流式細胞儀的應用

1、 參考文獻：參考文獻： 臨床流式細胞分析臨床流式細胞分析王建中主編王建中主編 流式細胞術與生物醫(yī)學左連富主編流式細胞術與生物醫(yī)學左連富主編 現(xiàn)代免疫學實驗技術周汝麟現(xiàn)代免疫學實驗技術周汝麟 沈關心沈關心 主編主編 思考題：思考題： 流式細胞儀的三大應用范圍流式細胞儀的三大應用范圍 1，流式細胞儀的免疫熒光檢測；，流式細胞儀的免疫熒光檢測； 2，流式細胞儀的細胞周期檢測；，流式細胞儀的細胞周期檢測； 3，流式細胞儀的細胞分選；，流式細胞儀的細胞分選； 聯(lián)系方式：聯(lián)系方式： 治道樓治道樓1003室室 54237572 孫淑惠孫淑惠流式細胞儀的應用流式細胞儀的應用名稱名稱:流式細胞術流式細胞術:(f

2、low cytometry)流式細胞儀流式細胞儀:(flow cytometer, FCM)熒 光 激 光 分 類 儀熒 光 激 光 分 類 儀 ( f l u o r e s c e n t activated cell sorter, FACS)機型機型 本教研室有兩臺流式細胞儀，都是本教研室有兩臺流式細胞儀，都是BD公公司司(BECTON-DICKINSON)生產(chǎn)的。生產(chǎn)的。 1.分析型流式細胞儀：分析型流式細胞儀：BD FACSCalibur 檢測標記細胞的百分比含量。檢測標記細胞的百分比含量。 同時檢測四色不同染色的細胞。同時檢測四色不同染色的細胞。 2.分選型流式細胞儀：分選型流式

3、細胞儀：BD FACSAria 無菌獲取陽性細胞，以進一步培養(yǎng)。無菌獲取陽性細胞，以進一步培養(yǎng)。 同時獲取四色不同染色的細胞。同時獲取四色不同染色的細胞。定義定義 流式細胞術是以高能量流式細胞術是以高能量激光激光照射高速流動狀態(tài)照射高速流動狀態(tài)下被熒光色素染色的下被熒光色素染色的單細胞單細胞或顆粒，測量其產(chǎn)或顆粒，測量其產(chǎn)生的散射光和發(fā)射生的散射光和發(fā)射熒光熒光的強度，從而對細胞的強度，從而對細胞（或微粒）進行定性或定量檢測的一種細胞分（或微粒）進行定性或定量檢測的一種細胞分析技術。由于流式細胞術可同時鑒別單個細胞析技術。由于流式細胞術可同時鑒別單個細胞上的多種抗原，而且在極短時間內(nèi)分析大量細

4、上的多種抗原，而且在極短時間內(nèi)分析大量細胞，因此在醫(yī)學基礎研究和臨床疾病的診斷、胞，因此在醫(yī)學基礎研究和臨床疾病的診斷、治療及發(fā)病機制研究中得到了廣泛應用。治療及發(fā)病機制研究中得到了廣泛應用。特點特點 1,1,各種組織細胞均可用于分析各種組織細胞均可用于分析, ,如血液、骨如血液、骨髓、體液中的細胞、培養(yǎng)細胞等，實體組織髓、體液中的細胞、培養(yǎng)細胞等，實體組織經(jīng)處理后制成單細胞懸液均能分析經(jīng)處理后制成單細胞懸液均能分析。 2,2,測量速度快，每分鐘能測量數(shù)千至數(shù)萬個測量速度快，每分鐘能測量數(shù)千至數(shù)萬個細胞。細胞。 3, ,可進行多參數(shù)的分析可進行多參數(shù)的分析, , 可可同時檢測同時檢測四種不四種

5、不同熒光染色的細胞。新一代的流式可同時檢同熒光染色的細胞。新一代的流式可同時檢測十多色的細胞。測十多色的細胞。 4 4, ,可將目的細胞無菌分選出來做進一步的培可將目的細胞無菌分選出來做進一步的培養(yǎng)。養(yǎng)。流式細胞儀的主要應用范圍 1，流式細胞儀的免疫熒光檢測；，流式細胞儀的免疫熒光檢測； 2，流式細胞儀的細胞周期檢測；，流式細胞儀的細胞周期檢測； 3，流式細胞儀的細胞分選；，流式細胞儀的細胞分選；（一）在免疫學中的應用（一）在免疫學中的應用-重要的免疫學實驗技術 抗原抗原(antigen，Ag)是指能刺激機體是指能刺激機體免疫系統(tǒng)誘導免疫應答并能與應答免疫系統(tǒng)誘導免疫應答并能與應答產(chǎn)生如產(chǎn)生如

