流式細(xì)胞儀的應(yīng)用

1、 參考文獻(xiàn)：參考文獻(xiàn)： 臨床流式細(xì)胞分析臨床流式細(xì)胞分析王建中主編王建中主編 流式細(xì)胞術(shù)與生物醫(yī)學(xué)左連富主編流式細(xì)胞術(shù)與生物醫(yī)學(xué)左連富主編 現(xiàn)代免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)周汝麟現(xiàn)代免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)周汝麟 沈關(guān)心沈關(guān)心 主編主編 思考題：思考題： 流式細(xì)胞儀的三大應(yīng)用范圍流式細(xì)胞儀的三大應(yīng)用范圍 1，流式細(xì)胞儀的免疫熒光檢測；，流式細(xì)胞儀的免疫熒光檢測； 2，流式細(xì)胞儀的細(xì)胞周期檢測；，流式細(xì)胞儀的細(xì)胞周期檢測； 3，流式細(xì)胞儀的細(xì)胞分選；，流式細(xì)胞儀的細(xì)胞分選； 聯(lián)系方式：聯(lián)系方式： 治道樓治道樓1003室室 54237572 孫淑惠孫淑惠流式細(xì)胞儀的應(yīng)用流式細(xì)胞儀的應(yīng)用名稱名稱:流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù):(f

2、low cytometry)流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀:(flow cytometer, FCM)熒 光 激 光 分 類 儀熒 光 激 光 分 類 儀 ( f l u o r e s c e n t activated cell sorter, FACS)機(jī)型機(jī)型 本教研室有兩臺流式細(xì)胞儀，都是本教研室有兩臺流式細(xì)胞儀，都是BD公公司司(BECTON-DICKINSON)生產(chǎn)的。生產(chǎn)的。 1.分析型流式細(xì)胞儀：分析型流式細(xì)胞儀：BD FACSCalibur 檢測標(biāo)記細(xì)胞的百分比含量。檢測標(biāo)記細(xì)胞的百分比含量。 同時檢測四色不同染色的細(xì)胞。同時檢測四色不同染色的細(xì)胞。 2.分選型流式細(xì)胞儀：分選型流式

3、細(xì)胞儀：BD FACSAria 無菌獲取陽性細(xì)胞，以進(jìn)一步培養(yǎng)。無菌獲取陽性細(xì)胞，以進(jìn)一步培養(yǎng)。 同時獲取四色不同染色的細(xì)胞。同時獲取四色不同染色的細(xì)胞。定義定義 流式細(xì)胞術(shù)是以高能量流式細(xì)胞術(shù)是以高能量激光激光照射高速流動狀態(tài)照射高速流動狀態(tài)下被熒光色素染色的下被熒光色素染色的單細(xì)胞單細(xì)胞或顆粒，測量其產(chǎn)或顆粒，測量其產(chǎn)生的散射光和發(fā)射生的散射光和發(fā)射熒光熒光的強(qiáng)度，從而對細(xì)胞的強(qiáng)度，從而對細(xì)胞（或微粒）進(jìn)行定性或定量檢測的一種細(xì)胞分（或微粒）進(jìn)行定性或定量檢測的一種細(xì)胞分析技術(shù)。由于流式細(xì)胞術(shù)可同時鑒別單個細(xì)胞析技術(shù)。由于流式細(xì)胞術(shù)可同時鑒別單個細(xì)胞上的多種抗原，而且在極短時間內(nèi)分析大量細(xì)

4、上的多種抗原，而且在極短時間內(nèi)分析大量細(xì)胞，因此在醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究和臨床疾病的診斷、胞，因此在醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究和臨床疾病的診斷、治療及發(fā)病機(jī)制研究中得到了廣泛應(yīng)用。治療及發(fā)病機(jī)制研究中得到了廣泛應(yīng)用。特點(diǎn)特點(diǎn) 1,1,各種組織細(xì)胞均可用于分析各種組織細(xì)胞均可用于分析, ,如血液、骨如血液、骨髓、體液中的細(xì)胞、培養(yǎng)細(xì)胞等，實(shí)體組織髓、體液中的細(xì)胞、培養(yǎng)細(xì)胞等，實(shí)體組織經(jīng)處理后制成單細(xì)胞懸液均能分析經(jīng)處理后制成單細(xì)胞懸液均能分析。 2,2,測量速度快，每分鐘能測量數(shù)千至數(shù)萬個測量速度快，每分鐘能測量數(shù)千至數(shù)萬個細(xì)胞。細(xì)胞。 3, ,可進(jìn)行多參數(shù)的分析可進(jìn)行多參數(shù)的分析, , 可可同時檢測同時檢測四種不四種

5、不同熒光染色的細(xì)胞。新一代的流式可同時檢同熒光染色的細(xì)胞。新一代的流式可同時檢測十多色的細(xì)胞。測十多色的細(xì)胞。 4 4, ,可將目的細(xì)胞無菌分選出來做進(jìn)一步的培可將目的細(xì)胞無菌分選出來做進(jìn)一步的培養(yǎng)。養(yǎng)。流式細(xì)胞儀的主要應(yīng)用范圍 1，流式細(xì)胞儀的免疫熒光檢測；，流式細(xì)胞儀的免疫熒光檢測； 2，流式細(xì)胞儀的細(xì)胞周期檢測；，流式細(xì)胞儀的細(xì)胞周期檢測； 3，流式細(xì)胞儀的細(xì)胞分選；，流式細(xì)胞儀的細(xì)胞分選；（一）在免疫學(xué)中的應(yīng)用（一）在免疫學(xué)中的應(yīng)用-重要的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù) 抗原抗原(antigen，Ag)是指能刺激機(jī)體是指能刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答并能與應(yīng)答免疫系統(tǒng)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答并能與應(yīng)答產(chǎn)生如產(chǎn)生如

