膜片鉗技術(shù)原理與基本操作

1、膜片鉗技術(shù)原理與根本操作1976 年 Neher 和 Sakmann 建立了膜片鉗技術(shù)( Patch clamp technique )， 這是一種以記錄通過離子通道的離子電流來反映細胞膜上單一的或多數(shù)的離子 通道分子活動的技術(shù)。 1981 年 Hamill, Neher 等人又對膜片鉗實驗方法和電子 線路進行了改良， 形成了當今廣泛應(yīng)用的膜片鉗實驗技術(shù)。 該技術(shù)可應(yīng)用于許多 細胞系的研究， 也是目前唯一可記錄一個蛋白分子電活動的方法， 膜片鉗技術(shù)和 克隆技術(shù)并駕齊驅(qū)給生命科學研究帶來了巨大的前進動力， 這一偉大的奉獻， 使 Neher和Sakmann獲得1991年諾貝爾醫(yī)學與生理學獎。一、

2、膜片鉗技術(shù)的根本原理用一個尖端直徑在卩m的玻璃微電極接觸細胞膜外表，通過負壓吸引使電 極尖端與細胞膜之間形成千兆歐姆以上的阻抗封接， 此時電極尖端下的細胞膜小 區(qū)域(膜片， patch )與其周圍在電學上分隔，在此根底上固定(鉗制，Clamp)電位，對此膜片上的離子通道的離子電流進行監(jiān)測及記錄。根本的儀器設(shè)備有膜片鉗放大器、計算機、倒置顯微鏡、示波器、雙步電極 拉制器、三軸液壓顯微操縱器、屏蔽防震實驗臺、恒溫標本灌流槽、玻璃微電極 研磨器。膜片鉗放大器是離子單通道測定和全細胞記錄的關(guān)鍵設(shè)備， 具有高靈敏 度、高增益、低噪音及高輸入阻抗。 膜片鉗放大器是通過單根電極對細胞或膜片 進行鉗制的同時記

3、錄離子流經(jīng)通道所產(chǎn)生的電流。 膜片鉗放大器的核心局部是以 運算放大器和反應(yīng)電阻構(gòu)成的電流-電壓(I-V )轉(zhuǎn)換器，運算放大器作為電壓控 制器自動控制，使鉗制電位穩(wěn)定在一定的水平上。二、操作步驟1. 膜片鉗微電極制作(1) 玻璃毛細管的選擇： 有二種玻璃類型， 一是軟質(zhì)的蘇打玻璃， 另一是硬質(zhì)的 硼硅酸鹽玻璃。 軟質(zhì)玻璃在拉制和拋光成彈頭形尖端時錐度陡直， 可降低電極的 串聯(lián)電阻， 對膜片鉗的全細胞記錄模式很有利； 硬質(zhì)玻璃的噪聲低， 在單通道記 錄時多項選擇用。玻璃毛細管的直徑應(yīng)符合電極支架的規(guī)格，一般外部直徑在 。內(nèi) 徑1mm(2) 電極的拉制： 分二步拉制。 第一部是使玻璃管中間拉長成一窄

4、細狀， 第二次 拉制窄細部位斷成二根，其尖端直徑一般在15卩m充入電極內(nèi)液后電極電阻在 15MD為宜。調(diào)節(jié)第一步和第二步拉制時加熱線圈的電流強度，即可得到所需 要的電極尖端直徑。電極必須保持干凈，應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)拉制。(3) 涂硅酮樹酯： 記錄單通道電流時， 為了克服熱噪聲、 封接阻抗噪聲及電極浸 入溶液產(chǎn)生的浮游電容性噪聲，需要在電極尖頸部(距離微電極尖端50mr)i的表 面薄薄地涂一層硅酮樹酯( sylgard )，它具有疏水性、與玻璃交融密切、非導(dǎo)電 性的特性。 涂完硅酮樹酯的玻璃微電極須通過加熱的鎳鉻電阻線圈烘干變固， 以 防硅酮樹酯順著電極流向尖端而影響千兆封接。烘干后才能進行熱磨光。(4)