6、抗體抗體或致敏淋巴細胞發(fā)生特或致敏淋巴細胞發(fā)生特異反應的物質。異反應的物質。 抗原多為相對分子質量在抗原多為相對分子質量在10,000以上以上的蛋白質和多糖大分子的蛋白質和多糖大分子.淋巴細胞免疫表型分析淋巴細胞免疫表型分析 根據(jù)淋巴細胞的功能及膜表面標記，根據(jù)淋巴細胞的功能及膜表面標記，主要分為主要分為T淋巴細胞、淋巴細胞、B淋巴細胞和淋巴細胞和NK細胞三個亞群，但三者在普通細胞三個亞群，但三者在普通光學顯微鏡下不能區(qū)分，血細胞分光學顯微鏡下不能區(qū)分，血細胞分析儀也無法鑒別，只有用流式細胞析儀也無法鑒別，只有用流式細胞儀結合單克隆抗體技術才能準確分儀結合單克隆抗體技術才能準確分類計數(shù)淋巴細胞

7、亞群。類計數(shù)淋巴細胞亞群。T細胞在胸腺內(nèi)的發(fā)育過程細胞在胸腺內(nèi)的發(fā)育過程 CD34+ CD2- CD4- CD8- TCR- CD2+ CD4- CD8- TCR- CD2+ CD3+ CD4- CD8- TCR+/- CD1+ CD2+ CD3+ CD4+ CD8+ TCR+/-CD2+ CD3+ CD4+ CD8- TCR+ CD2+ CD3+ CD4 - CD8+ TCR+經(jīng)常測定的淋巴細胞免疫標記包括：經(jīng)常測定的淋巴細胞免疫標記包括：T淋巴細胞淋巴細胞：CD3、CD4、CD8,T輔助細胞輔助細胞：CD3+CD4+,T抑制細胞抑制細胞：CD3+CD8+,B淋巴細胞：淋巴細胞：CD19、或

8、或CD20，NK細胞細胞：CD56、CD16，活化細胞：活化細胞：CD25、HLA-DR、 CD40L、CD71。流式檢測人外周血淋巴細胞亞群流式檢測人外周血淋巴細胞亞群的正常參考范圍的正常參考范圍CD3+70.012.0%CD3+CD4+CD8-40.09.0%CD3+CD4-CD8+30.08.0%CD3-CD56+(NK)12.08.0%CD19+8.03.0%CD4+/CD8+比值：比值：1.0-2.5R1File: Data.002Acquisition Date: 29-Jun-99QuadEvents% GatedCD19+17711.81CD19+CD3+20.13CD19-C

9、D3-40426.95CD3+91661.11File: 2005/7/14 Dong LN.026Acquisition Date: 30-Jan-04Gated Events: 86713Total Events: 100000QuadEvents% Gated% TotalUL3961545.6939.62UR8490.980.85LL1371215.8113.71LR3253737.5232.54File: 2005/2/28 319 Zhou.609Acquisition Date: 28-Feb-05Quad% Gated% TotalUL22.866.78UR1.550.46LL

10、18.315.43LR57.2816.99File: 2003/12/5 PBMC-2 Chen.004Acquisition Date: 05-Dec-03QuadEvents% GatedUL36711.07UR2056.18LL117035.28LR157447.47File: 2003/12/5 PBMC-2 Chen.003Acquisition Date: 05-Dec-03QuadEvents% GatedUL51619.25UR220.82LL127247.46LR87032.46R2File: 2005/2/28 348 Zhou.615Acquisition Date: 2

11、8-Feb-05Quad % Gated % TotalUL44.2310.76UR0.950.23LL3.950.96LR50.8812.381，原發(fā)性免疫缺陷?。海l(fā)性免疫缺陷?。篢淋巴細胞缺乏，或淋巴細胞缺乏，或B淋巴淋巴細胞缺乏或減少。細胞缺乏或減少。2，HIV感染與感染與AIDS：CD4+淋巴細胞的百分比和淋巴細胞的百分比和數(shù)量減低。數(shù)量減低。3，SARS： T淋巴細胞（淋巴細胞（CD3+細胞）絕對數(shù)減少細胞）絕對數(shù)減少最為顯著。最為顯著。4，自身免疫性疾?。海陨砻庖咝约膊。合到y(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕關系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕關節(jié)炎、自身免疫干炎等患者節(jié)炎、自身免疫干炎等患者CD4+/

12、CD8+細胞比值細胞比值異常。異常。5，造血干細胞移植后免疫重建：，造血干細胞移植后免疫重建：NK細胞首先開細胞首先開始升高，隨后始升高，隨后T淋巴細胞和淋巴細胞和B淋巴細胞開始恢復，淋巴細胞開始恢復，CD4+/CD8+細胞比值約在第二年才能逆轉（細胞比值約在第二年才能逆轉（1）。）。6，移植后免疫監(jiān)測：，移植后免疫監(jiān)測：動態(tài)監(jiān)測血液動態(tài)監(jiān)測血液CD2+、CD3+、CD25+表達的變化，當其持續(xù)增高時提示發(fā)生移表達的變化，當其持續(xù)增高時提示發(fā)生移植排斥反應；植排斥反應； CD4+/CD8+細胞比值持續(xù)減低表示細胞比值持續(xù)減低表示移植后感染，若比值移植后感染，若比值0.2時應停用免疫抑制劑，以時

