275 nm波長的吸光度。按At值與相應(yīng)的NO3N含量（g）繪制標準曲線。（10）結(jié)果表示：試樣的吸光度經(jīng)處理后，在標準曲線上查出相應(yīng)的總氮g數(shù)，總氮含量為：c(mg/L) = m

34、/v式中：m試樣測出含氮量，g； V測定用試樣體積，mL。2.3.3.2 總磷測定方法鉬酸銨分光光度法16（1）消解：取試樣10 mL于25 mL比色管中（若試樣含磷量過高，適當減少試樣體積），加入2 mL過硫酸鉀，塞緊磨口塞，用布或繩等方法扎緊瓶塞，以防彈出，將比色管置于滅菌器中，加熱使溫度達到120-124 后開始計時，保持此溫度加熱半小時，冷卻后取出，用水稀釋至25 mL標線：（2）發(fā)色：像消解液中加入0.5 mL抗壞血酸，混勻，30秒后加1 mL鉬酸鹽溶液，充分混勻，在室溫下放置15分鐘；（3）分光光度測量：移取部分溶液至10 mm玻璃比色皿中，在700 nm波長處，以水作參比，測定吸

35、光度；（4）空白試驗：空白試驗除了用10 mL無氨水代替試樣外，采用上述相同步驟測定；（5）標準曲線繪制：分別吸取0、0.25、0.50、1.50、2.50、5.00、7.50 mL磷酸二氫鉀標準使用溶液于25 mL比色管中，用水稀釋至10 mL，剩余步驟同（1）-（3），測定的吸光度扣除空白試驗的吸光度后，與相應(yīng)的P含量（g）繪制標準曲線（6）結(jié)果表示：試樣的吸光度扣除空白試驗的吸光度后，在標準曲線上查出相應(yīng)的總磷g數(shù)，總磷含量為：磷酸鹽（P，mg/L） = m/V式中：m試樣測出的含磷量，g； V測定用試樣體積，mL。2.3.3.3 氨氮測定方法納什試劑分光光度法17（1）標準曲線的繪制：

36、取0、0.25、0.50、1.50、2.50、3.50、5.00 mL氯化銨標準使用溶液于25 mL比色管中，加水至25 mL標線，加0.5 mL酒石酸鉀鈉溶液，混勻，加0.75 mL納什試劑，混勻，放置10分鐘后在420 nm波長處，以水作參比，測定吸光度，扣除0號的吸光度后，與相應(yīng)的氨氮含量（g）繪制標準曲線；（2）試樣測定：取適量的水樣（使氨氮的含量不超過50g），加水稀釋至25 mL標線，剩余步驟同上；（3）空白試驗：以無氨水代替水樣，剩余步驟同上；（4）結(jié)果表示：試樣的吸光度扣除空白試驗的吸光度后，在標準曲線上查出相應(yīng)的氨氮g數(shù)，氨氮含量為：氨氮（N,mg/L） = m/V式中：m試

37、樣測出的氨氮含量，g； V測定用試樣體積，mL。2.3.3.4 化學需氧量COD測定方法重鉻酸鉀法18（1）取10.00 mL試樣（或適量試樣稀釋至10.00 mL）置于250 mL磨口的回流錐形瓶中，準確加入5.00 mL重鉻酸鉀標準溶液及數(shù)粒洗凈的玻璃珠，連接磨口回流冷凝管，從冷凝管上口緩慢地加入15 mL硫酸-硫酸銀溶液，輕輕搖動錐形瓶使溶液混勻，加熱回流2小時（自開始沸騰時計時）。若廢水中氯離子含量超過30 mg/L時，應(yīng)先把0.2 g硫酸汞加入錐形瓶中，再加廢水；（2）冷卻后，用50 mL水從上部慢慢沖洗冷凝管壁，取下錐形瓶；（3）溶液再度冷卻后，加3滴試亞鐵靈指示劑，用硫酸亞鐵銨標

