醫(yī)療器械檢化員微生物培訓(xùn)

1、微生物實(shí)驗(yàn)培訓(xùn)一、人員資質(zhì)及培訓(xùn)要求 從事醫(yī)療器械微生物檢驗(yàn)工作的人員應(yīng)具備微生物學(xué)或相近專(zhuān)業(yè)知識(shí)的教育背景。檢驗(yàn)人員應(yīng)依據(jù)所在崗位和職責(zé)接受相應(yīng)的培訓(xùn)，在確認(rèn)它們可以承擔(dān)某一檢驗(yàn)前，他們不能獨(dú)立從事該項(xiàng)微生物檢驗(yàn)。應(yīng)保證所有人員在上崗前接受勝任工作所必須的設(shè)備操作、微生物檢驗(yàn)技術(shù)和實(shí)驗(yàn)室生物安全等方面的培訓(xùn)，經(jīng)考核合格后方可上崗，同時(shí)，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定所有級(jí)別試驗(yàn)人員的繼續(xù)教育計(jì)劃。 檢驗(yàn)人員必須熟悉相關(guān)監(jiān)測(cè)方法、程序、檢驗(yàn)?zāi)康暮徒Y(jié)果評(píng)價(jià)。微生物實(shí)驗(yàn)室的管理者其專(zhuān)業(yè)技能和經(jīng)驗(yàn)水平應(yīng)與他們的職責(zé)范圍相符，如：管理技能、實(shí)驗(yàn)室安全、檢驗(yàn)安排、預(yù)算、實(shí)驗(yàn)研究、實(shí)驗(yàn)結(jié)果的評(píng)估和數(shù)據(jù)偏差的調(diào)查、技術(shù)報(bào)告書(shū)

2、寫(xiě)等。 二、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境控制 【原則】實(shí)驗(yàn)室布局設(shè)計(jì)的基本原則是既要最大可能防止微生物的污染，又要防止檢驗(yàn)過(guò)程對(duì)環(huán)境和人員造成危害。通常，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)劃分成潔凈或無(wú)菌區(qū)域和活菌操作區(qū)域，同時(shí)應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康?，在時(shí)間或空間上有效分隔不相容的試驗(yàn)活動(dòng)，將交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)降低到最低。 一般情況下，醫(yī)療器械微生物檢驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具有開(kāi)展無(wú)菌檢查、微生物限度檢查等檢測(cè)活動(dòng)的、獨(dú)立設(shè)置的潔凈室（區(qū)）或隔離系統(tǒng)，并為上述檢驗(yàn)配備相應(yīng)的細(xì)菌（真菌）等實(shí)驗(yàn)室、培養(yǎng)室、文檔處理區(qū)等輔助區(qū)域，同時(shí)，應(yīng)對(duì)上述區(qū)域明確標(biāo)識(shí)。 二、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境控制 【要求】 1、無(wú)菌檢查應(yīng)在環(huán)境潔凈度10000級(jí)下的局部潔凈度100級(jí)的單向流空氣區(qū)域

3、內(nèi)或隔離系統(tǒng)中進(jìn)行。用于無(wú)菌檢查和微生物限度檢查的潔凈操作室應(yīng)配有屬于“人流凈化”的更衣室及屬于“物流凈化”的緩沖間或傳遞窗（柜），使進(jìn)入潔凈操作室的實(shí)驗(yàn)人員和實(shí)驗(yàn)物品分別經(jīng)適當(dāng)凈化后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)操作間。 無(wú)菌室分無(wú)菌操作室和緩沖間。無(wú)菌操作室應(yīng)具有空氣除菌過(guò)濾的單向流空氣裝置。操作室或工作臺(tái)應(yīng)保持正壓。應(yīng)在壓差十分重要的相鄰級(jí)別區(qū)之間安裝壓差表。 二、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境控制 【要求】 2、微生物限度檢查的全過(guò)程，均應(yīng)遵守?zé)o菌操作，嚴(yán)防再污染。因此，微生物限度檢查宜在環(huán)境潔凈度10000級(jí)下的局部潔凈度100級(jí)的單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行；限度檢查實(shí)驗(yàn)室應(yīng)配有相應(yīng)的人流和物流緩沖間，并定期作環(huán)境監(jiān)測(cè)。 二、實(shí)驗(yàn)

4、室環(huán)境控制 【要求】 3、菌種處理、微生物鑒別和陽(yáng)性對(duì)照室 菌種的處理包括的內(nèi)容比較多，如菌種的傳代、保藏、制備以及培養(yǎng)基促生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)、陽(yáng)性對(duì)照、微生物方法驗(yàn)證、消毒劑和防腐劑的效力測(cè)定和對(duì)環(huán)境中分離菌的鑒別等，這些實(shí)驗(yàn)過(guò)程中都在處理活的微生物，處理不當(dāng)會(huì)造成實(shí)驗(yàn)室環(huán)境污染，影響其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因此，該室必須與其他實(shí)驗(yàn)室嚴(yán)格分開(kāi)；必要時(shí)，應(yīng)按實(shí)驗(yàn)室性質(zhì)的需要保持對(duì)相鄰實(shí)驗(yàn)室的相對(duì)壓差；需采取必要的消毒方式確保實(shí)驗(yàn)室潔凈條件合格（如臭氧，乳酸熏蒸等），以凈化層流臺(tái)作為局部100級(jí)的控制措施，最好是使用生物安全柜，所有的與活毒菌種相關(guān)的活動(dòng)都應(yīng)在層流臺(tái)或生物安全柜中進(jìn)行。每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后要對(duì)層流臺(tái)或生物