6、抗體抗體或致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特或致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異反應(yīng)的物質(zhì)。異反應(yīng)的物質(zhì)。 抗原多為相對分子質(zhì)量在抗原多為相對分子質(zhì)量在10,000以上以上的蛋白質(zhì)和多糖大分子的蛋白質(zhì)和多糖大分子.淋巴細(xì)胞免疫表型分析淋巴細(xì)胞免疫表型分析 根據(jù)淋巴細(xì)胞的功能及膜表面標(biāo)記，根據(jù)淋巴細(xì)胞的功能及膜表面標(biāo)記，主要分為主要分為T淋巴細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞三個亞群，但三者在普通細(xì)胞三個亞群，但三者在普通光學(xué)顯微鏡下不能區(qū)分，血細(xì)胞分光學(xué)顯微鏡下不能區(qū)分，血細(xì)胞分析儀也無法鑒別，只有用流式細(xì)胞析儀也無法鑒別，只有用流式細(xì)胞儀結(jié)合單克隆抗體技術(shù)才能準(zhǔn)確分儀結(jié)合單克隆抗體技術(shù)才能準(zhǔn)確分類計(jì)數(shù)淋巴細(xì)胞

7、亞群。類計(jì)數(shù)淋巴細(xì)胞亞群。T細(xì)胞在胸腺內(nèi)的發(fā)育過程細(xì)胞在胸腺內(nèi)的發(fā)育過程 CD34+ CD2- CD4- CD8- TCR- CD2+ CD4- CD8- TCR- CD2+ CD3+ CD4- CD8- TCR+/- CD1+ CD2+ CD3+ CD4+ CD8+ TCR+/-CD2+ CD3+ CD4+ CD8- TCR+ CD2+ CD3+ CD4 - CD8+ TCR+經(jīng)常測定的淋巴細(xì)胞免疫標(biāo)記包括：經(jīng)常測定的淋巴細(xì)胞免疫標(biāo)記包括：T淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞：CD3、CD4、CD8,T輔助細(xì)胞輔助細(xì)胞：CD3+CD4+,T抑制細(xì)胞抑制細(xì)胞：CD3+CD8+,B淋巴細(xì)胞：淋巴細(xì)胞：CD19、或

8、或CD20，NK細(xì)胞細(xì)胞：CD56、CD16，活化細(xì)胞：活化細(xì)胞：CD25、HLA-DR、 CD40L、CD71。流式檢測人外周血淋巴細(xì)胞亞群流式檢測人外周血淋巴細(xì)胞亞群的正常參考范圍的正常參考范圍CD3+70.012.0%CD3+CD4+CD8-40.09.0%CD3+CD4-CD8+30.08.0%CD3-CD56+(NK)12.08.0%CD19+8.03.0%CD4+/CD8+比值：比值：1.0-2.5R1File: Data.002Acquisition Date: 29-Jun-99QuadEvents% GatedCD19+17711.81CD19+CD3+20.13CD19-C

9、D3-40426.95CD3+91661.11File: 2005/7/14 Dong LN.026Acquisition Date: 30-Jan-04Gated Events: 86713Total Events: 100000QuadEvents% Gated% TotalUL3961545.6939.62UR8490.980.85LL1371215.8113.71LR3253737.5232.54File: 2005/2/28 319 Zhou.609Acquisition Date: 28-Feb-05Quad% Gated% TotalUL22.866.78UR1.550.46LL

10、18.315.43LR57.2816.99File: 2003/12/5 PBMC-2 Chen.004Acquisition Date: 05-Dec-03QuadEvents% GatedUL36711.07UR2056.18LL117035.28LR157447.47File: 2003/12/5 PBMC-2 Chen.003Acquisition Date: 05-Dec-03QuadEvents% GatedUL51619.25UR220.82LL127247.46LR87032.46R2File: 2005/2/28 348 Zhou.615Acquisition Date: 2

11、8-Feb-05Quad % Gated % TotalUL44.2310.76UR0.950.23LL3.950.96LR50.8812.381，原發(fā)性免疫缺陷?。?，原發(fā)性免疫缺陷病：T淋巴細(xì)胞缺乏，或淋巴細(xì)胞缺乏，或B淋巴淋巴細(xì)胞缺乏或減少。細(xì)胞缺乏或減少。2，HIV感染與感染與AIDS：CD4+淋巴細(xì)胞的百分比和淋巴細(xì)胞的百分比和數(shù)量減低。數(shù)量減低。3，SARS： T淋巴細(xì)胞（淋巴細(xì)胞（CD3+細(xì)胞）絕對數(shù)減少細(xì)胞）絕對數(shù)減少最為顯著。最為顯著。4，自身免疫性疾?。?，自身免疫性疾?。合到y(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、自身免疫干炎等患者節(jié)炎、自身免疫干炎等患者CD4+/