13、應停用免疫抑制劑，以免繼發(fā)嚴重感染而導致移植失敗。免繼發(fā)嚴重感染而導致移植失敗。7，實體腫瘤療效觀察：，實體腫瘤療效觀察：惡性腫瘤患者治療前惡性腫瘤患者治療前CD3+細胞數(shù)量、細胞數(shù)量、CD4+/CD8+細胞比值常減低，化細胞比值常減低，化療或放療有效時則可逐漸恢復或達到正常水平。療或放療有效時則可逐漸恢復或達到正常水平。淋巴細胞免疫表型正常或治療后能恢復正常者預淋巴細胞免疫表型正?；蛑委熀竽芑謴驼Ｕ哳A后常較好。后常較好。（二）在血液學中的應用：（二）在血液學中的應用：概念：白細胞分化抗原概念：白細胞分化抗原(DC) CD (cluster of differentiation)指的是分化指

14、的是分化群或分化簇。在使用群或分化簇。在使用CD命名細胞膜表面命名細胞膜表面免疫標志的初期，他專職白細胞膜上的免疫標志的初期，他專職白細胞膜上的抗原或抗原識別的抗體，故又稱白細胞抗原或抗原識別的抗體，故又稱白細胞分化抗原。分化抗原。 目前目前“CD”代表的不僅僅是白細胞表面代表的不僅僅是白細胞表面抗原，還有紅細胞膜表面抗原、血小板抗原，還有紅細胞膜表面抗原、血小板表面抗原、髓系細胞表面抗原及其他組表面抗原、髓系細胞表面抗原及其他組織細胞表面或細胞內(nèi)的抗原等，研究方織細胞表面或細胞內(nèi)的抗原等，研究方法以流式細胞術檢測法為主。法以流式細胞術檢測法為主。2，白血病的免疫分型：，白血病的免疫分型：白血

15、病免疫學分型是利用單克隆抗體白血病免疫學分型是利用單克隆抗體(McAb) 檢測白血病細胞的細胞膜和細檢測白血病細胞的細胞膜和細胞漿抗原（胞漿抗原（CDCD）,分析其表現(xiàn)型分析其表現(xiàn)型,以了解被以了解被測白血病細胞所屬細胞系列（測白血病細胞所屬細胞系列（如髓系、紅如髓系、紅系、淋巴系等白血病系、淋巴系等白血病亞型）及其分化程度。亞型）及其分化程度。對白血病細胞抗原的分析研究有助于對白對白血病細胞抗原的分析研究有助于對白血病分型血病分型，為診斷和治療提供依據(jù)。為診斷和治療提供依據(jù)。 舉例：舉例：T系急性淋巴細胞白血病免疫系急性淋巴細胞白血病免疫表型特點（表型特點（T-ALL）：）：根據(jù)根據(jù)T淋巴細

16、胞在胸腺內(nèi)的成熟順序，將淋巴細胞在胸腺內(nèi)的成熟順序，將T-ALL分為早期、中期和晚期三類。早期分為早期、中期和晚期三類。早期T-ALL：表達表達CD7和和CD1a，CD4、CD8膜膜CD3均為陰性；中期均為陰性；中期T-ALL：除表達除表達CD7和和CD1a外，還表達外，還表達CD2、CD5，CD4/CD8同時表達，膜同時表達，膜CD3仍為陰性；晚期仍為陰性；晚期T-ALL：膜膜CD3為陽性，但丟掉為陽性，但丟掉CD1a，其他標志同其他標志同中期。通過檢測中期。通過檢測CD抗原來確定白血病分期。抗原來確定白血病分期。2 2，淋巴瘤免疫分型：，淋巴瘤免疫分型：淋巴瘤的免疫分型也是利用單克隆抗體淋

17、巴瘤的免疫分型也是利用單克隆抗體檢測淋巴瘤細胞的細胞膜和細胞漿抗原檢測淋巴瘤細胞的細胞膜和細胞漿抗原,分析其表現(xiàn)型分析其表現(xiàn)型,以了解被測淋巴瘤細胞所以了解被測淋巴瘤細胞所屬細胞系列及其分化程度。如屬細胞系列及其分化程度。如 B細胞細胞系淋巴瘤系淋巴瘤T/NK細胞系淋巴瘤淋巴細細胞系淋巴瘤淋巴細胞系以外的造血細胞腫瘤造血細胞以胞系以外的造血細胞腫瘤造血細胞以外的腫瘤等。外的腫瘤等。 3 3，殘留白血病檢測，殘留白血病檢測 ：是指白血病經(jīng)治療后獲得完全緩解后體是指白血病經(jīng)治療后獲得完全緩解后體內(nèi)殘留少量白血病細胞的狀態(tài)。而少量內(nèi)殘留少量白血病細胞的狀態(tài)。而少量的白血病細胞在形態(tài)學上難以辨認，因的