5、安全柜及整個(gè)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境進(jìn)行消毒。所有與菌種相關(guān)的實(shí)驗(yàn)廢物均應(yīng)經(jīng)過(guò)滅菌處理后方可丟棄。二、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境控制 【要求】 4、培養(yǎng)室及其他功能間 培養(yǎng)室用于放置培養(yǎng)細(xì)菌和真菌的培養(yǎng)箱。準(zhǔn)備區(qū)即試液及培養(yǎng)基配制/滅菌區(qū)域、實(shí)驗(yàn)器皿洗滌、烘干、滅菌、實(shí)驗(yàn)用品及易耗品儲(chǔ)藏等沒(méi)有特殊要求的功能間，可為一般清潔環(huán)境。 微生物環(huán)境控制相關(guān)標(biāo)準(zhǔn) GB/T 16292:2010，醫(yī)藥工業(yè)潔凈室(區(qū))懸浮粒子測(cè)試方法 GB/T 16293:2010，醫(yī)藥工業(yè)潔凈室(區(qū))浮游菌測(cè)試方法 GB/T 16294:2010，醫(yī)藥工業(yè)潔凈室(區(qū))沉降菌測(cè)試方法 GB50073-2001潔凈廠房設(shè)計(jì)規(guī)范 ISO 14644-1:1

6、999 潔凈室及相關(guān)受控環(huán)境 第1部分：空氣潔凈度等級(jí)劃分 ISO 14644-4:1999 潔凈室及相關(guān)受控環(huán)境 第4部分：設(shè)計(jì)、施工、運(yùn)行 ISO 14644-7:1999 潔凈室及相關(guān)受控環(huán)境 第7部分：分離的設(shè)備無(wú)菌室環(huán)境控制設(shè)備微粒計(jì)數(shù)儀無(wú)菌室環(huán)境控制設(shè)備浮游菌采樣儀無(wú)菌室環(huán)境控制設(shè)備潔凈室沉降菌測(cè)試方法 1.測(cè)試時(shí)間 1.1對(duì)單向流，如100級(jí)凈化房間及層流工作臺(tái)，測(cè)試應(yīng)在凈化空調(diào)系統(tǒng)正常運(yùn)行不少于10min后開(kāi)始。 1.2對(duì)非單向流，如10000級(jí)、100000級(jí)以上的凈化房間，測(cè)試應(yīng)在凈化空調(diào)系統(tǒng)正常運(yùn)行不少于30min后開(kāi)始。 2.采樣方法 將已制備好的培養(yǎng)皿按要求放置，打開(kāi)

7、培養(yǎng)皿蓋，使培養(yǎng)基表面暴露0.5h，再將培養(yǎng)皿蓋蓋上后倒置。 2.2.培養(yǎng) 全部采樣結(jié)束后，將培養(yǎng)皿倒置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在3035培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，時(shí)間不少于48h。每批培養(yǎng)基應(yīng)有對(duì)照試驗(yàn)，檢驗(yàn)培養(yǎng)基本身是否污染。可每批選定3只培養(yǎng)皿作對(duì)照培養(yǎng)。潔凈室沉降菌測(cè)試方法 3.菌落計(jì)數(shù)用肉眼直接計(jì)數(shù)，標(biāo)記或在菌落計(jì)數(shù)器上點(diǎn)計(jì)，然后用510倍放大鏡檢查，有否遺漏。若培養(yǎng)皿上有2個(gè)或2個(gè)以上的菌落重疊，可分辨時(shí)仍以2個(gè)或2個(gè)以上菌落計(jì)數(shù)。4.注意事項(xiàng)4.1測(cè)試用具要作滅菌處理，以確保測(cè)試的可靠性、正確性。4.2采取一切措施防止人為對(duì)樣本的污染。4.3對(duì)培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件及其他參數(shù)作詳細(xì)的記錄。4.4由于細(xì)

8、菌種類(lèi)繁多，差別甚大，計(jì)數(shù)時(shí)一般用透射光于培養(yǎng)皿背面或正面仔細(xì)觀察，不要漏計(jì)培養(yǎng)皿邊緣生長(zhǎng)的菌落，并須注意細(xì)菌菌落與培養(yǎng)基沉淀物的區(qū)別，必要時(shí)用顯微鏡鑒別。4.5采樣前應(yīng)仔細(xì)檢查每個(gè)培養(yǎng)皿的質(zhì)量，如發(fā)現(xiàn)變質(zhì)、破損或污染的應(yīng)剔除。潔凈室沉降菌測(cè)試方法 5.測(cè)試規(guī)則 5.1.測(cè)試狀態(tài) 5.1.1沉降菌測(cè)試前，被測(cè)試潔凈室（區(qū)）的溫濕度須達(dá)到規(guī)定的要求，靜壓差、換氣次數(shù)、空氣流速必須控制在規(guī)定值內(nèi)。 5.1.2沉降菌測(cè)試前，被測(cè)試潔凈室（區(qū)）已經(jīng)過(guò)消毒。 5.1.3測(cè)試狀態(tài)有靜態(tài)和動(dòng)態(tài)兩種，測(cè)試狀態(tài)的選擇必須符合生產(chǎn)的要求，并在報(bào)告中注明測(cè)試狀態(tài)。 5.2.測(cè)試人員 5.2.1測(cè)試人員必須穿戴符合環(huán)