12、CD8+細(xì)胞比值細(xì)胞比值異常。異常。5，造血干細(xì)胞移植后免疫重建：，造血干細(xì)胞移植后免疫重建：NK細(xì)胞首先開細(xì)胞首先開始升高，隨后始升高，隨后T淋巴細(xì)胞和淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞開始恢復(fù)，淋巴細(xì)胞開始恢復(fù)，CD4+/CD8+細(xì)胞比值約在第二年才能逆轉(zhuǎn)（細(xì)胞比值約在第二年才能逆轉(zhuǎn)（1）。）。6，移植后免疫監(jiān)測：，移植后免疫監(jiān)測：動態(tài)監(jiān)測血液動態(tài)監(jiān)測血液CD2+、CD3+、CD25+表達(dá)的變化，當(dāng)其持續(xù)增高時提示發(fā)生移表達(dá)的變化，當(dāng)其持續(xù)增高時提示發(fā)生移植排斥反應(yīng)；植排斥反應(yīng)； CD4+/CD8+細(xì)胞比值持續(xù)減低表示細(xì)胞比值持續(xù)減低表示移植后感染，若比值移植后感染，若比值0.2時應(yīng)停用免疫抑制劑，以時

13、應(yīng)停用免疫抑制劑，以免繼發(fā)嚴(yán)重感染而導(dǎo)致移植失敗。免繼發(fā)嚴(yán)重感染而導(dǎo)致移植失敗。7，實(shí)體腫瘤療效觀察：，實(shí)體腫瘤療效觀察：惡性腫瘤患者治療前惡性腫瘤患者治療前CD3+細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞數(shù)量、CD4+/CD8+細(xì)胞比值常減低，化細(xì)胞比值常減低，化療或放療有效時則可逐漸恢復(fù)或達(dá)到正常水平。療或放療有效時則可逐漸恢復(fù)或達(dá)到正常水平。淋巴細(xì)胞免疫表型正?；蛑委熀竽芑謴?fù)正常者預(yù)淋巴細(xì)胞免疫表型正?；蛑委熀竽芑謴?fù)正常者預(yù)后常較好。后常較好。（二）在血液學(xué)中的應(yīng)用：（二）在血液學(xué)中的應(yīng)用：概念：白細(xì)胞分化抗原概念：白細(xì)胞分化抗原(DC) CD (cluster of differentiation)指的是分化指

14、的是分化群或分化簇。在使用群或分化簇。在使用CD命名細(xì)胞膜表面命名細(xì)胞膜表面免疫標(biāo)志的初期，他專職白細(xì)胞膜上的免疫標(biāo)志的初期，他專職白細(xì)胞膜上的抗原或抗原識別的抗體，故又稱白細(xì)胞抗原或抗原識別的抗體，故又稱白細(xì)胞分化抗原。分化抗原。 目前目前“CD”代表的不僅僅是白細(xì)胞表面代表的不僅僅是白細(xì)胞表面抗原，還有紅細(xì)胞膜表面抗原、血小板抗原，還有紅細(xì)胞膜表面抗原、血小板表面抗原、髓系細(xì)胞表面抗原及其他組表面抗原、髓系細(xì)胞表面抗原及其他組織細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)的抗原等，研究方織細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)的抗原等，研究方法以流式細(xì)胞術(shù)檢測法為主。法以流式細(xì)胞術(shù)檢測法為主。2，白血病的免疫分型：，白血病的免疫分型：白血

15、病免疫學(xué)分型是利用單克隆抗體白血病免疫學(xué)分型是利用單克隆抗體(McAb) 檢測白血病細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)檢測白血病細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞漿抗原（胞漿抗原（CDCD）,分析其表現(xiàn)型分析其表現(xiàn)型,以了解被以了解被測白血病細(xì)胞所屬細(xì)胞系列（測白血病細(xì)胞所屬細(xì)胞系列（如髓系、紅如髓系、紅系、淋巴系等白血病系、淋巴系等白血病亞型）及其分化程度。亞型）及其分化程度。對白血病細(xì)胞抗原的分析研究有助于對白對白血病細(xì)胞抗原的分析研究有助于對白血病分型血病分型，為診斷和治療提供依據(jù)。為診斷和治療提供依據(jù)。 舉例：舉例：T系急性淋巴細(xì)胞白血病免疫系急性淋巴細(xì)胞白血病免疫表型特點(diǎn)（表型特點(diǎn)（T-ALL）：）：根據(jù)根據(jù)T淋巴細(xì)

16、胞在胸腺內(nèi)的成熟順序，將淋巴細(xì)胞在胸腺內(nèi)的成熟順序，將T-ALL分為早期、中期和晚期三類。早期分為早期、中期和晚期三類。早期T-ALL：表達(dá)表達(dá)CD7和和CD1a，CD4、CD8膜膜CD3均為陰性；中期均為陰性；中期T-ALL：除表達(dá)除表達(dá)CD7和和CD1a外，還表達(dá)外，還表達(dá)CD2、CD5，CD4/CD8同時表達(dá)，膜同時表達(dá)，膜CD3仍為陰性；晚期仍為陰性；晚期T-ALL：膜膜CD3為陽性，但丟掉為陽性，但丟掉CD1a，其他標(biāo)志同其他標(biāo)志同中期。通過檢測中期。通過檢測CD抗原來確定白血病分期。抗原來確定白血病分期。2 2，淋巴瘤免疫分型：，淋巴瘤免疫分型：淋巴瘤的免疫分型也是利用單克隆抗體淋