18、白血病細胞在形態(tài)學上難以辨認，因此，用流式細胞儀能夠準確、快速地檢此，用流式細胞儀能夠準確、快速地檢測殘存白血病細胞，指導治療。測殘存白血病細胞，指導治療。4 4，血小板功能分析，血小板功能分析 ：血小板質膜糖蛋白單克隆抗體血小板質膜糖蛋白單克隆抗體CD41(GPIIb/IIIa)、CD61(GPIIb/IIIa)、CD42b(GPIb)、CD41b(GPIIb)、血小血小板顆粒膜糖蛋白板顆粒膜糖蛋白CD62p、CD63的測定的測定可供分析血小板功能狀態(tài)，如可供分析血小板功能狀態(tài)，如CD62p、CD63正常血小板不表達，當血小板活化正常血小板不表達，當血小板活化時表達明顯增加，可用來測定活化血

19、小時表達明顯增加，可用來測定活化血小板板 5 5，造血干，造血干/祖細胞測定：祖細胞測定： 造血干造血干/祖祖細胞移植細胞移植已廣泛應用于治療血已廣泛應用于治療血液腫瘤、實體瘤、某些遺傳性疾病、免液腫瘤、實體瘤、某些遺傳性疾病、免疫缺陷病等。疫缺陷病等。CD34分子是造血干細胞的分子是造血干細胞的重要標志重要標志。造血干造血干/祖細胞存在于外周血祖細胞存在于外周血中，但濃度很低，需用生長因子動員，中，但濃度很低，需用生長因子動員，使使CD34+CD34+細胞達到一定水平，才能進行移細胞達到一定水平，才能進行移植。植。（三）細胞周期分析：（三）細胞周期分析：DNA的含量隨細胞周期的含量隨細胞周期

20、(G1，S，G2，M)的各的各個時期呈現(xiàn)出周期性的變化：個時期呈現(xiàn)出周期性的變化：G1期，是細胞期，是細胞RNA和蛋白質的合成期，即和蛋白質的合成期，即DNA合成前期合成前期,此此時細胞核內(nèi)時細胞核內(nèi)DNA含量保持二倍體；進入含量保持二倍體；進入S期后，期后，DNA開始合成，即開始合成，即DNA合成期合成期,細胞核內(nèi)細胞核內(nèi)DNA的含量介于二倍體至四倍體之間；細胞進入的含量介于二倍體至四倍體之間；細胞進入G2期，即細胞分裂前期，期，即細胞分裂前期，DNA含量為四倍體含量為四倍體,直直到進入到進入M期，即細胞分裂期期，即細胞分裂期,細胞分成兩個子細細胞分成兩個子細胞胞,M期結束進入下一個細胞周期

21、。期結束進入下一個細胞周期。G1期期:DNA的含量為二倍體的含量為二倍體S期期:DNA的含量為二倍體至四倍體混合的含量為二倍體至四倍體混合G2,M期期:DNA的含量為四倍體的含量為四倍體Channels (FL2-A-FL2-A)050100150200250ModFitLT V3.0(PMac)File analyzed: 2004/4/1 DNA Cai.007Date analyzed: 1-Apr-2004Model: 1Dn0A_DSFAnalysis type: Manual analysisDiploid: 100.00 % Dip G1: 74.15 % at 74.99 Di

22、p G2: 3.35 % at 152.63 Dip S: 22.50 % G2/G1: 2.04 %CV: 4.47Total S-Phase: 22.50 %Total B.A.D.: 2.11 % no aggsApoptosis: 8.56 % Mean: 40.67Debris: 11.80 %Aggregates: 0.00 %Modeled events: 9502All cycle events: 7663Cycle events per channel: 97RCS: 1.626DebrisApoptosisDip G1Dip G2Dip SCai Haibo (#7)FL2

23、-A-FL2-A0306090120R1Channels (FL2-A-FL2-A)050100150200250ModFitLT V3.0(PMac)File analyzed: 2004/1/2 Liu DNA.008Date analyzed: 2-Jan-2004Model: 1Dn0A_DSFAnalysis type: Manual analysisDiploid: 100.00 % Dip G1: 62.10 % at 75.40 Dip G2: 10.02 % at 152.08 Dip S: 27.88 % G2/G1: 2.02 %CV: 4.61Total S-Phase