9、境潔凈度級(jí)別的工作服。 5.2.2靜態(tài)測(cè)試時(shí)，室內(nèi)測(cè)試人員不得多于二人。最少采樣點(diǎn)數(shù)目最少采樣點(diǎn)數(shù)目面積潔凈度級(jí)別10010000100000102322102042220408224010016421002004010320040080206400100016040131000200040010032200080020063注：表中的面積，對(duì)于單向流潔凈室.指的是送風(fēng)面積；對(duì)非單向流潔凈室，指的是房間面積同時(shí)滿足最少平皿數(shù)潔凈度級(jí)別所需90mm培養(yǎng)皿數(shù)（以沉降0.5h計(jì)）100級(jí)1410000級(jí)2100OOO級(jí)2采樣點(diǎn)的布置 采樣點(diǎn)的位置可以同懸浮粒子測(cè)試點(diǎn)。 a）工作區(qū)采樣點(diǎn)的位置離地0.

10、8m1.5m左右（略高于工作面）。 b）可在關(guān)鍵設(shè)備或關(guān)鍵工作活動(dòng)范圍處增加采樣點(diǎn)。 采樣點(diǎn)位置的詳細(xì)規(guī)則見(jiàn)附錄B（標(biāo)準(zhǔn)的附錄）。 采樣點(diǎn)布置 潔凈度級(jí)別沉降菌浮游菌塵粒的最大允許數(shù)/m3個(gè)/（90mm）0.5h）活微生物數(shù)/m30.5m5m10015 3500100003100 350000 2000環(huán) 境 檢 測(cè) 參 照 標(biāo) 準(zhǔn)微生物實(shí)驗(yàn)室管理嚴(yán)格區(qū)分污染區(qū)及清潔區(qū)相 關(guān) 標(biāo) 準(zhǔn) GB 15979-2002 一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn) GB 15980-1995 一次性使用醫(yī)療用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn) GB 15981-1995消毒與滅菌效果的評(píng)價(jià)方法和標(biāo)準(zhǔn)三、滅菌控制 微生物實(shí)驗(yàn)使用的試劑、器材等常

11、需用濕熱滅菌法。濕熱滅菌的溫度和時(shí)間需驗(yàn)證，必須保證物品滅菌后無(wú)菌保證值SAL10-6。滅菌程序經(jīng)驗(yàn)證合格后方可使用。定期進(jìn)行BD實(shí)驗(yàn)、 真空泄漏測(cè)試、溫度參數(shù)測(cè)試（空載熱分布、定載熱穿透、滿載熱穿透）、壓力改變速率測(cè)試（GB8599-2008大型蒸汽滅菌器技術(shù)要求），同時(shí)以生物指示劑驗(yàn)證滅菌效果, 必須保證物品滅菌后無(wú)菌保證值SAL小于百萬(wàn)分之一。 三、滅菌控制 所有器具應(yīng)采用可靠方法滅菌 置壓力蒸汽滅菌器內(nèi)12130 min 或 置電熱干燥箱內(nèi)1802 h。 濕熱滅菌控制相關(guān)標(biāo)準(zhǔn) GB 18281.3-2000醫(yī)療保健產(chǎn)品滅菌 生物指示物 第3部分:濕熱滅菌用生物指示物 ISO 11138

12、-3-2006醫(yī)療保健產(chǎn)品滅菌.生物指示物.第3部分:濕熱滅菌用生物指示劑四、培養(yǎng)基管理 1、培養(yǎng)基的制備 2、培養(yǎng)基的貯藏 3、培養(yǎng)基的質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn) 四、培養(yǎng)基管理 靈敏度檢查 （中國(guó)藥典2010） 無(wú)菌檢查（ISO11737.2:2009或GBT19973.2-2005）五、 無(wú)菌操作 定義：是指在執(zhí)行實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，防止一切微生物侵入機(jī)體和保持無(wú)菌物品及無(wú)菌區(qū)域不被污染的操作技術(shù)和管理方法。無(wú)菌操作技術(shù)是微生物實(shí)驗(yàn)的基本技術(shù)，是保證微生物實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確和順利完成的重要環(huán)節(jié)。 無(wú)菌操作技術(shù)主要包括兩方面：創(chuàng)造無(wú)菌的培養(yǎng)環(huán)境及在操作和培養(yǎng)過(guò)程中防止一切其它微生物的侵入。創(chuàng)造無(wú)菌的培養(yǎng)環(huán)境包括提供密閉的

13、培養(yǎng)容器、培養(yǎng)容器的滅菌、培養(yǎng)基的滅菌等；防止一切其它微生物的侵入的措施包括紫外線殺菌、甲醛熏蒸、超凈臺(tái)的消毒與檢測(cè)、操作工具、器皿滅菌、操作方法等。微生物實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備 微生物實(shí)驗(yàn)控制1：人員管理 微生物實(shí)驗(yàn)控制2：環(huán)境控制 微生物實(shí)驗(yàn)控制3：滅菌控制 微生物實(shí)驗(yàn)控制4：培養(yǎng)基管理 微生物實(shí)驗(yàn)控制5：無(wú)菌操作微生物基本操作 瓊脂平板接種法 瓊脂斜面接種法 半固體接種法 肉湯培養(yǎng)基接種法 瓊脂平板接種法 細(xì)菌在自然界及人體中分布廣，種類(lèi)多，為了了解菌譜，須先將各種細(xì)菌分離，獲得純菌培養(yǎng)物后才能進(jìn)一步作細(xì)菌的鑒定。瓊脂平板培養(yǎng)基因面積大，接種后可達(dá)到分離的目的，常稱(chēng)分離培養(yǎng)法。平板接種方法有多種。以