5、 熱磨光 (heat polish) ：一般在玻璃研磨器下對電極尖端進行熱磨光，磨光 后可使電極尖平滑并燒去過多的硅酮樹酯薄膜， 有利于千兆封接的形成。 目前大 多數(shù)實驗室在作全細胞模式記錄時， 不涂硅酮樹酯也不進行熱磨光， 也可形成很 好的千兆封接。(5) 電極液的充灌： 目前最常應(yīng)用的是用注射器反向充灌。 用細長的注射器針頭 或拉細的聚乙烯膠管從電極尾端插入到電極尖端， 再進行灌注。 灌注后電極尖端 有少許氣泡， 排除氣泡的方法是用左手拿住電極， 尖端向下， 用右手輕輕彈擊電 極，可見氣泡徐徐上升直至排除。 電極液不要充灌太滿， 能與探頭的銀絲接觸上 即可，溶液過多會浸入探頭支持架致使潮濕

6、而影響實驗記錄。2. 溶液的組成(1) 電極液：根據(jù)記錄的電流不同電極液的成分也不同。根本要求是等張的 KCI溶液， Ca2+ 濃度為 10100nmol (pCa 78) ，pH 值7。這里介紹一個在全細胞記 錄模式時，通過改變保持電位，能分別記錄到Na+、K+、 Ca2+ 電流的電極液成分(mmol/L) ：K Aspartic ，KCI ， KH2PO4 25 ， HEPES，EGTA，KOH，MgCl2 1， CaCb , ATPNa。用KOH調(diào)pH至。如果要記錄純的 N、X、Ca 電流，那么需 要使用相應(yīng)的工具藥。HEPES(N-2-hydroxyethyopiperazine-N-

7、2-ethanesulfonic acid，羥乙基哌嗪乙烷磺酸)(2) 細胞外液(浴槽液)：別離細胞和記錄電流時應(yīng)用。別離神經(jīng)細胞主要用人工腦脊液(artificial cerebrosp in al fluid solution , ACSF,成分(mmol/L)： NaCl 124， KCl ， NaH2PO4 ， MgSO4 ， CaCl2 2， NaHC3O26， glucose 10 。該液體 需要通以95%囪5%CQ混合氣體。如果用HEPES乍緩沖系，那么ACSF的成分如下( mmol/L)： NaCl 140， KCl ， MgCl2 1， CaCl2 1 ， glucose 2

8、5 ， HEPES 10。 上述溶液的配制均使用去離子水。3. 神經(jīng)細胞的別離 運用膜片鉗技術(shù)進行電生理學研究需要制備適宜的單個細胞作標本， 細胞制 備的好壞直接影響實驗的成功率。 膜片鉗實驗要求細胞標本具有呼吸活性、 耐鈣、 細胞膜完整、平滑、清潔度高的條件，以利于微電極與細胞膜進行高阻封接?；?性好的細胞在形成全細胞模式后可以保持活性很長時間， 足以保證實驗的順利進 行。因此制備好的細胞標本是膜片鉗實驗的關(guān)鍵第一步。七十年代以來， 出現(xiàn)了許多別離各類細胞的別離技術(shù)， 但是進行電生理學研 究尤其是膜片鉗實驗多應(yīng)用酶解別離細胞的方法。 我們實驗室曾別離過豚鼠心室 肌細胞、 大鼠肝臟細胞、 大鼠

9、腦皮層神經(jīng)細胞、 家兔肺動脈平滑肌細胞和人腦皮 層神經(jīng)細胞及人心房肌細胞。這里重點介紹大鼠腦皮層神經(jīng)細胞的別離技術(shù)。(1) 用30mg/kg戊巴比妥鈉ip麻醉后，斷頭開顱取出大腦半球放入冷的人工腦 脊液中，輕輕剝離腦膜和血管等纖維組織，然后取腦皮層在人工腦脊液中剪成 2mM 2mm的組織塊靜止1小時，并通以氧氣。(2) 將腦組織塊放入含有 protease 16unit/ml ( type X , sigma ) 和protease 2unit/ml ( type XW , sigma)的人工腦脊液中，在36C恒溫震蕩 (60次/min) 水浴中孵育 60 分鐘左右。(3) 將組織塊取出，反復(fù)

10、用人工腦脊液沖洗5次，以徹底去除消化酶，于室溫下 靜止60 分鐘并繼續(xù)通氧，實驗前將組織塊輕柔吹打后即可別離出單一的神經(jīng)細 胞供實驗使用。4. 千兆歐姆封接取一滴細胞液， 滴入浴槽中，用人工腦脊液進行灌流， 將浮游的死細胞沖走， 待細胞貼壁后即可進行封接吸引。通過PCLAMP軟件或電子刺激器，給予一個20mV 1050ms的矩形波刺激，當電極進入浴槽溶液時，記錄電流的直線變成與 矩形波電壓脈沖相對應(yīng)的矩形波曲線， 將電極尖輕輕壓在細胞膜外表， 此時電流 曲線的高度變低， 給電極以負壓吸引， 由于電極尖與細胞膜逐漸密接， 細胞膜與 電極間的電阻逐漸增加，電流曲線逐漸減小 直至變成一條直線，那么形