38、準溶液滴定，溶液的顏色由黃色經(jīng)藍綠色至紅褐色即為終點，記錄其用量；（4）空白測定：測定試樣的同時，以10.00 mL蒸餾水，按上述步驟作空白試驗，記錄滴定空白是硫酸亞鐵銨的用量；（5）結(jié)果表示：CODCr(O2，mg/mL) = ( V1- V0)*c*8*1000/V式中：c硫酸亞鐵銨標準溶液的濃度，mol/L； V0滴定空白時硫酸亞鐵銨標準溶液的用量，mL；V1滴定試樣時硫酸亞鐵銨標準溶液的用量，mL； V試樣的體積，mL；8氧（1/2O）摩爾質(zhì)量，g/mol。2.3.4 菌液、菌落及菌體形態(tài)特征觀察觀察光合細菌在液體培養(yǎng)基中的顏色；觀察其在固體分離培養(yǎng)基上的菌落特征；對其進行革蘭氏染色，

39、在顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。3 結(jié)果分析3.1 光合細菌的富集3.1.1 第一次富集為區(qū)分兩種富集培養(yǎng)基培養(yǎng)出的富集液，現(xiàn)將其編號：小林達治培養(yǎng)基所得富集液編號為SY1、SY2、SY3、SY4、SY5,，紅螺菌科富集培養(yǎng)基所得富集液編號為SY、SY、SY、SY、SY。五種樣品在同一種富集培養(yǎng)基中出現(xiàn)的顏色變化不同，變化出現(xiàn)的時間也不同；同一樣品在兩種不同培養(yǎng)基中出現(xiàn)的顏色變化也不同，變化出現(xiàn)時間也不同。第一次富集的時間為12天，10瓶富集液的顏色變化過程見表4。表4 第一次富集液在第6、9、12天的顏色變化編號6天9天12天SYI無變化出現(xiàn)白色絮狀物無其它變化SY2無變化石蠟底層出現(xiàn)灰色膜液體渾濁

40、，呈灰色SY3無變化出現(xiàn)灰色絮狀物液體渾濁，呈乳白色SY4無變化液體呈紅色液體呈深紅色SY5無變化石蠟底層出現(xiàn)黑膜無其它變化SY無變化無變化液體呈櫻桃紅色SY無變化無變化液體呈暗粉色SY無變化無變化液體呈黃色SY無變化液體呈綠色，并有大量紅色絲狀物液體呈淺褐色SY無變化石蠟底層出現(xiàn)灰色膜液體呈鮮紅色根據(jù)各個錐形瓶的顏色變化，挑選出富集效果較好的6瓶進行第二次富集，6種富集液分別是SY4、SY、SY、SY、SY、SY。其中，SY4在第7天就呈現(xiàn)出微紅色，逐漸加深為深紅色；SY在第11天才出現(xiàn)淺粉色，第12天就變?yōu)闇\櫻桃紅色；SY在第10天變?yōu)槲⒓t色，再變?yōu)榉凵?；SY在第11天變?yōu)闇\黃色，第12天

41、黃色加深；SY在第7天變?yōu)闇\綠色，之后兩天綠色加深，第10天轉(zhuǎn)為紅色，第12天轉(zhuǎn)為淺褐色；SY在第11天變?yōu)闇\綠色，第12天突然變?yōu)轷r紅色。3.1.2 第二次富集將上述6種富集液再次接入到新的富集培養(yǎng)基中進行第二次富集，此次富集在1-4天內(nèi)就出現(xiàn)各種顏色變化，見表5。表5 第二次富集液在第3、6、9天的顏色變化編號3天6天9天SY4液體呈淺粉色液體呈深紅色液體呈深紅色SY液體呈深粉色液體呈深紅色液體呈深紅色SY無變化瓶底有大量綠色物，液體呈淡紅色液體呈深紅色SY液體渾濁，呈淺黃色液體呈黃色液體呈深黃色SY瓶底有很淺的粉色物液體呈紅色液體呈深紅色SY液體呈鮮紅色液體呈深紅色液體呈深紅色3.2 光

42、合細菌的分離根據(jù)第二次富集的效果，淘汰SY，將其余5種富集液稀釋后，在分離培養(yǎng)基平板上涂布，另外將從市場上購得的4種光合細菌液SS1、SS2、SS3、SS4也經(jīng)稀釋后涂布，3天后菌落即長出，挑取不同特征的菌落，再進行2-3次劃線分離，得到單菌落。最終一共分離到37個單菌落， 其中從SY4 中分離到4個，SY中分離到6個，SY中分離到9個，SY中分離到4個，SY中分離到5個，SS1中分離到0個，SS2中分離到5個，SS3中分離到2個，SS4中分離到2個。將這些單菌落接種到液體擴大培養(yǎng)基中,培養(yǎng)成純菌液。3.3 脫氮光合細菌的篩選將第二次光合細菌富集液和經(jīng)過15天擴大培養(yǎng)得到光合細菌純菌液接種到自