14、下介紹平行劃線法及分區(qū)劃線法。 瓊脂平板接種法（分離培養(yǎng)法）分區(qū)劃線法瓊脂平板接種法（分離培養(yǎng)法）平行劃線法 瓊脂平板接種法（分離培養(yǎng)法）單個(gè)菌落單個(gè)菌落瓊脂斜面接種法 目的：多用于純種細(xì)菌的增菌和保存菌種 方法：用滅菌接種環(huán)取細(xì)菌培養(yǎng)物少許。拔去瓊脂斜面培養(yǎng)基塞，管口經(jīng)火焰上滅菌，將沾有細(xì)菌的接種環(huán)伸入管內(nèi)，自下而上在瓊脂上蜿蜒劃線；接種后，管口在火焰上滅菌，塞回塞，接種環(huán)滅菌：在試管口處做好標(biāo)記，置37培養(yǎng)1824小時(shí) 大腸桿菌斜面大腸桿菌斜面 金黃色葡萄球菌斜面金黃色葡萄球菌斜面肉湯接種法 目的：用于增菌。 方法：用滅菌接種環(huán)取細(xì)菌培養(yǎng)物少許；以無(wú)菌操作將沾有細(xì)菌的接種環(huán)伸入肉湯中，將環(huán)

15、上細(xì)菌輕輕研磨于接近液面的管壁上，然后將試管稍傾斜，使肉湯碰及細(xì)菌即可；接種后管口滅菌，塞回塞，接種環(huán)滅菌，并做好標(biāo)記，置37培養(yǎng)18-24小時(shí) 半固體接種法（穿刺接種法） 目的：增菌和保存菌種；觀察細(xì)菌有無(wú)動(dòng)力。 方法：用接種針，將取有細(xì)菌的接種針自培養(yǎng)基中央刺入（不要接觸管底），沿原穿刺線撥出，注意在刺入與拔出時(shí)不可晃動(dòng)接種針；接種后做好標(biāo)記。置37培養(yǎng)18-24小時(shí)半固體瓊脂培養(yǎng)基（半固體瓊脂培養(yǎng)基（0.5%） 菌懸液制備（使用麥?zhǔn)媳葷峁埽?麥?zhǔn)媳葷峁埽菏荕cFarland發(fā)明的一種用于微生物比濁的不同濁度的標(biāo)準(zhǔn)濁度管。具體的配制方法是根據(jù)硫酸和氯化鋇的比例來(lái)定的，有表可查，這樣不同比例

16、生成的硫酸鋇沉淀的濃度不同，且都有定值。麥?zhǔn)媳葷峁艿呐浔塞準(zhǔn)媳葷峁艿呐浔裙?號(hào)(McFarland)0.5123450.25%BaCl2（ml）0.20.40.81.21.62.01%H2SO4(ml)9.89.69.28.88.48.0細(xì)菌的近似濃度(108/ml)13691215菌懸液制備（使用麥?zhǔn)媳葷峁埽?【材料】 1、實(shí)驗(yàn)所需的微生物新鮮培養(yǎng)物如：金黃色葡萄球菌新鮮培養(yǎng)物； 2、無(wú)菌生理鹽水、麥?zhǔn)媳葷峁埽?3、酒精燈、接種環(huán)、無(wú)菌吸管、平皿。菌懸液制備（使用麥?zhǔn)媳葷峁埽?【方法】 1、輕搖標(biāo)準(zhǔn)試管； 2、無(wú)菌操作挑取金黃色葡萄球菌新鮮培養(yǎng)物至無(wú)菌生理鹽水試管（與標(biāo)準(zhǔn)管相同直徑）中混勻，

17、直到濁度與所要求的標(biāo)準(zhǔn)管的濃度相同； 3、序列稀釋已挑取菌落的生理鹽水試管至所需的菌液濃度如：100cfu/ml; 4、用平皿計(jì)數(shù)法驗(yàn)證所配置菌液的實(shí)際濃度。菌懸液制備（使用麥?zhǔn)媳葷峁埽?【使用技巧】 1、直接用眼睛看（需要經(jīng)驗(yàn)，誤差較大）。 2、找張白紙打上平行直線，利用光在不同濃度液體折射不同幫助觀察比較。1234567861086107610661056104610361026101麥 氏 1 號(hào) 管 稀 釋 梯 度 表（cfu/ml）菌懸液制備（使用分光光度儀 ）分光光度儀 菌懸液制備的保存 菌懸液制備：菌懸液制備后應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)使用，若保存在28的菌懸液可以在24小時(shí)內(nèi)使用。黑曲霉也可

18、制成穩(wěn)定的孢子懸液保存在28，在驗(yàn)證過(guò)的貯存期內(nèi)替代對(duì)應(yīng)量的新鮮孢子懸液使用。 培養(yǎng)基質(zhì)量控制：靈敏度檢查 靈敏度檢查所需的六種菌： 金黃色葡萄球菌 CMCC (B)26003 ATCC 6538 銅綠假單胞菌 CMCC (B)10104 ATCC 9027 枯草芽孢桿菌CMCC (B)63501 ATCC 6633 生孢梭菌CMCC(B)64941 ATCC 11437 白色念珠菌CMCC(F)98001 ATCC 10231 黑曲霉CMCC(F)98003 ATCC 16404 根據(jù)培養(yǎng)基的功能選擇靈敏度實(shí)驗(yàn)所需菌種根據(jù)培養(yǎng)基的功能選擇靈敏度實(shí)驗(yàn)所需菌種 中國(guó)藥典2005年版 明確規(guī)定：