11、成了千兆歐姆封接。5記錄模式根據(jù)研究目的選擇記錄模式，主要有下面表達的前4種，后3種是依據(jù)前4種變 更而來的。(1)細胞貼附式(cell-attached或on-cell mode):千兆歐姆圭寸接后的狀態(tài)即為細胞貼附式模式， 是在細胞內(nèi)成分保持不變的情況下研究離子通道 的活動，進行單通道電流記錄。即使改變細胞外液對電極膜片也沒有影響。 膜內(nèi)面向外式(inside-outmode)：在細胞貼附式狀態(tài)下將電極向上提，電極尖端的膜片被撕下與細胞別離， 形成細胞膜內(nèi)面向外模式。 此時膜片內(nèi)面直接 接觸浴槽液， 灌流液成分的改變那么相當于細胞內(nèi)液的改變。 可進行單通道電流記 錄。此模式下細胞質(zhì)容易滲漏

12、 (washout) ，影響通道電流的變化，如 Ca2+ 通道的 run-down 現(xiàn)象。(3) 全細胞式 (whole-cell mode) 記錄： 在細胞貼附式狀態(tài)下增加負壓吸引或 者給予電壓脈沖刺激 (zapping) ，使電極尖端膜片在管口內(nèi)破裂， 即形成全細胞 記錄模式。 此時電極內(nèi)液與細胞內(nèi)液相通成為和細胞內(nèi)電極記錄同樣的狀態(tài)， 不 僅能記錄一個整體細胞產(chǎn)生的電活動， 并且通過電極進行膜電位固定， 也可記錄 到全細胞膜離子電流。這種方式可研究直徑小于 20卩m以下的小細胞的電活動； 也可在電流鉗制(current clamp)下測定細胞內(nèi)電位。目前將這種方法形成的全 細胞式記錄稱作

13、常規(guī)全細胞模式 (conventional whole-cellmode 或 hole cell mode) 。(4) 膜外面向外式 (outside-out mode) ：在全細胞模式狀態(tài)下將電極向上提， 使電極尖端的膜片與細胞別離后又粘合在一起， 此時膜內(nèi)面對電極內(nèi)液， 膜外接 觸的是灌流液。可在改變細胞外液的情況下記錄單通道電流。(5) 開放細胞貼附膜內(nèi)面向外式 (open cell-attached inside-out mode)： 在 細胞貼附式狀態(tài)下， 用機械方法將電極膜片以外的細胞膜破壞， 從這個破壞孔調(diào) 控細胞內(nèi)液并在細胞貼附式狀態(tài)下進行單通道電流記錄。 用這種方法時， 細胞

14、越 大，破壞孔越小，距電極膜片越遠，細胞因子的流出越慢。(6) 穿孔膜片式 (perforated patch mode)或緩慢全細胞式 (slow whole-cellmode):在全細胞式記錄時由于電極液與細胞內(nèi)液相通，胞內(nèi)可動小分子能從細 胞內(nèi)滲漏到電極液中。 為克服此缺點，可在膜片電極內(nèi)注入制霉菌素 (nystatin) 或二性霉素E (amphotericin 使電極膜片形成多數(shù)導(dǎo)電性小孔，進行全細胞膜 電流記錄，故被稱為穿孔膜片式或制霉菌素膜片式(ny stat in-patchmode)。又因胞質(zhì)滲漏極慢， 局部串聯(lián)阻抗較常規(guī)全細胞記錄模式高， 鉗制速度慢， 故也稱 為緩慢全細胞