43、制的人工模擬廢水中，置于30 、60 w白熾燈的生化培養(yǎng)箱中，定時測定每組降解液的總氮含量，計算出脫氮率。3.3.1 總氮測定及降氮菌株的篩選硝酸鉀溶液標準曲線見圖1。圖1 硝酸鉀溶液標準曲線7天和14天后，測定接種富集液的模擬廢水的總氮含量，計算出脫氮率，見表6。表6 7天和14天后各組降解液的總氮含量和脫氮率序號7天14天含氮量(mg/mL)脫氮率（%）含氮量（mg/mL）脫氮率（%）廢水0.400.40SY40.28 30.58 0.16 61.13 SY0.14 65.86 0.05 86.67 SY0.24 40.32 0.17 56.83 SY0.22 46.03 0.05 88.

44、55 SY0.18 55.44 0.11 71.34 SS10.27 32.59 0.12 70.54 SS20.25 36.29 0.16 60.05 SS30.27 31.92 0.15 63.55 SS40.21 46.71 0.18 53.87 6天和9天后，測定接種純菌液的模擬廢水的總氮含量，計算出脫氮率，見表7。表7 6天和9天后各組降解液的總氮含量和脫氮率序號6天9天含氮量(mg/mL)脫氮率（%）含氮量（mg/mL）脫氮率（%）廢水0.400.40SY4-10.2439.500.1854.37SY4-20.2343.440.1562.26SY4-30.2633.760.1853

45、.84SY4-40.2732.690.2342.54SY-10.2440.040.2049.71SY-20.2341.470.2148.28SY-30.2439.860.2243.98SY-40.2635.730.2147.03SY-50.2342.900.2245.41SY-60.2440.750.2244.87SY-10.2537.890.1953.66SY-20.2439.680.2246.13SY-30.3121.760.2244.52SY-40.2635.380.2049.71SY-50.2537.710.2244.16SY-60.2829.460.2146.49續(xù)上表序號6天9天含

46、氮量(mg/mL)脫氮率（%）含氮量（mg/mL）脫氮率（%）SY-70.2343.080.1367.99SY-80.2341.830.1758.32SY-90.2538.420.1561.90SY-10.2243.980.2148.28SY-20.2440.040.2245.05SY-30.2439.680.2244.34SY-40.2538.060.1951.68SY-10.2732.330.2148.46SY-20.2732.150.2147.92SY-30.2830.900.2439.68SY-40.2635.200.2439.50SY-50.2537.170.2245.05SS2-1

47、0.2732.150.2538.24SS2-20.2538.060.2537.17SS2-30.2635.910.2439.86SS2-40.2536.990.2245.41SS2-50.2634.120.2538.24SS3-10.2634.840.2440.57SS3-20.2635.200.2343.62SS4-10.2439.860.2439.14SS4-20.2636.090.2438.96由表7看出，實驗室培養(yǎng)的光合細菌9天后總氮去除率達到42.54 %-67.99%，而從市售菌液中分離出的光合細菌9天后總氮去除率達到37.17 %-45.41 %，所以前者的脫氮能力總體上要強于后

48、者?？偟コ首罡叩木晔荢Y-7，9天后去除率達到67.99 %。因此下面以SY-7為實驗菌株做進一步研究。3.3.2 總磷測定10天后對SY-7降解液的總磷含量進行測定，磷酸二氫鉀溶液標準曲線見圖2。模擬廢水測定時稀釋400倍，SY-7降解液測定時稀釋200倍。將測得的吸光值代入標準曲線，得到總磷含量：模擬廢水為2.8852 g/10 mL,即0.2885 mg/L,稀釋前總磷含量為115.41 mg/L；SY-7降解液為3.6990 g/10 mL,即0.3699 mg/L,稀釋前總磷含量為73.97 mg/L；所以總磷去除率 =（115.41-73.97）/115.41=35.91%。