19、培養(yǎng)基靈敏度、微生物限度檢查法檢查所用的菌株傳代次數(shù)不得超過(guò)5代（從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)，以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。培養(yǎng)基質(zhì)量控制：靈敏度檢查 中國(guó)藥典2010年版在新增的“藥品微生物實(shí)驗(yàn)室規(guī)范指導(dǎo)原則”中對(duì)菌種有了較為明確的規(guī)定： 允許使用標(biāo)準(zhǔn)菌株和商業(yè)派生菌株 標(biāo)準(zhǔn)菌株應(yīng)按保藏機(jī)構(gòu)提供的說(shuō)明進(jìn)行復(fù)活 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株應(yīng)進(jìn)行純度和特性確認(rèn) 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株建議采用低溫冷凍干燥、液氮貯存或超低溫冷凍保藏的方法 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株可用于制備每月或每周一次轉(zhuǎn)種的工作菌株 冷凍菌株解凍后不得重新冷凍和再次使用 工作菌株不可替代標(biāo)準(zhǔn)菌株，商業(yè)派生菌株僅可用作工作菌株培

20、養(yǎng)基質(zhì)量控制：靈敏度檢查菌株傳代基本概念 標(biāo)準(zhǔn)菌株：標(biāo)準(zhǔn)菌株：由國(guó)內(nèi)或國(guó)際菌種保藏機(jī)構(gòu)保藏的，遺傳學(xué)特性得到確認(rèn)和保證并可追溯的菌株。（0代） 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株：標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株：由標(biāo)準(zhǔn)菌株經(jīng)一次傳代得到的培養(yǎng)物。（1代） 商業(yè)派生菌株：商業(yè)派生菌株：由供應(yīng)商提供的所有特性與標(biāo)準(zhǔn)菌株等效的菌株。（2代） 工作菌株：工作菌株：由標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株經(jīng)傳代得到的培養(yǎng)物。（2代） 代：代：將活的微生物接種到新鮮培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，并希望獲取新的微生物培養(yǎng)物。這種操作方式，新培養(yǎng)物對(duì)接種培養(yǎng)物而言就稱(chēng)為一代。采購(gòu)的第2代超低溫冷凍標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌種儲(chǔ)備菌種工作菌種第3代工作菌種第3代工作菌種第4代工作菌種第4代工作菌液第5代

21、工作菌液第5代工作菌液第5代工作菌液第5代制備工作菌種進(jìn)行菌種保藏的模式圖各類(lèi)菌種保藏條件及時(shí)間菌 種培 養(yǎng) 基保存溫度傳 種 時(shí) 間細(xì) 菌一般多用于營(yíng)養(yǎng)瓊脂或根據(jù)菌種規(guī)定選用培養(yǎng)基46芽孢桿菌36個(gè)月，其它細(xì)菌每個(gè)月酵母菌一般用麥芽汁瓊脂或麥芽汁酵母膏瓊脂46一般46個(gè)月絲狀真菌一般用PDA瓊脂、蔡氏瓊脂或麥芽汁瓊脂等46每4個(gè)月移植一次（每2個(gè)月移植一次）菌 種 保 管 菌種保管應(yīng)有專(zhuān)人負(fù)責(zé)，保存與加鎖的冰箱菌種保管應(yīng)有專(zhuān)人負(fù)責(zé)，保存與加鎖的冰箱中或特制的白鐵箱中加鎖置陰暗處，確保菌種安中或特制的白鐵箱中加鎖置陰暗處，確保菌種安全。因工作變動(dòng)時(shí)，必須做好交接工作。全。因工作變動(dòng)時(shí)，必須做好

22、交接工作。 菌種應(yīng)有詳細(xì)登記本，包括名稱(chēng)、分離日期、菌種應(yīng)有詳細(xì)登記本，包括名稱(chēng)、分離日期、鑒定日期、鑒定者、主要鑒定性能，并注意記錄鑒定日期、鑒定者、主要鑒定性能，并注意記錄使用、轉(zhuǎn)移及銷(xiāo)毀情況和原因。使用、轉(zhuǎn)移及銷(xiāo)毀情況和原因。 各種菌種應(yīng)按規(guī)定時(shí)間定期移種。一般每移各種菌種應(yīng)按規(guī)定時(shí)間定期移種。一般每移種種3次后作一次全面鑒定。注意菌種有無(wú)污染和次后作一次全面鑒定。注意菌種有無(wú)污染和變異，如發(fā)現(xiàn)污染和變異時(shí)，應(yīng)及時(shí)更換。變異，如發(fā)現(xiàn)污染和變異時(shí)，應(yīng)及時(shí)更換。 購(gòu)置菌種，應(yīng)有介紹信。購(gòu)置菌種，應(yīng)有介紹信。全部保存菌種應(yīng)具備全部保存菌種應(yīng)具備清單，并定期向部門(mén)負(fù)責(zé)人報(bào)告。清單，并定期向部門(mén)負(fù)