15、式。(7) 穿孔囊泡膜外面向外式 (peforated vesicle outside-out mode)：在穿孔 膜片式根底上， 將電極向上提， 使電極尖端的膜片與細胞別離后又粘合在一起形 成一個膜囊泡。 如果條件很好， 在囊泡內(nèi)可保存細胞質(zhì)和線粒體等， 能在比擬接 近正常的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝的條件下進行單通道記錄。6. 細胞內(nèi)灌流方法：細胞內(nèi)灌流是在全細胞式狀態(tài)下利用電極內(nèi)灌流法形成的。電極內(nèi)灌流法 的裝置是由電極固定部、 灌流液槽、注入管、流出管、電極記錄用瓊脂橋所組成。 注入管是用直徑 mm 的塑料管經(jīng)加熱拉細制成， 使其尖端能插到接近電極的尖頂 部。灌流液槽注滿實驗用溶液，插入注入

16、管，當千兆封接形成后，由于負壓吸引 的作用電極內(nèi)液從流出管流入排液槽的同時，實驗用溶液由流入管注入到電極 內(nèi)，電極充滿實驗用溶液后關(guān)閉注入管， 完成了液體的交換。 這種方法應(yīng)用在“內(nèi) 面向外式時， 可同時改變細胞內(nèi)液和細胞外液的組成； 應(yīng)用在“全細胞式時 就形成了細胞內(nèi)灌流方法，直接改變了細胞內(nèi)液。7. 全細胞記錄模式離子通道電流記錄(1) 鈉通道電流 (INa) ： 灌流液即細胞外液同人工腦脊液液，也可參加 CoCl2 3 mmol/L或nif idipine 10 卩mol/L以阻斷鈣電流。電極液成分 (mmol/L) ： CsCI 150, EGTA 11, CaCl 2 1,MgCI

17、2 1, HEPES 10,用 CsOH調(diào) pH 至。電壓鉗制方案，通常設(shè)保持電位 (holding potential)為-80 mV,去極化電壓為-10+40mV,步階電壓10 mV去極化的保持時間(刺激脈沖寬度或鉗制時間)1040 ms當全細胞記錄方式形成后，利用上述電壓鉗制方案，即可記錄出INa。 根據(jù)實驗數(shù)據(jù)制作電流 - 電壓 (current-voltage, I-V) 關(guān)系曲線， 從中找到 Na+ 電流的激活電位、反轉(zhuǎn)電位和最大電流的電壓區(qū)域。(2) 鈣通道電流 (ICa) ：灌流液有兩種方案，一是人工腦脊液中參加TTX10卩mol/L ,另一是將人工腦脊液中的 NaCI換成 N

18、-methyl-D-glucamine 130卩 mol/L, pH 用 CsOH調(diào)至。電極液的組成(mmol/L) ： Aspartic acid 60, CsOH 60, MgCl2 4, HEPES 10, EGTA 10, Na 2ATP 3o 用 CsOH調(diào) pH 至。通常使用的電 壓鉗制方案是設(shè)保持電位為-40 mV去極化電壓為10110 mV步階電壓10 mV,鉗 制時間300 ms,此方案記錄的是L型CeT通道電流；但在此保持電位下記錄到的 Ca2+ 電流尚含有 Na+ 通道電流或尚有 T 型 Ca2+ 通道電流。記錄由于沒有特異 的 T 型 Ca2+ 通道阻滯劑，假設(shè)想獲得較

19、純潔的 L 型 Ca2+ 通道電流，將保持電位抬 高到 -30 mV 即可。記錄 T 型 Ca2+ 通道電流的電壓鉗制方案是設(shè)保持電位為 -80 mV仍以10 mV的步階電壓去極，去極化電壓為10170 mV應(yīng)用L型CsT通道 阻滯劑，如： nitrendipine 、nisodipine 、nifedipine 等，即可得到較純潔的 T 型 Ca2+ 通道電流。兩種方案得出的膜電流峰值，均可繪制 I-V 曲線。(3) 鉀通道電流： 神經(jīng)細胞上亦存在多種 K+ 通道，其研究也很復(fù)雜， 通常最直 觀最容易觀察和記錄得到的 K+ 通道電流不外乎幾種。這里僅就延遲整流通道、 內(nèi)向整流通道及瞬間外向電

20、流通道的電流記錄加以介紹。根本液體 灌流液的組成 (mmol/L) ： N-methyl-D-glucamine 135, KCl , CaCl , MgCl2 , HEPES 10, Glucose 。用 HCl 調(diào) pH 至。也可在灌流液中參加 TTX (10-6mol/L)和Cd L)，以阻斷Na+和CeT通道。電極溶液為通常的細胞內(nèi)液。 延遲外向整流電流 (delayed rectifier outward current, Ikr)：設(shè)保持電位為-80 mV,去極化電壓為-20+170 mV，步階電壓10 mV,鉗制時間可這在 100400 ms,時間間隔為23ms以上。有時可將保持