17、巴瘤的免疫分型也是利用單克隆抗體檢測淋巴瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞漿抗原檢測淋巴瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞漿抗原,分析其表現(xiàn)型分析其表現(xiàn)型,以了解被測淋巴瘤細(xì)胞所以了解被測淋巴瘤細(xì)胞所屬細(xì)胞系列及其分化程度。如屬細(xì)胞系列及其分化程度。如 B細(xì)胞細(xì)胞系淋巴瘤系淋巴瘤T/NK細(xì)胞系淋巴瘤淋巴細(xì)細(xì)胞系淋巴瘤淋巴細(xì)胞系以外的造血細(xì)胞腫瘤造血細(xì)胞以胞系以外的造血細(xì)胞腫瘤造血細(xì)胞以外的腫瘤等。外的腫瘤等。 3 3，殘留白血病檢測，殘留白血病檢測 ：是指白血病經(jīng)治療后獲得完全緩解后體是指白血病經(jīng)治療后獲得完全緩解后體內(nèi)殘留少量白血病細(xì)胞的狀態(tài)。而少量內(nèi)殘留少量白血病細(xì)胞的狀態(tài)。而少量的白血病細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上難以辨認(rèn)，因的

18、白血病細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上難以辨認(rèn)，因此，用流式細(xì)胞儀能夠準(zhǔn)確、快速地檢此，用流式細(xì)胞儀能夠準(zhǔn)確、快速地檢測殘存白血病細(xì)胞，指導(dǎo)治療。測殘存白血病細(xì)胞，指導(dǎo)治療。4 4，血小板功能分析，血小板功能分析 ：血小板質(zhì)膜糖蛋白單克隆抗體血小板質(zhì)膜糖蛋白單克隆抗體CD41(GPIIb/IIIa)、CD61(GPIIb/IIIa)、CD42b(GPIb)、CD41b(GPIIb)、血小血小板顆粒膜糖蛋白板顆粒膜糖蛋白CD62p、CD63的測定的測定可供分析血小板功能狀態(tài)，如可供分析血小板功能狀態(tài)，如CD62p、CD63正常血小板不表達(dá)，當(dāng)血小板活化正常血小板不表達(dá)，當(dāng)血小板活化時表達(dá)明顯增加，可用來測定活化血

19、小時表達(dá)明顯增加，可用來測定活化血小板板 5 5，造血干，造血干/祖細(xì)胞測定：祖細(xì)胞測定： 造血干造血干/祖祖細(xì)胞移植細(xì)胞移植已廣泛應(yīng)用于治療血已廣泛應(yīng)用于治療血液腫瘤、實(shí)體瘤、某些遺傳性疾病、免液腫瘤、實(shí)體瘤、某些遺傳性疾病、免疫缺陷病等。疫缺陷病等。CD34分子是造血干細(xì)胞的分子是造血干細(xì)胞的重要標(biāo)志重要標(biāo)志。造血干造血干/祖細(xì)胞存在于外周血祖細(xì)胞存在于外周血中，但濃度很低，需用生長因子動員，中，但濃度很低，需用生長因子動員，使使CD34+CD34+細(xì)胞達(dá)到一定水平，才能進(jìn)行移細(xì)胞達(dá)到一定水平，才能進(jìn)行移植。植。（三）細(xì)胞周期分析：（三）細(xì)胞周期分析：DNA的含量隨細(xì)胞周期的含量隨細(xì)胞周期

20、(G1，S，G2，M)的各的各個時期呈現(xiàn)出周期性的變化：個時期呈現(xiàn)出周期性的變化：G1期，是細(xì)胞期，是細(xì)胞RNA和蛋白質(zhì)的合成期，即和蛋白質(zhì)的合成期，即DNA合成前期合成前期,此此時細(xì)胞核內(nèi)時細(xì)胞核內(nèi)DNA含量保持二倍體；進(jìn)入含量保持二倍體；進(jìn)入S期后，期后，DNA開始合成，即開始合成，即DNA合成期合成期,細(xì)胞核內(nèi)細(xì)胞核內(nèi)DNA的含量介于二倍體至四倍體之間；細(xì)胞進(jìn)入的含量介于二倍體至四倍體之間；細(xì)胞進(jìn)入G2期，即細(xì)胞分裂前期，期，即細(xì)胞分裂前期，DNA含量為四倍體含量為四倍體,直直到進(jìn)入到進(jìn)入M期，即細(xì)胞分裂期期，即細(xì)胞分裂期,細(xì)胞分成兩個子細(xì)細(xì)胞分成兩個子細(xì)胞胞,M期結(jié)束進(jìn)入下一個細(xì)胞周期

21、。期結(jié)束進(jìn)入下一個細(xì)胞周期。G1期期:DNA的含量為二倍體的含量為二倍體S期期:DNA的含量為二倍體至四倍體混合的含量為二倍體至四倍體混合G2,M期期:DNA的含量為四倍體的含量為四倍體Channels (FL2-A-FL2-A)050100150200250ModFitLT V3.0(PMac)File analyzed: 2004/4/1 DNA Cai.007Date analyzed: 1-Apr-2004Model: 1Dn0A_DSFAnalysis type: Manual analysisDiploid: 100.00 % Dip G1: 74.15 % at 74.99 Di

22、p G2: 3.35 % at 152.63 Dip S: 22.50 % G2/G1: 2.04 %CV: 4.47Total S-Phase: 22.50 %Total B.A.D.: 2.11 % no aggsApoptosis: 8.56 % Mean: 40.67Debris: 11.80 %Aggregates: 0.00 %Modeled events: 9502All cycle events: 7663Cycle events per channel: 97RCS: 1.626DebrisApoptosisDip G1Dip G2Dip SCai Haibo (#7)FL2