24、: 27.88 %Total B.A.D.: 0.36 % no aggsApoptosis: 0.27 % Mean: 53.00Debris: 7.07 %Aggregates: 0.00 %Modeled events: 8862All cycle events: 8212Cycle events per channel: 106RCS: 4.232DebrisApoptosisDip G1Dip G2Dip SLiu Qiwei(#8)FL2-A-FL2-A0306090120R11, 細胞增殖周期各時相細胞數(shù)的比率細胞增殖周期各時相細胞數(shù)的比率: 在生物細胞核中，在生物細胞核中，DN

25、A含量并非恒定，含量并非恒定，隨細胞增殖周期時相不同而發(fā)生變化。隨細胞增殖周期時相不同而發(fā)生變化。因此，不同種類的細胞，其細胞各期因此，不同種類的細胞，其細胞各期（G0/1期期, S期期, G2/M期）百分比含量期）百分比含量是不同的。是不同的。 Channels (FL2-A-FL2-A)050100150200250ModFitLT V3.0(PMac)File analyzed: 2005/7/13 Fan.001Date analyzed: 13766912-13768812Model: 1Dn0A_DSFAnalysis type: Manual analysisDiploid: 1

26、00.00 % Dip G1: 87.10 % at 74.89 Dip G2: 12.33 % at 148.93 Dip S: 0.57 % G2/G1: 1.99 %CV: 4.84Total S-Phase: 0.57 %Total B.A.D.: 0.02 % no aggsApoptosis: % Mean: Debris: 0.46 %Aggregates: 0.00 %Modeled events: 9024All cycle events: 8982Cycle events per channel: 120RCS: 2.073DebrisDip G1Dip G2Dip SFL

27、2-A-FL2-A0306090120R1Channels (FL2-A-FL2-A)050100150200250ModFitLT V3.0(PMac)File analyzed: 2004/11/4 Yang.002Date analyzed: 4-Nov-2004Model: 1Dn0A_DSFAnalysis type: Manual analysisDiploid: 100.00 % Dip G1: 72.83 % at 72.39 Dip G2: 7.77 % at 146.60 Dip S: 19.40 % G2/G1: 2.03 %CV: 3.41Total S-Phase:

28、19.40 %Total B.A.D.: 0.08 % no aggsApoptosis: 0.03 % Mean: 37.89Debris: 1.28 %Aggregates: 0.00 %Modeled events: 9098All cycle events: 8979Cycle events per channel: 119RCS: 2.484DebrisApoptosisDip G1Dip G2Dip SFL2-A-FL2-A0306090120R12,細胞增殖動力學細胞增殖動力學:DNA含量隨細胞增殖周期各時含量隨細胞增殖周期各時相而相而 發(fā)生變化發(fā)生變化,通過測定單個細胞通過測定

29、單個細胞DNA含量含量,可計可計G0/G1, S, G2/M各增殖細胞周期所占的百分比各增殖細胞周期所占的百分比. 3,分化誘導治療分化誘導治療是腫瘤化學治療的一項重要方面是腫瘤化學治療的一項重要方面, 由于靜止期由于靜止期(G0)細胞對化療藥物不敏感細胞對化療藥物不敏感,而增殖期而增殖期(S, G2/M)對化療敏感性高對化療敏感性高,如果將靜止期細胞采用如果將靜止期細胞采用分化誘導治療法分化誘導治療法,使其大量進入增殖細胞群使其大量進入增殖細胞群,再用對再用對增殖細胞有殺傷作用的藥物增殖細胞有殺傷作用的藥物,就可以就可以 殺傷大量的瘤殺傷大量的瘤細胞細胞.應用流式細胞儀作細胞周期分析就可以觀

30、察應用流式細胞儀作細胞周期分析就可以觀察該種藥物的療效并作預后估計該種藥物的療效并作預后估計.Channels (FL2-A-FL2-A)050100150200250ModFitLT V3.0(PMac)File analyzed: 2003/12/15 Song.015Date analyzed: 15-Dec-2003Model: 1Dn0A_DSFAnalysis type: Manual analysisDiploid: 100.00 % Dip G1: 29.33 % at 74.41 Dip G2: 17.35 % at 146.95 Dip S: 53.32 % G2/G1:

31、1.97 %CV: 4.96Total S-Phase: 53.32 %Total B.A.D.: 0.39 % no aggsApoptosis: 0.00 % Mean: 37.92Debris: 9.75 %Aggregates: 0.00 %Modeled events: 4011All cycle events: 3620Cycle events per channel: 49RCS: 1.961DebrisApoptosisDip G1Dip G2Dip SSong Xiaodong(#15)FL2-A-FL2-A0306090120R1Channels (FL2-A-FL2-A)

32、050100150200250ModFitLT V3.0(PMac)File analyzed: 2003/12/25 Song.004Date analyzed: 25-Dec-2003Model: 1Dn0A_DSFAnalysis type: Manual analysisDiploid: 100.00 % Dip G1: 29.40 % at 77.95 Dip G2: 38.48 % at 149.24 Dip S: 32.13 % G2/G1: 1.91 %CV: 8.25Total S-Phase: 32.13 %Total B.A.D.: 1.75 % no aggsApopt