21、電位設(shè)在-30 mV或-40mV這樣不僅可以使T型CeT通道失活，記錄出Ikr，而且也可以同時記錄到 尾電流 (Itail) ，尾電流也是延遲外向整流電流的一種表現(xiàn)形式， 當鉗制方波從 +70 mV 或 +90 mV 復(fù)極到保持電位時，這個電流并不緊隨，而是延遲于復(fù)極的 鉗制方波，以指數(shù)衰減方式，逐漸回至電流基線?，F(xiàn)認為 Itail 和 Ikr 使用 同一通道。 Ikr 值的表示，通常是測定鉗制方波就要結(jié)束時的外向電流幅值；Itail 的測定是在鉗制初期上升的幅值。 內(nèi)向整流電流 (inward rectifier current, Ikir)： 在膜超極化時內(nèi)向整流通道開放，Q流入細胞內(nèi)，當

22、膜電位近于靜息電位或更正時，該通道趨于關(guān)閉。 一般情況下保持電位的設(shè)置與細胞的靜息電位相當，設(shè)在-80 mV在這個電位下，膜電位為“零， 保持電位是“零電流電位。 然后令鉗制電位從正于保持 電位的方向，向超極化方向復(fù)極，超極化可達 -140 mV至V - 160 mV,過度超極化可能會損傷細胞，步階電壓仍為 10 mV在神經(jīng)細胞， Ikir 于鉗制初期可表現(xiàn)出一個瞬間內(nèi)向電流， 很快衰減， 之后趨 于平衡，形成時間不依賴性或稱為持續(xù)性電流。 測量電流幅度是測瞬間電流峰值 和持續(xù)性電流峰值。分別繪制其 I-V 曲線，再做分析。 瞬間外向電流 (transient outward current,

23、 IA 或 Ito) ： 用于記錄 Ito 的 電壓鉗制方案與延遲整流電流的方案根本一樣，通常將保持電位設(shè)在-80 mV,但這種電壓鉗制方案在記錄到的 Ito 中，一定混有 Ikir 。目前可用兩種方法將 其分開。第一，設(shè)置兩個電壓鉗制方案，即：第一個方案中的保持電位為-80 mV鉗制電位為+50 mV或更高，時間為80100ms目的在于最大程度地記錄到Ito。第二，如用改變保持電位的方法仍 不能分開 Ito 和 Ikir ，那么可用某些阻斷劑 ( 如 E-4031、TEA 等) 阻斷 Ikir ，然 后利用方案一記錄 Ito 。然而，實際上要得到較純潔的 Ito 是相當不容易的， 這 其中包

24、括： 在某些細胞 Ito 和 Ikir 對膜電位的依賴性太接近， 以及到目前為止 尚未有十分特異的 Ikir 阻斷劑。由于 TEA 這類阻斷劑的特異性差， 所有應(yīng)用時要格外小心，應(yīng)使用特異性較好的阻斷劑。在K+ 通道的研究中，也可應(yīng)用斜坡 (ramp) 鉗制方案。其根本要點是膜電位斜坡除極的速度不要太快。通常將膜電位從-110 mV斜坡除極到+70 mV或更高，旨在使這一鉗制方案覆蓋整個生理電位活動范圍。在神經(jīng)細胞，斜坡鉗制所得到的K 電流包含幾種類型 K 通道電流，其中有 Ikr 、Ito 、Ikir 等，也就是記錄到 的應(yīng)是一條多類型的 K+ 電流組成的電流軌跡。 不同類型的 K+ 通道阻滯劑可以分 別阻斷這一電流軌跡的不同局部。實驗者可在上述原那么根底上設(shè)計適用于不同 K+ 通道研究的斜坡鉗制方案。8. 單通道電流記錄(1) 鈉通道電流 (INa) ： 用“細胞貼附式膜片時，細胞外液為人工腦脊液，電極液為無鈣的人工腦脊液 (Na + 140mmol/L) 保持電位與去極化電壓的設(shè)置同 全細胞記錄方式，施加50ms的去極化脈沖，可記錄到單通道INa。為便于觀察， 使通道開閉的速度變慢，實驗需在較低的溫度 (2224C)下進行。INa表現(xiàn)為內(nèi) 向(向下)的矩