23、責(zé)人報(bào)告。 FTM 的 靈 敏 度 檢 查培養(yǎng)基 標(biāo) 準(zhǔn) 菌 種 ( 1 0 -100cfu/ml) 3035培養(yǎng) 培養(yǎng)天數(shù) 1 2 3 4 5 FTM(12ml) 金黃色葡萄球菌 管1 管2 緑膿桿菌 管3 管4 枯草芽孢桿菌 管5 管6 生胞梭菌 管7 管8 空白對(duì)照 管9 培養(yǎng)基質(zhì)量控制：靈敏度檢查接種金黃色葡萄球菌、緑膿桿菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯或營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，3035培養(yǎng)1824h；用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成10-100cfu/ml菌液備用。接種生胞梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基中，3035培養(yǎng)1824h；用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成10-100cfu/m

24、l菌液備用。接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中，2328培養(yǎng)2448h；用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成10-100cfu/ml菌液備用。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，2328培養(yǎng)57d,加35ml0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液將孢子洗脫。然后，吸出孢子懸液至無(wú)菌試管內(nèi)，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成10-100cfu/ml孢子懸液備用。 菌種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉；制備成活菌數(shù)100cfu的菌懸液備用菌株傳代次數(shù)不得超過(guò)5代培養(yǎng)基接種每種菌接種至2管相應(yīng)的培養(yǎng)基，另取一支不接種作空白對(duì)照，按規(guī)定溫度時(shí)間培養(yǎng)。結(jié)果判斷空白對(duì)

25、照管應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)，每種菌接種后的2管培養(yǎng)基管均生長(zhǎng)良好，該培養(yǎng)基的靈敏度檢查符合規(guī)定。培養(yǎng)條件金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌接種至營(yíng)養(yǎng)肉湯（或營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基）3035培養(yǎng)1824小時(shí)；生孢梭菌接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中3035培養(yǎng)3天；白色念珠菌、黑曲霉接種至改良馬丁培養(yǎng)基中2328培養(yǎng)5天培養(yǎng)基質(zhì)量控制：靈敏度檢查培養(yǎng)基質(zhì)量控制：無(wú)菌檢查 每批滅菌的培養(yǎng)基隨機(jī)取不少于5支(瓶)，培養(yǎng)14天，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。 無(wú)菌實(shí)驗(yàn)無(wú)菌實(shí)驗(yàn)預(yù)防假陽(yáng)性措施 1在一個(gè)專(zhuān)門(mén)準(zhǔn)備、環(huán)境控制的房間內(nèi)的層流罩的環(huán)境中進(jìn)行測(cè)試 2在整個(gè)測(cè)試過(guò)程中使用無(wú)菌技術(shù) 3用避免污染的方法把測(cè)試器皿、培養(yǎng)基和測(cè)試物品引入測(cè)試

26、區(qū) 4測(cè)試產(chǎn)品表面的細(xì)菌污染，在引導(dǎo)測(cè)試物品進(jìn)入測(cè)試區(qū)之前，先對(duì)產(chǎn)品的外包裝進(jìn)行消毒。 5對(duì)測(cè)試中使用的設(shè)備、材料和產(chǎn)品進(jìn)行滅菌 6簡(jiǎn)化進(jìn)行測(cè)試必須的操作 7盡量避免懸浮微粒的產(chǎn)生 8環(huán)境時(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)（沉降菌檢測(cè)）無(wú)菌實(shí)驗(yàn)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn) GBT19973.2-2005-醫(yī)用器材的滅菌 微生物學(xué)方法 第二部分：確認(rèn)滅菌過(guò)程的無(wú)菌試驗(yàn) ISO 11737-2 2009-醫(yī)用器材的滅菌 微生物學(xué)方法 第二部分：確認(rèn)滅菌過(guò)程的無(wú)菌試驗(yàn)無(wú)菌實(shí)驗(yàn)：培養(yǎng)條件 不論哪種無(wú)菌試驗(yàn)方法：FTM32.52.5，不少于14天；SCDB22.52.5，不少于14天； 改良馬丁23-28，不少于14天。 如果14以內(nèi)觀察到陽(yáng)性結(jié)果

27、，不必繼續(xù)培養(yǎng)。無(wú)菌實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照 應(yīng)根據(jù)供試品特性選擇陽(yáng)性對(duì)照菌：無(wú)抑菌作用及抗革蘭陽(yáng)性菌為主的供試品以金黃色葡萄球菌為對(duì)照菌；抗革蘭陰性菌為主的供試品以大腸埃希菌為對(duì)照菌；抗厭氧菌的供試品，以生孢梭菌為對(duì)照菌；抗霉菌的供試品，以白色念珠菌為對(duì)照菌。加菌量小于l00cfu，供試品用量同供試品無(wú)菌實(shí)驗(yàn)時(shí)每份培養(yǎng)基接種的樣品量。陽(yáng)性對(duì)照管培養(yǎng)4872小時(shí)應(yīng)生長(zhǎng)良好 陰性對(duì)照 陰性對(duì)照：陰性對(duì)照供試品無(wú)菌實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)取相應(yīng)溶劑和稀釋同法操作作為陰性對(duì)照。陰性對(duì)照不得有菌生長(zhǎng)。無(wú)菌實(shí)驗(yàn)：結(jié)果判斷 肉湯培養(yǎng)基有菌生長(zhǎng)的常見(jiàn)三種形式： 混濁生長(zhǎng)：液體變混濁。 菌膜：液體澄清，表面有一薄層菌膜。 沉淀生長(zhǎng)：液