49、圖2 磷酸二氫鉀溶液標準曲線3.3.3 化學需氧量COD測定3.3.3.1 模擬廢水COD測定（1）硫酸亞鐵銨標準溶液的標定（取10 mL重鉻酸鉀）硫酸亞鐵銨標準溶液用量：V = 51.20 mL,c硫酸亞鐵銨 = （0.2500*10.00）/V = 0.0488 mol/L（2）模擬廢水COD測定（稀釋400倍）硫酸亞鐵銨標準溶液用量：V1 = 20.10 mL,（3）空白試驗測定硫酸亞鐵銨標準溶液用量：V0 = 0.20 mL,所以稀釋后模擬廢水中COD的含量為:CODcr(O2,mg/L) = (V1- V0)*c*8*1000/V = 777測定時水樣稀釋400倍，所以稀釋前模擬廢水

50、的COD含量為 mg/L。3.3.3.2 SY-7降解液 COD測定10天后對SY-7降解液的COD進行測定，數(shù)據(jù)及處理如下：（1）硫酸亞鐵銨標準溶液的標定（取5 mL重鉻酸鉀）硫酸亞鐵銨標準溶液用量：V = 25.10 mL,c硫酸亞鐵銨 = （0.2500*5.00）/V = 0.0498 mol/L(2)降解液COD測定(稀釋200倍)硫酸亞鐵銨標準溶液用量：V1 = 21.50 ml,所以稀釋后降解液中COD的含量為:CODcr(O2,mg/L) = (V1- V0)*c*8*1000/V = 849測定時降解液稀釋200倍，所以稀釋前降解液的COD含量為 mg/L；所以污水COD去除

51、率 =（-）/=45.37%。3.3.4 氨氮測定10天后對SY-7降解液的氨氮含量進行測定，氯化銨溶液標準曲線見圖3。圖3 氯化銨溶液標準曲線模擬廢水測定時稀釋100倍，SY-7降解液測定時稀釋50倍。 根據(jù)模擬廢水和SY-7降解液的吸光度，從標準曲線上查得氨氮含量：模擬廢水的氨氮含量為29.71 g/10 ml,即2.971 mg/L,稀釋前為297.1 mg/L；SY-7降解液的氨氮含量為24.84 g/10 mL,即2.484 mg/L，稀釋前為124.2 mg/L；所以，氨氮去除率 =（297.1-124.2）/297.1 = 58.20 %。綜上所述，SY-7對各個測定值均有一定的

52、去除率，其中對總氮的去除率最高，氨氮和COD次之，總磷的去除率最低，見表8。表8 SY-7對各項測定值的去除率測定項目去除率（%）總氮67.99氨氮58.20COD45.37總磷35.913.4 SY-7光合細菌形態(tài)特征觀察3.4.1 液體培養(yǎng)特征本實驗中得到的SY-7菌液見圖4和圖5。 圖4 SY在30、60W白熾燈下 圖5 SY-7在30、60W白熾燈下厭氧培養(yǎng)9天后的第二次富集液厭氧培養(yǎng)15天后的菌液SY第二次富集菌液顏色詳細變化過程見表9。表9 SY第二次富集菌液顏色變化過程時間（天）顏色1無變化2無變化3無變化4瓶底有少量綠色物5瓶底綠色物增多6瓶底綠色物增加，液體呈淡紅色7液體呈淡

53、紅色8液體紅色加深9液體呈深紅色3.4.2 平板菌落特征SY-7的菌落為橘黃色，圓形，突起，光滑濕潤，有光澤，菌落不透明，邊緣整齊，中心和邊緣顏色不一致，中間顏色更深，見圖6。 圖6 SY-7在30、60W白熾燈下厭氧培養(yǎng)3天后的平板菌落形態(tài)3.4.3 顯微鏡觀察菌體形態(tài)特征經(jīng)過革蘭氏染色，在顯微鏡下（10100）觀察到SY-7菌體形態(tài)：SY-7革蘭氏染色結(jié)果為陰性，短桿菌，大小為（0.51.0）（1.03.0）m，見圖7。圖7 顯微鏡下SY-7的菌體形態(tài)4 討論本實驗篩選到一株光合細菌，編號SY-7，用其降解模擬廢水，總氮去除率為67.99 %，氨氮去除率為58.20 %，總磷去除率為35.91 %，化學需氧量（COD）去除率為45.37 %。施安輝等7分別用沼澤紅假單胞菌、綠色紅假單胞菌、膠質(zhì)紅假單胞菌和球形紅假單胞菌（菌密度均在30億個/mL以上）在室內(nèi)凈化污水，使用質(zhì)量濃度10 mg/L，10天后測定COD，分別下降了9.89 % 、2.85 %、9.34 %和11.51