23、-A-FL2-A0306090120R1Channels (FL2-A-FL2-A)050100150200250ModFitLT V3.0(PMac)File analyzed: 2004/1/2 Liu DNA.008Date analyzed: 2-Jan-2004Model: 1Dn0A_DSFAnalysis type: Manual analysisDiploid: 100.00 % Dip G1: 62.10 % at 75.40 Dip G2: 10.02 % at 152.08 Dip S: 27.88 % G2/G1: 2.02 %CV: 4.61Total S-Phase

24、: 27.88 %Total B.A.D.: 0.36 % no aggsApoptosis: 0.27 % Mean: 53.00Debris: 7.07 %Aggregates: 0.00 %Modeled events: 8862All cycle events: 8212Cycle events per channel: 106RCS: 4.232DebrisApoptosisDip G1Dip G2Dip SLiu Qiwei(#8)FL2-A-FL2-A0306090120R11, 細(xì)胞增殖周期各時相細(xì)胞數(shù)的比率細(xì)胞增殖周期各時相細(xì)胞數(shù)的比率: 在生物細(xì)胞核中，在生物細(xì)胞核中，DN

25、A含量并非恒定，含量并非恒定，隨細(xì)胞增殖周期時相不同而發(fā)生變化。隨細(xì)胞增殖周期時相不同而發(fā)生變化。因此，不同種類的細(xì)胞，其細(xì)胞各期因此，不同種類的細(xì)胞，其細(xì)胞各期（G0/1期期, S期期, G2/M期）百分比含量期）百分比含量是不同的。是不同的。 Channels (FL2-A-FL2-A)050100150200250ModFitLT V3.0(PMac)File analyzed: 2005/7/13 Fan.001Date analyzed: 13766912-13768812Model: 1Dn0A_DSFAnalysis type: Manual analysisDiploid: 1

26、00.00 % Dip G1: 87.10 % at 74.89 Dip G2: 12.33 % at 148.93 Dip S: 0.57 % G2/G1: 1.99 %CV: 4.84Total S-Phase: 0.57 %Total B.A.D.: 0.02 % no aggsApoptosis: % Mean: Debris: 0.46 %Aggregates: 0.00 %Modeled events: 9024All cycle events: 8982Cycle events per channel: 120RCS: 2.073DebrisDip G1Dip G2Dip SFL

27、2-A-FL2-A0306090120R1Channels (FL2-A-FL2-A)050100150200250ModFitLT V3.0(PMac)File analyzed: 2004/11/4 Yang.002Date analyzed: 4-Nov-2004Model: 1Dn0A_DSFAnalysis type: Manual analysisDiploid: 100.00 % Dip G1: 72.83 % at 72.39 Dip G2: 7.77 % at 146.60 Dip S: 19.40 % G2/G1: 2.03 %CV: 3.41Total S-Phase:

28、19.40 %Total B.A.D.: 0.08 % no aggsApoptosis: 0.03 % Mean: 37.89Debris: 1.28 %Aggregates: 0.00 %Modeled events: 9098All cycle events: 8979Cycle events per channel: 119RCS: 2.484DebrisApoptosisDip G1Dip G2Dip SFL2-A-FL2-A0306090120R12,細(xì)胞增殖動力學(xué)細(xì)胞增殖動力學(xué):DNA含量隨細(xì)胞增殖周期各時含量隨細(xì)胞增殖周期各時相而相而 發(fā)生變化發(fā)生變化,通過測定單個細(xì)胞通過測定

29、單個細(xì)胞DNA含量含量,可計(jì)可計(jì)G0/G1, S, G2/M各增殖細(xì)胞周期所占的百分比各增殖細(xì)胞周期所占的百分比. 3,分化誘導(dǎo)治療分化誘導(dǎo)治療是腫瘤化學(xué)治療的一項(xiàng)重要方面是腫瘤化學(xué)治療的一項(xiàng)重要方面, 由于靜止期由于靜止期(G0)細(xì)胞對化療藥物不敏感細(xì)胞對化療藥物不敏感,而增殖期而增殖期(S, G2/M)對化療敏感性高對化療敏感性高,如果將靜止期細(xì)胞采用如果將靜止期細(xì)胞采用分化誘導(dǎo)治療法分化誘導(dǎo)治療法,使其大量進(jìn)入增殖細(xì)胞群使其大量進(jìn)入增殖細(xì)胞群,再用對再用對增殖細(xì)胞有殺傷作用的藥物增殖細(xì)胞有殺傷作用的藥物,就可以就可以 殺傷大量的瘤殺傷大量的瘤細(xì)胞細(xì)胞.應(yīng)用流式細(xì)胞儀作細(xì)胞周期分析就可以觀

30、察應(yīng)用流式細(xì)胞儀作細(xì)胞周期分析就可以觀察該種藥物的療效并作預(yù)后估計(jì)該種藥物的療效并作預(yù)后估計(jì).Channels (FL2-A-FL2-A)050100150200250ModFitLT V3.0(PMac)File analyzed: 2003/12/15 Song.015Date analyzed: 15-Dec-2003Model: 1Dn0A_DSFAnalysis type: Manual analysisDiploid: 100.00 % Dip G1: 29.33 % at 74.41 Dip G2: 17.35 % at 146.95 Dip S: 53.32 % G2/G1:

31、1.97 %CV: 4.96Total S-Phase: 53.32 %Total B.A.D.: 0.39 % no aggsApoptosis: 0.00 % Mean: 37.92Debris: 9.75 %Aggregates: 0.00 %Modeled events: 4011All cycle events: 3620Cycle events per channel: 49RCS: 1.961DebrisApoptosisDip G1Dip G2Dip SSong Xiaodong(#15)FL2-A-FL2-A0306090120R1Channels (FL2-A-FL2-A)

32、050100150200250ModFitLT V3.0(PMac)File analyzed: 2003/12/25 Song.004Date analyzed: 25-Dec-2003Model: 1Dn0A_DSFAnalysis type: Manual analysisDiploid: 100.00 % Dip G1: 29.40 % at 77.95 Dip G2: 38.48 % at 149.24 Dip S: 32.13 % G2/G1: 1.91 %CV: 8.25Total S-Phase: 32.13 %Total B.A.D.: 1.75 % no aggsApopt

33、osis: 0.20 % Mean: 45.15Debris: 9.33 %Aggregates: 0.00 %Modeled events: 7630All cycle events: 6904Cycle events per channel: 95RCS: 3.962DebrisApoptosisDip G1Dip G2Dip SSong Xiaodong(#4)FL2-A-FL2-A0306090120R1Channels050100150200250Channels050100150200250(四四) 細(xì)胞凋亡檢測：細(xì)胞凋亡檢測：1，亞，亞G1峰檢測：峰檢測：凋亡細(xì)胞最突出的形態(tài)凋亡

34、細(xì)胞最突出的形態(tài)學(xué)特征是細(xì)胞核固縮、染色質(zhì)濃集、細(xì)胞體學(xué)特征是細(xì)胞核固縮、染色質(zhì)濃集、細(xì)胞體變圓皺縮而細(xì)胞膜保持完整，其中胞核變化變圓皺縮而細(xì)胞膜保持完整，其中胞核變化尤為突出。染色質(zhì)濃集是由于凋亡細(xì)胞雙鏈尤為突出。染色質(zhì)濃集是由于凋亡細(xì)胞雙鏈DNA發(fā)生裂解所致。發(fā)生裂解所致。DNA降解后，形成長降解后，形成長度為度為180-200bp的的DNA片段，稱凋亡小體。片段，稱凋亡小體。即在流式細(xì)胞檢測上可出現(xiàn)亞二倍體即在流式細(xì)胞檢測上可出現(xiàn)亞二倍體(G1)峰峰值。而常規(guī)壞死的值。而常規(guī)壞死的DNA分解是隨機(jī)的，分解是隨機(jī)的，DNA 片段大小不一，在流式細(xì)胞檢測上可片段大小不一，在流式細(xì)胞檢測上可出

35、現(xiàn)比亞二倍體出現(xiàn)比亞二倍體(G1)峰更小的細(xì)胞碎片峰。峰更小的細(xì)胞碎片峰。Channels (FL2-A-FL2-A)050100150200250ModFitLT V3.0(PMac)File analyzed: 2003/12/18 Wang.001Date analyzed: 18-Dec-2003Model: 1Dn0A_DSFAnalysis type: Manual analysisDiploid: 100.00 % Dip G1: 68.02 % at 80.51 Dip G2: 11.57 % at 157.26 Dip S: 20.40 % G2/G1: 1.95 %CV:

36、8.09Total S-Phase: 20.40 %Total B.A.D.: 0.42 % no aggsApoptosis: 8.76 % Mean: 43.50Debris: 3.55 %Aggregates: 0.00 %Modeled events: 9168All cycle events: 8068Cycle events per channel: 104RCS: 2.778DebrisApoptosisDip G1Dip G2Dip SFL2-A-FL2-A0306090120R1Channels (FL2-A-FL2-A)050100150200250ModFitLT V3.

37、0(PMac)File analyzed: 2004/4/1 DNA Cai.007Date analyzed: 1-Apr-2004Model: 1Dn0A_DSFAnalysis type: Manual analysisDiploid: 100.00 % Dip G1: 74.15 % at 74.99 Dip G2: 3.35 % at 152.63 Dip S: 22.50 % G2/G1: 2.04 %CV: 4.47Total S-Phase: 22.50 %Total B.A.D.: 2.11 % no aggsApoptosis: 8.56 % Mean: 40.67Debr

38、is: 11.80 %Aggregates: 0.00 %Modeled events: 9502All cycle events: 7663Cycle events per channel: 97RCS: 1.626DebrisApoptosisDip G1Dip G2Dip SCai Haibo (#7)FL2-A-FL2-A0306090120R1Channels (FL2-A-FL2-A)050100150200250ModFitLT V3.0(PMac)File analyzed: 2003/9/11 Chi DNA.004Date analyzed: 11-Sep-2003Mode

39、l: 1Dn0A_DSFAnalysis type: Manual analysisDiploid: 100.00 % Dip G1: 63.62 % at 75.01 Dip G2: 5.07 % at 160.16 Dip S: 31.30 % G2/G1: 2.14 %CV: 8.46Total S-Phase: 31.30 %Total B.A.D.: 16.89 % no aggsApoptosis: 16.68 % Mean: 38.65Debris: 40.63 %Aggregates: 0.00 %Modeled events: 9670All cycle events: 47