33、osis: 0.20 % Mean: 45.15Debris: 9.33 %Aggregates: 0.00 %Modeled events: 7630All cycle events: 6904Cycle events per channel: 95RCS: 3.962DebrisApoptosisDip G1Dip G2Dip SSong Xiaodong(#4)FL2-A-FL2-A0306090120R1Channels050100150200250Channels050100150200250(四四) 細胞凋亡檢測：細胞凋亡檢測：1，亞，亞G1峰檢測：峰檢測：凋亡細胞最突出的形態(tài)凋亡

34、細胞最突出的形態(tài)學特征是細胞核固縮、染色質濃集、細胞體學特征是細胞核固縮、染色質濃集、細胞體變圓皺縮而細胞膜保持完整，其中胞核變化變圓皺縮而細胞膜保持完整，其中胞核變化尤為突出。染色質濃集是由于凋亡細胞雙鏈尤為突出。染色質濃集是由于凋亡細胞雙鏈DNA發(fā)生裂解所致。發(fā)生裂解所致。DNA降解后，形成長降解后，形成長度為度為180-200bp的的DNA片段，稱凋亡小體。片段，稱凋亡小體。即在流式細胞檢測上可出現(xiàn)亞二倍體即在流式細胞檢測上可出現(xiàn)亞二倍體(G1)峰峰值。而常規(guī)壞死的值。而常規(guī)壞死的DNA分解是隨機的，分解是隨機的，DNA 片段大小不一，在流式細胞檢測上可片段大小不一，在流式細胞檢測上可出

35、現(xiàn)比亞二倍體出現(xiàn)比亞二倍體(G1)峰更小的細胞碎片峰。峰更小的細胞碎片峰。Channels (FL2-A-FL2-A)050100150200250ModFitLT V3.0(PMac)File analyzed: 2003/12/18 Wang.001Date analyzed: 18-Dec-2003Model: 1Dn0A_DSFAnalysis type: Manual analysisDiploid: 100.00 % Dip G1: 68.02 % at 80.51 Dip G2: 11.57 % at 157.26 Dip S: 20.40 % G2/G1: 1.95 %CV:

36、8.09Total S-Phase: 20.40 %Total B.A.D.: 0.42 % no aggsApoptosis: 8.76 % Mean: 43.50Debris: 3.55 %Aggregates: 0.00 %Modeled events: 9168All cycle events: 8068Cycle events per channel: 104RCS: 2.778DebrisApoptosisDip G1Dip G2Dip SFL2-A-FL2-A0306090120R1Channels (FL2-A-FL2-A)050100150200250ModFitLT V3.

37、0(PMac)File analyzed: 2004/4/1 DNA Cai.007Date analyzed: 1-Apr-2004Model: 1Dn0A_DSFAnalysis type: Manual analysisDiploid: 100.00 % Dip G1: 74.15 % at 74.99 Dip G2: 3.35 % at 152.63 Dip S: 22.50 % G2/G1: 2.04 %CV: 4.47Total S-Phase: 22.50 %Total B.A.D.: 2.11 % no aggsApoptosis: 8.56 % Mean: 40.67Debr

38、is: 11.80 %Aggregates: 0.00 %Modeled events: 9502All cycle events: 7663Cycle events per channel: 97RCS: 1.626DebrisApoptosisDip G1Dip G2Dip SCai Haibo (#7)FL2-A-FL2-A0306090120R1Channels (FL2-A-FL2-A)050100150200250ModFitLT V3.0(PMac)File analyzed: 2003/9/11 Chi DNA.004Date analyzed: 11-Sep-2003Mode

39、l: 1Dn0A_DSFAnalysis type: Manual analysisDiploid: 100.00 % Dip G1: 63.62 % at 75.01 Dip G2: 5.07 % at 160.16 Dip S: 31.30 % G2/G1: 2.14 %CV: 8.46Total S-Phase: 31.30 %Total B.A.D.: 16.89 % no aggsApoptosis: 16.68 % Mean: 38.65Debris: 40.63 %Aggregates: 0.00 %Modeled events: 9670All cycle events: 47

40、84Cycle events per channel: 56RCS: 1.631DebrisApoptosisDip G1Dip G2Dip SChi Zhanyou(TF)FL2-A-FL2-A0306090120R1Channels (FL2-A-FL2-A)050100150200250ModFitLT V3.0(PMac)File analyzed: 2003/12/22 Wang.001Date analyzed: 22-Dec-2003Model: 1Dn0A_DSFAnalysis type: Manual analysisDiploid: 100.00 % Dip G1: 63