28、體澄清，管底有沉淀物 混濁生長(zhǎng)：液體變混濁肉湯培養(yǎng)基有菌生長(zhǎng)的常見(jiàn)形式無(wú)菌實(shí)驗(yàn)：結(jié)果判斷 1.陽(yáng)性對(duì)照管應(yīng)生長(zhǎng)良好，陰性對(duì)照管應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng) 2.培養(yǎng)期間逐日觀察并記錄是否有菌生長(zhǎng)，如培養(yǎng)14天后，培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁，但不能確定是否有微生物生長(zhǎng)，可取該培養(yǎng)液適量轉(zhuǎn)種至同種新鮮培養(yǎng)基或劃線接種于斜面培養(yǎng)基上，細(xì)菌培養(yǎng)兩天，霉菌培養(yǎng)三天，觀察接種的同種新鮮培養(yǎng)基是否再出現(xiàn)渾濁或斜面是否有菌生長(zhǎng)；或取培養(yǎng)液涂片，染色，鏡檢，判斷是否有菌。 釋出物檢查無(wú)菌實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證：釋出物檢查 目的：對(duì)未知或可疑的供試品，在進(jìn)行無(wú)菌試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行方法驗(yàn)證試驗(yàn)，以確認(rèn)供試品在該試驗(yàn)條件下無(wú)抑菌活性或其抑菌活性可以忽略不計(jì)。無(wú)菌實(shí)

29、驗(yàn)驗(yàn)證：釋出物檢查 取滅菌產(chǎn)品以無(wú)菌操作轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基中,30-35培養(yǎng)24hrs ； 注意：使用與實(shí)際無(wú)菌實(shí)驗(yàn)同種等量的培養(yǎng)基 接種每毫升濃度小于100cfu的菌種稀釋液在無(wú)菌培養(yǎng)基內(nèi)，一式兩份，其中一份加入無(wú)菌試樣，另一份作為陽(yáng)性對(duì)照，并在合適的溫度培養(yǎng)不超過(guò)5天。按表1所列菌種重復(fù)以上步驟。無(wú)菌樣品100cfu菌種無(wú)菌樣品實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組釋 出 物 檢 查在合適的溫度培養(yǎng)不超過(guò)5天。選擇合適的微生物，重復(fù)以上步驟。釋出物檢查 解釋?zhuān)和ㄟ^(guò)與陽(yáng)性對(duì)照對(duì)比，如果在培養(yǎng)容器內(nèi)看不到微生物生長(zhǎng)，則說(shuō)明使用的樣品能抑止細(xì)菌或霉菌的生長(zhǎng)。可以考慮使用無(wú)菌中和劑，如吐溫80、卵磷脂、偶氮植物凝血素、-內(nèi)酰胺酶

30、。如果中和劑無(wú)效，增加培養(yǎng)基的量。盡量使用能使試驗(yàn)微生物生長(zhǎng)的最小的培養(yǎng)基的量。大豆酪蛋白消化物培養(yǎng)基(SCDM)菌種培養(yǎng)溫度培養(yǎng)條件培養(yǎng)時(shí)間枯草芽孢桿菌ATCC 663322.5 2.5 需氧3天白色念珠菌ATCC 1023122.5 2.5 需氧3-5天釋出物檢查常用菌種初始污染菌定 義 生物負(fù)載 ：一件產(chǎn)品和/ 或包裝上存活的微生物總數(shù)。 生物負(fù)載估計(jì)值 ：通過(guò)對(duì)活菌計(jì)數(shù)或滅菌前活菌計(jì)數(shù)加上一個(gè)回收效率補(bǔ)償系數(shù)， 得出的組成生物負(fù)載的微生物數(shù)值 。初始污染菌相關(guān)標(biāo)準(zhǔn) GBT19973.1-2005-醫(yī)用器材的滅菌 微生物學(xué)方法 第一部分產(chǎn)品上微生物總數(shù)的估計(jì) ISO-11737-1:20

31、06 GBT19973.1-2005-醫(yī)用器材的滅菌 微生物學(xué)方法 第一部分產(chǎn)品上微生物總數(shù)的估計(jì)樣品份額取樣原則樣品份額取樣原則 1 定義：樣品份額 (SIP) sample item portion，即從某一保健產(chǎn)品單元上取出的用于試驗(yàn)的部分。 2取樣注意事項(xiàng) 2.1若可操作，試驗(yàn)應(yīng)使用整個(gè)產(chǎn)品單元。但這往往被認(rèn)為是不可行的，產(chǎn)品單元上的樣品份額宜在實(shí)驗(yàn)室易于操作的前提下盡可能大。 2.2如果所用的樣品份額( (SIP) 小于一個(gè)完整的產(chǎn)品單元，則應(yīng)選擇代表產(chǎn)品單元的具有微生物的部分。如果已驗(yàn)證微生物在產(chǎn)品單元上是均勻分布的，應(yīng)從產(chǎn)品單元上任一部位選擇樣品份額。在缺少這些驗(yàn)證的情況下，應(yīng)從