40、84Cycle events per channel: 56RCS: 1.631DebrisApoptosisDip G1Dip G2Dip SChi Zhanyou(TF)FL2-A-FL2-A0306090120R1Channels (FL2-A-FL2-A)050100150200250ModFitLT V3.0(PMac)File analyzed: 2003/12/22 Wang.001Date analyzed: 22-Dec-2003Model: 1Dn0A_DSFAnalysis type: Manual analysisDiploid: 100.00 % Dip G1: 63

41、.31 % at 77.68 Dip G2: 8.36 % at 152.27 Dip S: 28.33 % G2/G1: 1.96 %CV: 4.71Total S-Phase: 28.33 %Total B.A.D.: 1.81 % no aggsApoptosis: 7.67 % Mean: 40.85Debris: 5.41 %Aggregates: 0.00 %Modeled events: 9109All cycle events: 7956Cycle events per channel: 105RCS: 2.901DebrisApoptosisDip G1Dip G2Dip S

42、FL2-A-FL2-A0306090120R12，Annexin V/PI 雙染色法：雙染色法：當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時，PS（磷酯酰絲氨酸）磷酯酰絲氨酸）從細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外，使從細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外，使PS暴露暴露在細(xì)胞膜表面，在細(xì)胞膜表面， Annexin V具有易于結(jié)具有易于結(jié)合合PS的磷脂結(jié)合蛋白。因此，建立一種的磷脂結(jié)合蛋白。因此，建立一種用用Annexin V結(jié)合在細(xì)胞膜表面作為凋亡結(jié)合在細(xì)胞膜表面作為凋亡的指標(biāo)并結(jié)合一種染料排除試驗(yàn)以檢測的指標(biāo)并結(jié)合一種染料排除試驗(yàn)以檢測細(xì)胞膜的完整性的檢測方法。該法使用細(xì)胞膜的完整性的檢測方法。該法使用FITC標(biāo)記標(biāo)記Anne

43、xin V，同時結(jié)合使用同時結(jié)合使用PI拒染法。拒染法。File: 2005/11/30 Mou.007Acquisition Date: 30-Nov-05QuadEvents% Gated % Total X Geo MeanUL400.880.7243.30UR1643.622.95280.98LL312568.9456.157.68LR120426.5621.64276.07File: 2005/12/14 Shen.002Acquisition Date: 14-Dec-05QuadEvents% Gated % Total X Geo MeanUL8699.148.695.26UR

44、2522.652.5266.12LL782882.3078.284.94LR5625.915.6249.18File: 2005/7/13 Shen.001Acquisition Date: 30-Jan-04QuadEvents% Gated % Total X Geo MeanUL89010.578.904.11UR1972.341.9754.05LL584669.4558.464.55LR148417.6314.8448.58File: 2005/7/13 Shen.003Acquisition Date: 30-Jan-04QuadEvents% Gated % Total X Geo

45、 MeanUL7398.327.394.68UR2582.902.5845.94LL689077.5568.904.39LR99811.239.9845.78(五五)樹突狀細(xì)胞檢測樹突狀細(xì)胞檢測:樹突狀細(xì)胞樹突狀細(xì)胞(DC)是一類抗原呈遞細(xì)胞是一類抗原呈遞細(xì)胞（APC），），具有抗原遞呈功能，并參與具有抗原遞呈功能，并參與免疫調(diào)控功能。樹突狀細(xì)胞的分化發(fā)育免疫調(diào)控功能。樹突狀細(xì)胞的分化發(fā)育大致分為大致分為4個階段，既從髓系個階段，既從髓系DC前體到前體到未成熟期未成熟期DC、遷移期遷移期DC和成熟期和成熟期DC。CMRF-44，CMRF-56，CD83，CD25，共刺激分子共刺激分子(CD40

46、，CD80，CD86)，及及MHC II類分子等均為類分子等均為DC活化活化/成熟過程成熟過程中的標(biāo)志物，可用流式細(xì)胞儀檢測。中的標(biāo)志物，可用流式細(xì)胞儀檢測。 File: 2005/11/30 Wu.001Acquisition Date: 30-Nov-05QuadEvents% Gated % Total X Geo MeanUL190.050.0510.08UR1890.500.4636.87LL3698698.6689.993.59LR2960.790.7220.02ControlFile: 2005/12/5 Wu.007Acquisition Date: 05-Dec-05Quad

47、Events% Gated % Total X Geo MeanUL1850.440.376.60UR12452.972.49160.60LL2609662.3252.194.32LR1434534.2628.6943.87當(dāng)你需要研究樹突狀細(xì)胞與免疫性疾當(dāng)你需要研究樹突狀細(xì)胞與免疫性疾病的關(guān)系時，可以檢測成熟病的關(guān)系時，可以檢測成熟DC細(xì)胞細(xì)胞CD11c+細(xì)胞細(xì)胞，CD123+細(xì)胞在人體中所細(xì)胞在人體中所占的比例。占的比例。 它們增高，說明患者它們增高，說明患者DC呈呈遞抗原水平高于正常人。由于遞抗原水平高于正常人。由于CD11c+ DC是比是比CD123+DC更成熟的更成熟的DC，因此，因

48、此，病變局部的病變局部的CD123+細(xì)胞會比外周血中細(xì)胞會比外周血中CD123+細(xì)胞增高。說明病變局部的抗細(xì)胞增高。說明病變局部的抗原呈遞高于周圍組織。原呈遞高于周圍組織。LIN1：CD3、CD4、CD16、CD19、CD20、CD56。File: 2006/2/28 Shi.001Total Events: 50000GateEvents % Gated % TotalEvents excl. debris (R1)2887100.005.77lin 1 dim/-events (R2)2887100.005.77G32887100.005.77Basophils1796.200.36CD1