41、.31 % at 77.68 Dip G2: 8.36 % at 152.27 Dip S: 28.33 % G2/G1: 1.96 %CV: 4.71Total S-Phase: 28.33 %Total B.A.D.: 1.81 % no aggsApoptosis: 7.67 % Mean: 40.85Debris: 5.41 %Aggregates: 0.00 %Modeled events: 9109All cycle events: 7956Cycle events per channel: 105RCS: 2.901DebrisApoptosisDip G1Dip G2Dip S

42、FL2-A-FL2-A0306090120R12，Annexin V/PI 雙染色法：雙染色法：當細胞發(fā)生凋亡時，當細胞發(fā)生凋亡時，PS（磷酯酰絲氨酸）磷酯酰絲氨酸）從細胞膜內(nèi)轉移到細胞膜外，使從細胞膜內(nèi)轉移到細胞膜外，使PS暴露暴露在細胞膜表面，在細胞膜表面， Annexin V具有易于結具有易于結合合PS的磷脂結合蛋白。因此，建立一種的磷脂結合蛋白。因此，建立一種用用Annexin V結合在細胞膜表面作為凋亡結合在細胞膜表面作為凋亡的指標并結合一種染料排除試驗以檢測的指標并結合一種染料排除試驗以檢測細胞膜的完整性的檢測方法。該法使用細胞膜的完整性的檢測方法。該法使用FITC標記標記Anne

43、xin V，同時結合使用同時結合使用PI拒染法。拒染法。File: 2005/11/30 Mou.007Acquisition Date: 30-Nov-05QuadEvents% Gated % Total X Geo MeanUL400.880.7243.30UR1643.622.95280.98LL312568.9456.157.68LR120426.5621.64276.07File: 2005/12/14 Shen.002Acquisition Date: 14-Dec-05QuadEvents% Gated % Total X Geo MeanUL8699.148.695.26UR

44、2522.652.5266.12LL782882.3078.284.94LR5625.915.6249.18File: 2005/7/13 Shen.001Acquisition Date: 30-Jan-04QuadEvents% Gated % Total X Geo MeanUL89010.578.904.11UR1972.341.9754.05LL584669.4558.464.55LR148417.6314.8448.58File: 2005/7/13 Shen.003Acquisition Date: 30-Jan-04QuadEvents% Gated % Total X Geo

45、 MeanUL7398.327.394.68UR2582.902.5845.94LL689077.5568.904.39LR99811.239.9845.78(五五)樹突狀細胞檢測樹突狀細胞檢測:樹突狀細胞樹突狀細胞(DC)是一類抗原呈遞細胞是一類抗原呈遞細胞（APC），），具有抗原遞呈功能，并參與具有抗原遞呈功能，并參與免疫調控功能。樹突狀細胞的分化發(fā)育免疫調控功能。樹突狀細胞的分化發(fā)育大致分為大致分為4個階段，既從髓系個階段，既從髓系DC前體到前體到未成熟期未成熟期DC、遷移期遷移期DC和成熟期和成熟期DC。CMRF-44，CMRF-56，CD83，CD25，共刺激分子共刺激分子(CD40

46、，CD80，CD86)，及及MHC II類分子等均為類分子等均為DC活化活化/成熟過程成熟過程中的標志物，可用流式細胞儀檢測。中的標志物，可用流式細胞儀檢測。 File: 2005/11/30 Wu.001Acquisition Date: 30-Nov-05QuadEvents% Gated % Total X Geo MeanUL190.050.0510.08UR1890.500.4636.87LL3698698.6689.993.59LR2960.790.7220.02ControlFile: 2005/12/5 Wu.007Acquisition Date: 05-Dec-05Quad

47、Events% Gated % Total X Geo MeanUL1850.440.376.60UR12452.972.49160.60LL2609662.3252.194.32LR1434534.2628.6943.87當你需要研究樹突狀細胞與免疫性疾當你需要研究樹突狀細胞與免疫性疾病的關系時，可以檢測成熟病的關系時，可以檢測成熟DC細胞細胞CD11c+細胞細胞，CD123+細胞在人體中所細胞在人體中所占的比例。占的比例。 它們增高，說明患者它們增高，說明患者DC呈呈遞抗原水平高于正常人。由于遞抗原水平高于正常人。由于CD11c+ DC是比是比CD123+DC更成熟的更成熟的DC，因此，因

48、此，病變局部的病變局部的CD123+細胞會比外周血中細胞會比外周血中CD123+細胞增高。說明病變局部的抗細胞增高。說明病變局部的抗原呈遞高于周圍組織。原呈遞高于周圍組織。LIN1：CD3、CD4、CD16、CD19、CD20、CD56。File: 2006/2/28 Shi.001Total Events: 50000GateEvents % Gated % TotalEvents excl. debris (R1)2887100.005.77lin 1 dim/-events (R2)2887100.005.77G32887100.005.77Basophils1796.200.36CD1