32、產(chǎn)品單元上隨機(jī)選擇幾個(gè)部分作為樣品份額。 2.3樣品份額本身應(yīng)對(duì)產(chǎn)品單元內(nèi)的產(chǎn)品有代表性。當(dāng)產(chǎn)品分成不同的部分，可以分裝于兩個(gè)或多個(gè)容器內(nèi)。樣品份額可以根據(jù)供試產(chǎn)品單元的長(zhǎng)度、質(zhì)量、體積或表面積。如果產(chǎn)品單元有標(biāo)簽說(shuō)明只是液路無(wú)菌，宜把液路視為整個(gè)試驗(yàn)單位。(即SIP=1 ) 2.4 SIP選擇舉例，見(jiàn)表1表1 SIP 選擇舉例選擇SIP的依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品表面積放植物(非吸收)質(zhì)量粉狀、手術(shù)衣/單、植入物(可吸收)長(zhǎng)度管路(直徑不變) 管路(直徑不變)體積水、液體液路靜脈輸注器，液袋表1 SIP 選擇舉例選擇SIP的依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品表面積放植物(非吸收)質(zhì)量粉狀、手術(shù)衣/單、植入物(可吸收)長(zhǎng)度管路(

33、直徑不變) 管路(直徑不變)體積水、液體液路靜脈輸注器，液袋 校正因子校正因子 定義：用于對(duì)活菌計(jì)數(shù)或滅菌前活菌計(jì)數(shù)進(jìn)行修正的數(shù)值，以補(bǔ)償產(chǎn)品上無(wú)法完全洗脫的微生物，以便計(jì)算出生物負(fù)載估計(jì)值。 校正因子反復(fù)洗脫方法實(shí)驗(yàn)步驟 1取樣品1件或sip，投入一定量的無(wú)菌洗脫液中(A)。 2樣品的處理采用旋渦混臺(tái)器(2800次min)，振蕩2min。 3注皿：取處理洗脫液A2ml，分別注入兩個(gè)無(wú)菌平皿中，每平皿1ml。 4再洗脫:將樣品從洗脫液A中取出瀝干，移入另一定量的無(wú)菌洗脫液中(B)。 5再處理:將B洗脫液置旋渦混臺(tái)器(2800次min)振蕩2min。 6再注皿:取B洗脫液2ml，分別注入兩個(gè)無(wú)菌

34、平皿內(nèi)，每平皿lml。 注：當(dāng)微生物數(shù)少時(shí),從B洗脫液開(kāi)始，即可用無(wú)菌濾膜過(guò)濾后直接放培養(yǎng)基中培養(yǎng)。 7如此反復(fù)洗脫4次即A、B、C和D，直至洗脫累積量(初始污染菌)不再增加，最后瀝干樣品，將其平鋪于無(wú)菌平皿中(E)。然后將熔化并冷至4548的NA培養(yǎng)基，分別注入AE各平皿每皿15ml。 8待凝固后，放置在規(guī)定的培養(yǎng)條件下(3035，48h82h)培養(yǎng)，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。 校正因子=1/0.3825=2.61 編號(hào)平皿均數(shù)稀釋倍數(shù)瓊脂覆蓋總數(shù)回收率洗脫1洗脫2洗脫3洗脫4平皿1平皿2平均平皿1平皿2平均平皿1平皿2平均平皿1平皿2平均180010003001008220836.2326008002

35、0005160537.3837006002002002170241.13平均38.25校 正 因 子 計(jì) 算校 正 因 子 計(jì) 算 同批產(chǎn)品，需抽取3-5件，進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，確定最小、最大及平均回收率和初始污染菌數(shù)。 根據(jù)校正因子，滅菌前初始污染計(jì)數(shù)乘以校正因子即為產(chǎn)品帶菌總數(shù)。初始污染菌方法驗(yàn)證 檢驗(yàn)洗脫液有無(wú)抑菌作用 檢驗(yàn)樣品有無(wú)抑菌作用無(wú)菌洗脫液初始污染菌樣品100cfu菌種1.試驗(yàn)組3.樣品對(duì)照組初始污染菌方法驗(yàn)證（藥典）在3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)中: 洗脫液對(duì)照組(4)的菌回收率應(yīng)均不低于70%。（4/2）100 試驗(yàn)組(1)的菌回收率應(yīng)均不低于70% （1-3）/2100 2.菌液組4.

36、洗脫液對(duì)照組100cfu/ml菌種無(wú)菌洗脫液初始污染菌樣品無(wú)菌洗脫液100cfu菌種初始污染菌方法驗(yàn)證（ISO11737） 選用滅菌產(chǎn)品，如果洗脫技術(shù)中用到洗脫液，每一產(chǎn)品都應(yīng)經(jīng)受常規(guī)微生物洗脫技術(shù)，則將一定數(shù)量的易受破壞的微生物放人洗脫液中，回收微生物。 選用滅菌產(chǎn)品，如果產(chǎn)品直接放人培養(yǎng)基中，可以參照無(wú)菌實(shí)驗(yàn)的抑菌實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。 滅菌產(chǎn)品100cfu菌種常規(guī)洗脫回收細(xì)菌數(shù)100cfu/ml菌種1 實(shí)驗(yàn)組2 對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組回收細(xì)菌數(shù)/對(duì)照組菌數(shù)10070初始污染菌方法驗(yàn)證（ISO11737）微生物實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)前實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)后環(huán)境控制培養(yǎng)基質(zhì)量滅菌控制人員控制無(wú)菌操作方法驗(yàn)證靈敏度實(shí)驗(yàn)無(wú)菌檢查無(wú)菌實(shí)驗(yàn)初始污染菌B/F驗(yàn)證洗脫液驗(yàn)證樣品無(wú)抑菌作用儀器校正沉降菌檢測(cè)簡(jiǎn)化操作 物體表面細(xì)菌總數(shù)物體表面細(xì)菌總數(shù) 方法：將內(nèi)徑為5cm5cm的滅菌規(guī)格板，放在被檢物件體表面，根據(jù)