49、23+ DCs501.730.10G6571.970.11G72368.170.47File: 2006/2/28 Shi.001Total Events: 50000GateEvents % Gated % TotalEvents excl. debris (R1)45878100.0091.76lin 1 dim/-events (R2)28876.295.77G328876.295.77Basophils1790.390.36CD123+ DCs500.110.10G6570.120.11G72360.510.47R1R3R4R2LIN1：CD3、CD4、CD16、CD19、CD20、C

50、D56。File: 2006/2/28 Shi.002Total Events: 50000GateEvents % Gated % TotalEvents excl. debris (R1)3167100.006.33lin 1 dim/-events (R2)3167100.006.33G33167100.006.33Basophils611.930.12G52347.390.47CD11c+ DCs2347.390.47G737711.900.75File: 2006/2/28 Shi.002Total Events: 50000GateEvents % Gated % TotalEve

51、nts excl. debris (R1)43839100.0087.68lin 1 dim/-events (R2)31677.226.33G331677.226.33Basophils610.140.12G521064.804.21CD11c+ DCs2340.530.47G73770.860.75R1R2R5(六六)流式細(xì)胞儀的細(xì)胞因子檢測：流式細(xì)胞儀的細(xì)胞因子檢測： 細(xì)胞因子是由活化的免疫細(xì)胞和某些基質(zhì)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子是由活化的免疫細(xì)胞和某些基質(zhì)細(xì)胞分泌的,目前已多達(dá)目前已多達(dá)60余種余種, 細(xì)胞因子的檢測方法大致分分子細(xì)胞因子的檢測方法大致分分子生物學(xué)檢測法和免疫學(xué)檢測法生物學(xué)檢測

52、法和免疫學(xué)檢測法; 分子生物學(xué)檢測法包括多聚酶鏈反應(yīng)分子生物學(xué)檢測法包括多聚酶鏈反應(yīng)-PCR、原位雜原位雜交、交、Northern印跡試驗(yàn)和斑點(diǎn)雜交等方法印跡試驗(yàn)和斑點(diǎn)雜交等方法, 是測定是測定細(xì)細(xì)胞因子的基因胞因子的基因水平水平,包括包括DNA和和mRNA .但有時細(xì)胞雖但有時細(xì)胞雖然表達(dá)細(xì)胞因子的然表達(dá)細(xì)胞因子的基因基因, 并無分泌并無分泌細(xì)胞因子的細(xì)胞因子的功能功能. 免疫學(xué)檢測法包括酶聯(lián)免疫吸附檢測法免疫學(xué)檢測法包括酶聯(lián)免疫吸附檢測法-ELISA，酶酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法聯(lián)免疫斑點(diǎn)法-ELISPOT, 放射免疫檢測法放射免疫檢測法-RIA，流流式細(xì)胞儀檢測的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子和式細(xì)胞儀檢測的細(xì)胞內(nèi)

53、細(xì)胞因子和CBA（Cytometric Bead Array)等等.與與ELISA方法比較不同之處是可以確方法比較不同之處是可以確定分泌細(xì)胞因子的特異性細(xì)胞。定分泌細(xì)胞因子的特異性細(xì)胞。1,流式細(xì)胞儀的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測：流式細(xì)胞儀的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測：T淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞(CD3+),T輔助細(xì)胞輔助細(xì)胞(CD3+CD4+),包括包括Th1,Th2.T抑制細(xì)胞抑制細(xì)胞 (CD3+CD8+),包括包括Tc1,Tc2.Th1細(xì)胞主要是細(xì)胞主要是CD4+細(xì)胞分泌細(xì)胞分泌IL-2、IL-12、IFN-g和和TNF-b/a等，主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答。等，主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答。Th2細(xì)胞主要是細(xì)胞主要是CD4

54、+細(xì)胞分泌細(xì)胞分泌IL-4、IL-5、IL-6和和IL-10等，等，主要介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答。主要介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答。Tc1細(xì)胞主要是細(xì)胞主要是CD8+細(xì)胞分泌細(xì)胞分泌IFN-g、 IL-2、IL-6和和IL-10等。等。Tc2細(xì)胞主要是細(xì)胞主要是CD8+細(xì)胞分泌細(xì)胞分泌IL-2、IL-4、IL-5、IL-6和和IL-10等。等。Th1:CD4+IFN-g +Tc1:CD8+IFN-g +Th2:CD4+IL-4+Tc2:CD8+IL-4+Acquisition Date: 19-O ct-05Q uadEvents% G atedUL210830.63UR2844.13LL407659.22LR4

55、156.03File: 2003/12/26 Hu.007Acquisition Date: 26-Dec-03Quad% Gated% TotalUL7.945.57UR3.952.77LL65.3345.82LR22.7815.98File: 2002/5/31 Mao(1).003Acquisition Date: 31-May-2QuadEvents% GatedUL259130.93UR2082.48LL534363.77LR2362.82File: 2002/5/31 Ma0 (1).002Acquisition Date: 31-May-2QuadEvents% GatedUL393144.63UR2552.90LL427848.57LR3443.91IFN-r FITCIFN-r FITCCD8 PECD4 PEFile: 2003/3/28 Liver Zhang.014Acquisition Date: 28-Mar-3Gated Events: 83726Total Events: 100000RegionEvents% Gated% TotalR3460.050.05R21753820.