49、23+ DCs501.730.10G6571.970.11G72368.170.47File: 2006/2/28 Shi.001Total Events: 50000GateEvents % Gated % TotalEvents excl. debris (R1)45878100.0091.76lin 1 dim/-events (R2)28876.295.77G328876.295.77Basophils1790.390.36CD123+ DCs500.110.10G6570.120.11G72360.510.47R1R3R4R2LIN1：CD3、CD4、CD16、CD19、CD20、C

50、D56。File: 2006/2/28 Shi.002Total Events: 50000GateEvents % Gated % TotalEvents excl. debris (R1)3167100.006.33lin 1 dim/-events (R2)3167100.006.33G33167100.006.33Basophils611.930.12G52347.390.47CD11c+ DCs2347.390.47G737711.900.75File: 2006/2/28 Shi.002Total Events: 50000GateEvents % Gated % TotalEve

51、nts excl. debris (R1)43839100.0087.68lin 1 dim/-events (R2)31677.226.33G331677.226.33Basophils610.140.12G521064.804.21CD11c+ DCs2340.530.47G73770.860.75R1R2R5(六六)流式細胞儀的細胞因子檢測：流式細胞儀的細胞因子檢測： 細胞因子是由活化的免疫細胞和某些基質細胞分泌的細胞因子是由活化的免疫細胞和某些基質細胞分泌的,目前已多達目前已多達60余種余種, 細胞因子的檢測方法大致分分子細胞因子的檢測方法大致分分子生物學檢測法和免疫學檢測法生物學檢測

52、法和免疫學檢測法; 分子生物學檢測法包括多聚酶鏈反應分子生物學檢測法包括多聚酶鏈反應-PCR、原位雜原位雜交、交、Northern印跡試驗和斑點雜交等方法印跡試驗和斑點雜交等方法, 是測定是測定細細胞因子的基因胞因子的基因水平水平,包括包括DNA和和mRNA .但有時細胞雖但有時細胞雖然表達細胞因子的然表達細胞因子的基因基因, 并無分泌并無分泌細胞因子的細胞因子的功能功能. 免疫學檢測法包括酶聯(lián)免疫吸附檢測法免疫學檢測法包括酶聯(lián)免疫吸附檢測法-ELISA，酶酶聯(lián)免疫斑點法聯(lián)免疫斑點法-ELISPOT, 放射免疫檢測法放射免疫檢測法-RIA，流流式細胞儀檢測的細胞內(nèi)細胞因子和式細胞儀檢測的細胞內(nèi)

53、細胞因子和CBA（Cytometric Bead Array)等等.與與ELISA方法比較不同之處是可以確方法比較不同之處是可以確定分泌細胞因子的特異性細胞。定分泌細胞因子的特異性細胞。1,流式細胞儀的細胞內(nèi)細胞因子檢測：流式細胞儀的細胞內(nèi)細胞因子檢測：T淋巴細胞淋巴細胞(CD3+),T輔助細胞輔助細胞(CD3+CD4+),包括包括Th1,Th2.T抑制細胞抑制細胞 (CD3+CD8+),包括包括Tc1,Tc2.Th1細胞主要是細胞主要是CD4+細胞分泌細胞分泌IL-2、IL-12、IFN-g和和TNF-b/a等，主要介導細胞免疫應答。等，主要介導細胞免疫應答。Th2細胞主要是細胞主要是CD4

54、+細胞分泌細胞分泌IL-4、IL-5、IL-6和和IL-10等，等，主要介導體液免疫應答。主要介導體液免疫應答。Tc1細胞主要是細胞主要是CD8+細胞分泌細胞分泌IFN-g、 IL-2、IL-6和和IL-10等。等。Tc2細胞主要是細胞主要是CD8+細胞分泌細胞分泌IL-2、IL-4、IL-5、IL-6和和IL-10等。等。Th1:CD4+IFN-g +Tc1:CD8+IFN-g +Th2:CD4+IL-4+Tc2:CD8+IL-4+Acquisition Date: 19-O ct-05Q uadEvents% G atedUL210830.63UR2844.13LL407659.22LR4

55、156.03File: 2003/12/26 Hu.007Acquisition Date: 26-Dec-03Quad% Gated% TotalUL7.945.57UR3.952.77LL65.3345.82LR22.7815.98File: 2002/5/31 Mao(1).003Acquisition Date: 31-May-2QuadEvents% GatedUL259130.93UR2082.48LL534363.77LR2362.82File: 2002/5/31 Ma0 (1).002Acquisition Date: 31-May-2QuadEvents% GatedUL393144.63UR2552.90LL427848.57LR3443.91IFN-r FITCIFN-r FITCCD8 PECD4 PEFile: 2003/3/28 Liver Zhang.014Acquisition Date: 28-Mar-3Gated Events: 83726Total Events: 100000RegionEvents% Gated% TotalR3460.050.05R21753820.